悬浮培养诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞的研究

目的:利用不加任何诱导剂的悬浮培养法,体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞并检测其分化效率。方法:人胚胎干细胞克隆用200U/mL胶原酶Ⅳ,370C处理10min后,挑起克隆碎片转移到低黏附性培养皿中悬浮培养以形成EB(拟胚体),4d后将EB转移到基质胶处理过的6孔板中贴壁培养(1-3EBs/cm2),显微镜下观察记录出现跳动心肌细胞的时间和跳动频率,并计算跳动克隆百分比,24孔板一组,共记录4组96孔;免疫荧光染色检测心肌细胞特异标志物cTnT;膜片钳实验检测心肌细胞自发性动作电位;跳动心肌细胞经过24h缺氧刺激后,用凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡比例。结果:在悬浮培养14d左右开始出现大量的自发跳动心肌细胞,分化出现自发跳动心肌细胞的平均时间(13.9±0.9)d,百分比为20.8%,平均跳动频率为(63.8±5.6)次/min;跳动心肌细胞cTnT染色阳性;跳动心肌细胞检测到自发性动作电位;跳动心肌细胞缺氧24h的凋亡比例为(8.1±0.4)%。结论:不加诱导剂的悬浮培养可以诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,分化效率达到20.8%,分化时间14d左右。为进一步的干细胞移植治疗动物心肌梗死模型提供种子细胞。     

血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)向心肌细胞分化的诱导作用。方法采用悬滴培养法,分别以10、20、50 ng/ml的VEGF对iPSCs细胞进行诱导分化,自然分化作为阴性对照组,加入1%二甲亚砜诱导剂为阳性对照组,倒置显微镜下观察细胞生长情况,记录跳动的拟胚体出现的时间和数目,计算心肌细胞分化率,细胞免疫荧光检测心肌细胞cTnT的表达,RT-PCR检测心肌发育基因α-MHC和β-MHC mRNA的表达。结果与自然分化组相比,三个浓度组的VEGF均可提高iPSCs的心肌细胞分化率(P<0.05),浓度为20 ng/ml时,iPSCs的心肌细胞分化率最高;与二甲亚砜组相比无统计学差异(P>0.05)。分化的心肌细胞可自发搏动,同时表达心肌特异蛋白cTnT和调控心肌发育的基因α-MHC和β-MHC;VEGF可上调α-MHC和β-MHC的表达(P<0.05)。结论 VEGF可以促进诱导iPSCs向心肌细胞分化。     

维生素C明显提高小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的诱导效率

目的:将维生素C作为诱导剂,观察其对小鼠诱导多能干细胞(miPSC)分化为心肌细胞效率的影响,寻找一种更安全、更高效的诱导方法。方法:复苏miPSC,传代培养后,利用悬滴培养法使miPSC形成拟胚体(EBs),用含维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,对照组不添加诱导剂,记录两组拟胚体出现搏动的时间、数量,计算分化率,观察维生素C作为诱导剂,对miPSC分化为心肌细胞效率的影响。结果:在用含10~(-4)mmol/m L维生素C的分化培养基时,大概有62.5%的拟胚体出现搏动,而不加任何诱导剂组约有8.3%的拟胚体出现搏动。各组搏动拟胚体cTnT,a-actinin免疫染色阳性。结论:维生素C作为一种诱导剂,能显著提高miPSC分化为心肌细胞的效率,并且心肌特异性蛋白cTnT,a-actinin染色阳性,应用维生素C作为诱导剂,诱导miPSC向心肌细胞分化是一种非常理想的诱导方法。     

维生素C促进小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的:利用经典的悬滴培养法形成拟胚体(EBs),诱导小鼠胚胎干细胞(m ESCs)在体外分化为心肌细胞,观察维生素C作为诱导剂对m ESCs体外诱导分化为心肌细胞的影响,进而寻找一种高效、安全的诱导方法。方法:复苏m ESCs,传代培养后,利用悬滴法使m ESCs形成拟胚体,用含0.1mg/m L维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,以不添加任何诱导剂作为对照组,观察出现搏动拟胚体的时间,搏动拟胚体的数量,计算分化比率,统计搏动频率,并进行免疫荧光染色测定心肌肌钙蛋白T(c Tn T)的表达。结果:小鼠胚胎干细胞可自发分化为心肌细胞,但效率较低,0.1mg/m L的维生素C能明显提高m ESCs分化为心肌细胞的效率,约83.3%的EBs出现搏动,显著高于未添加任何诱导剂组,搏动频率为(81.2±7.8)次/分钟。两组搏动心肌细胞c Tn T免疫染色阳性。结论:维生素C能够显著提高m ESCs向心肌细胞分化效率,应用维生素C体外诱导m ESCs向心肌细胞分化是一种较为理想的体外诱导方式。     

心肌营养素-1诱导小鼠诱导性多能干细胞心肌细胞定向分化的实验研究

目的:观察心肌营养素-1(CT-1)对小鼠诱导性多能干细胞(miPSCs)心肌细胞定向分化的诱导作用。方法:实验分为对照组与CT-1处理组。miPSCs经悬滴法诱导形成拟胚体,第3天培养基中加入1μmol/ml CT-1(CT-1组),对照组采用普通培养基。于第4、7、10和14天,收取细胞样本,采用实时PCR检测心脏特异标志物基因的表达。用免疫荧光染色及流式细胞术检测干细胞标志物Oct4和心肌特异性分化标志物肌钙蛋白I(cTnI)的表达。用透射电镜观察心肌样细胞的超微结构。结果:CT-1组第10天,样本中心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)基因表达的水平为同期对照组的1.75倍,有显著性差异(P<0.05)。免疫荧光染色法检测显示,两组均有cTnI表达。流式细胞术鉴定的结果显示,对照组与CT-1组cTnI的阳性率分别为28.5%和56.4%,有显著性差异(P<0.05)。电镜观察显示,CT-1组肌原纤维及胞内线粒体明显增多,肌纤维排列规则,可见细胞间桥粒连接和缝隙连接。结论:CT-1可显著提高miPSC向心肌细胞定向分化的效率。     

生长分化因子-11促进小鼠诱导性多能干细胞向心肌细胞定向分化的研究

目的 明确生长分化因子（GDF）-11对小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）向心肌细胞定向分化的促进作用,为心肌再生的细胞生物学治疗提供种子细胞和实验依据。方法 常规培养小鼠miPSCs,分为对照组和GDF-11组。GDF-11组在普通分化培养基中加用10 ng/ml的GDF-11。悬滴法诱导培养形成拟胚体（EBs）,每日观察搏动拟胚体数目。采用实时荧光定量PCR检测多能干细胞标志物Oct-4、心脏中胚层标志物Flk-1、心脏祖细胞标志物Nkx2.5、和心肌特异性标志物cTnT的表达变化。用免疫荧光染色观察心肌结构蛋白cTnI的表达水平。结果 GDF-11组的Oct-4表达水平在诱导分化的第3、7天分别为同期对照组的（0.55±0.31）倍（P<0.01）和（0.41±0.57）倍（P<0.05）;诱导分化的第10天,GDF-11组的Flk-1和Nkx2.5表达相分别为对照组的（2.09±0.8）倍（P<0.05）和（2.47±0.22）倍（P<0.01）;cTnT的表达在分化后第10天和第14天分别为对照组的（1.81±0.19）倍（P<0.01）和（1.61±0.20）倍（P<0.01）;两组均出现了心肌样搏动细胞团,GDF-11组搏动EBs百分比要显著高于对照组（P<0.01）。免疫荧光染色显示,GDF-11组的cTnI阳性率要显著高于对照组（P<0.01）。结论 GDF-1能够显著促进miPSCs的心肌定向分化。     

P19-αMHC-EGFP干细胞株的构建及其向心肌细胞诱导分化的初步研究

目的 构建稳定携带心肌特异报告基因pαMHC-EGFP的P19细胞株并诱导其向心肌细胞分化.方法 应用脂质体转染法转染质粒pαMHC-EGFP到P19干细胞,通过G418筛选和有限稀释法得到稳定携带pαMHC-EGFP的细胞克隆P19-αMHC-EGFP.诱导P19-αMHC-EGFP向心肌细胞分化,在诱导的不同阶段观测其超微结构的变化,在诱导分化进程中监测"跳动"的发绿色荧光的心肌细胞出现.同时与未转染pαMHC-EGFP的P19细胞进行心肌细胞分化率及心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达量的对比.结果 电镜结果 提示在诱导的第10天,部分细胞出现心肌细胞样特征.P19-αMHC-EGFP在诱导分化的第7天出现发强绿色荧光并"跳动"的心肌细胞,同时与对照P19细胞在心肌细胞分化率及cTnI表达量上差异无统计学意义(P>0.05).结论 P19-αMHC-EGFP细胞株在分化为心肌细胞的同时具有强绿色荧光标记,其向心肌细胞分化的效率及cTnI的合成未受影响.这一特征有利于对分化成熟的心肌细胞进行识别和纯化,从而应用于心肌细胞替代治疗.     

诱导多能干细胞心肌分化策略的研究进展

诱导多能干细胞(iPSCs)是由多种体细胞重编程而获得的,具有与胚胎干细胞(ESCs)相似的特性,能自我更新、无限增殖和多向分化的特性。但目前iPSCs向心肌细胞自发分化的效率非常低。如何才能有效地诱导iPSCs向心肌细胞的定向分化,对深入认识心肌细胞发生和发育的机制及实现其在药物筛选和心血管疾病治疗中的作用均具有非常重要的意义。本文重点对近年来iPSCs向心肌细胞分化策略的研究进展进行综述。     

内脏内胚层样END-2细胞体外诱导鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的探讨内脏内胚层样END-2细胞体外诱导胚胎干细胞（embryon ic stem cells,ESCs）分化为心肌细胞的特征。方法用鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryon ic fibrob lasts,MEF）作为饲养层促进ESCs增殖并抑制其分化,先将ESCs悬浮培养形成23 d的拟胚体（embryoid bod ies,EBs）,再和END-2细胞共培养诱导向心肌细胞分化。实验分4组。第1,2组EBs分别和END-2细胞或END-2细胞条件培养液共培养;第3组EBs和表面铺有一层琼脂糖的END-2细胞共培养;第4组自然分化组为对照组。相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T（TnT）的表达;透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。结果各实验组均可见自发节律性收缩的拟胚体。随着培养的延长,自发节律性收缩的拟胚体数目也增加,均表达心肌细胞特异性蛋白TnT,以及观察到心肌样超微结构。在和END-2细胞直接接触的诱导条件下,分化的细胞形态较单一。结论END-2细胞通过分泌可溶性细胞因子可诱导ESCs向心肌细胞分化,直接接触在END-2细胞诱导作用中并不是必要的,但可诱导出较单一的细胞。     

5-氮胞苷体外诱导成人脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞的初步研究

目的:探索不同浓度5-氮胞苷(5-aza)在不同诱导时间下对成人脂肪间充质干细胞(ADMSCs)分化为心肌细胞的诱导作用,确定最佳诱导条件。方法:体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并进行传代培养,流式细胞仪鉴定细胞CD44、CD34的表达,用含不同浓度5-aza(3、5、10、15、20μmol／L)培养基分别诱导12小时、24小时、48小时、72小时,倒置相差显微镜下逐日观察细胞形态变化;于诱导后14、28天时免疫细胞化学染色鉴定心肌特异性肌钙蛋白I(cTn-I)的表达,分析细胞转化率。结果:分离培养的ADMSCs表达CD44,不表达CD34;5-aza诱导后14天时免疫细胞化学未见有心肌细胞特异性cTn- I表达,诱导28天细胞免疫细胞化学显示cTn-I表达阳性,以10μmol/L 5-aza诱导24小时为最佳体外诱导条件。结论:成人脂肪组织间充质干细胞可在体外5-aza诱导下向心肌细胞分化。     

Wnt3a对小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的影响

目的：观察Wnt3a信号对小鼠胚胎干细胞（embryonicstemcell,ESC）心肌细胞分化的影响。方法：用悬滴培养法促进ESCs形成拟胚体（embryoidbodies,EBs）。用免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达。在不同分化时间加入Wnt3a及Wnt信号通路抑制剂Dkk一1观察对搏动EBs百分率的影响。用RT—PCR检测Nk同源异型盒5（Nkx2．5）、锌指转录因子-4（GATA．4）、B．肌球蛋白重链（[~-MHC）及心房钠尿肽（ANP）基因表达水平的变化。用Westernblot检测cTnT表达水平的变化。将不加入Wnt3a,分化第0—5天及5～lO天加入Wnt3a的组分别命名为对照组,D0-5组及D5．10组。加入Dkk．1的组命名为Dkk．1组。结果：通过悬滴培养法形成的EBs能够出现自发性搏动并且有TnT表达。EBs形成过程中即分化第0—5天加入Wnt3a与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率,Nkx2．5、GATA4、B．MHC和ANP基因表达的水平,以及cTnT蛋白表达水平,而EBs形成后即分化第5—10天加入Wnt3a的结果相反。分化第5—10天加入Dkk．1与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平,并且在分化第0—5天分别加入Wnt3a及Dkk．1与单独加入Wnt3a及Dkk-1相比,搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平更高。结论：Wnt3a对ESCs向心肌细胞分化的调控呈时间依耐性,EBs形成过程中激活Wnt3a信号及EBs形成后阻断Wnt3a信号能够获得更多的心肌细胞。     

电针刺激联合骨髓间充质干细胞移植治疗对脑出血大鼠出血灶周边区基质金属蛋白酶9及血清白细胞介素2表达的影响

目的探讨电针刺激和骨髓间充质干细胞（BMSC）移植联合治疗对脑出血大鼠出血灶周边区基质金属蛋白酶9（MMP-9）及血清白细胞介素2（IL02）表达的影响。方法向成年SD大鼠右侧尾壳核注射肝素和胶原酶诱导脑出血模型,并于术后第3天向出血灶移植BMSC后施以电针刺激（Ea．BMSC组）,同时设置BMSC移植组（BMSC组）、电针刺激组（Ea组）和生理盐水注射组（NS组）作为对照。各组分别于治疗后1、3、5、7和14d收集血清和脑组织标本,采用免疫荧光法检测出血灶周边区MMP-9的表达变化,放射免疫法检测血清IL-2的含量。采用单因素方差分析中的LSD法进行统计分析。结果Ea—BMSC组的MMP-9表达在1～7d时低于NS组（t值分别为9．85、5．76、7．05、3．13,P均〈0．05）,在全部时间点均低于BMSC组（t值分别为8．91、11．68、11．20、10．11、2．76,P均〈0．05）,而在3—14d时则高于Ea组（t值分别为-3．38、-3．98、-5．66、-13．07,P均〈0．05）。Ea．BMSC组的血清IL-2含量在5d和7d时高于Ns组（t值分别为-4．15、-3．81,P均〈0．05）,在3d和5d时分别低于和高于BMSC组（t值分别为2．76、-3．69,P均〈0．05）,在3d和14d时分别高于和低于Ea组（t值分别为-2．90、5．64,P均〈0．05）。结论电针联合BMSC移植治疗可抑制因单纯BMSC移植治疗所引起的MMP-9表达增高,且较电针组和BMSC组更能使IL-2含量保持在较稳定的水平。     

椎动脉与基底动脉粥样硬化所致双侧脑干梗死形态及分布的对比研究

目的探讨椎动脉与基底动脉粥样硬化病变所致双侧脑干梗死患者梗死灶的形态以及分们的特点。方法回顾性分析25例椎动脉或基底动脉粥样硬化所致双侧脑干梗死患者的影像学资料,根据血管病变部位分为椎动脉病变组（17例）和基底动脉病变组（8例）,比较两组患者的梗死灶的形态以及分布情况。结果①17例椎动脉病变患者均存在双侧椎动脉闭塞或严重狭窄（狭窄率为70％～99％）,其中8例为双侧椎动脉闭塞,9例为一侧椎动脉闭塞合并对侧椎动脉重度狭窄,病变部位多位于颅内;基底动脉病变组8例患者中,基底动脉闭塞3例,狭窄5例,其中3例为重度狭窄,2例狭窄率为50％～69％。②椎动脉病变组和基底动脉病变组双侧脑干多发性小梗死灶（〈1cm）分别为15例（15／17）和3例（3／8）,P〈0．05;单个大梗死灶（≥1cm）累及双侧脑十分别为3例（3／17）和6例（6／8）,P〈0．05;合并小脑梗死分别为13例（13／17）和2例（2／8）,P〈0．05。,结论椎动脉与基底动脉粥样硬化病变所致双侧脑干梗死梗死灶的形态以及分布有所不同,前者双侧脑干多发小梗死灶较多见,后者累及双侧脑干的大梗死灶多见。     

缺血再灌注期间不同时相氟比洛芬酯处理对乳鼠心肌细胞钠电流的影响

目的：研究缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）期间不同时相（缺血时、缺血后再灌时）氟比洛芬酯处殚对乳鼠心肌细胞钠电流的影响。方法：实验分为四组：1组（对照组）为体外培养乳鼠心室肌细胞;Ⅱ组（I/R组）为相同的细胞,缺血3小时,再灌注1小时;III组（氟比洛芬酯缺血时处理组）在I/R缺血时相加入氟比洛芬哺（0.15μM）;IV组（氟比洛芬酯缺血后再灌注时处理组）在I/R再灌注时相加入氟比洛芬酯（0．15μM）。采用膜片钳全细胞模式分别记录并比较四组的钠电流。结果：和I组相比,II组存每一指令电压上都增大钠电流;在测试电压为-20mV的条件下,钠电流峰值电流密度从-375．47±70．31（pA/pF）增至-557．11±12786（pA/pF）（n=5,P〈f0.05）;稳态激活半激活电压（V1/2）分别为-4281±1．21mV和-3149±2．40mV（n=5,P〈005）;稳态欠活半激活电压（V1/2）分别为-7424±5．89mV和-68．70±6．26mV（n=5,P〈005）;通道失活后恢复T分别为2569±19．47ms和7．534±3．24ms（n=5,P〈0．05）。III、IV组钠电流峰值电流密度从-375．47±70．31（pA/pF）分别降至-208．80±121．44和-278．91±188．26（pA/pF）（n=5,P〈0．05）;通道稳念激活V1/2分别为-40．89±9．81mV和-39．49±3．70mV（n=5,P〉O05）;稳态失活V1/2分别为74．45±5．02mY和-75494±3．32mV（n=5,P〉0．05）;通道失活后恢复T分别为24．98±16．41ms和26．30±11．82ms（n=5,P〉005）。III、IV组之间各指标间的差异无统计学意义。结论：I/R处土型可以增大钠电流的峰值电流,并使电压电流曲线下移;减慢通道的时间依赖性激活,促进通道的电爪依赖性失活,失活后恢复变快。而在I/R缺血和再灌注两个时相使用氟比洛芬酯均能有效阻制钠通道的这螳改变。     

Ghrelin以非经典受体依赖性方式促进人胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的研究

目的 探讨Ghrelin对人胚胎干（hES）细胞定向分化为心肌细胞的影响. 方法 以不同浓度Ghrelin诱导hES细胞定向分化为心肌细胞,显微镜下计数搏动细胞团的比例,应用实时PCR检测心肌特异性标志物的表达.应用RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色检测分化细胞中生长激素促分泌物受体1α（GHSR1α）的表达,添加GHS-R1α拮抗剂[D-lys3]-GHRP-6,观察其对Ghrelin促分化作用的影响. 结果 与对照组比较,10-10、10-9及10-8 mol/L Ghrelin均可增加搏动细胞团的比例[搏动比例分别为（12.9±1.4）％％,（19.5±2.2）％及（13.5±3.1）％vs（10.3±2.2）％,P＜0.05].RT-PCR分析显示,Ghrelin可上调α-肌球蛋白重链（α-MHC）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）的表达[α-MHC：100％ vs （40.1±13.2）％,P＜0.001;cTnI：100％ vs （52.6±9.8）％,P＜0.001].RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色均显示GHS-R1α在不同阶段的分化细胞中表达,但酰基化和非酰基化Ghrelin的促分化作用相似,且添加GHS-R1α拮抗剂不能阻断Ghrelin的促分化作用. 结论 Ghrelin可促进hES细胞定向分化为心肌细胞,该作用可能由GHS-R1α以外的信号途径所介导.     

黄芩苷对衣霉素诱导的内质网应激性心肌细胞损伤的影响

目的:观察黄芩苷(BC)对衣霉素(Tm)诱导的心肌细胞内质网应激(ERS)损伤的作用。方法:原代新生SD大鼠心肌细胞培养,随机分为对照组、BC组、Tm组、Tm+BC组。用MTT比色法检测心肌细胞的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测心肌细胞损伤,原位缺口末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡,Western blot检测CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的水平。结果:①Tm能够损伤心肌细胞并呈现明显的时间依赖关系,各作用时间点心肌细胞的存活率差异显著(P0.05)。Tm可显著增加ERS的CHOP表达及细胞凋亡的水平。②相对与Tm组,50μmol/L的BC能够显著抑制Tm对心肌细胞的损伤,使心肌细胞存活率增加(P0.05)。同时,BC能够显著抑制Tm诱导的心肌ERS损伤,使CHOP表达及细胞凋亡的水平明显下调(P0.05)。结论:BC可通过抑制Tm诱导的心肌ERS及心肌细胞的凋亡,达到保护受损心肌细胞的作用。     

内质网应激PERK途径在高糖诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化中的作用

目的：研究高糖刺激SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）向成骨样细胞转分化中内质网应激蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）途径的作用。方法原代培养VSMCs,分为正常对照组（5mmol/L D-葡萄糖）,甘露醇组（5mmol/L D-葡萄糖＋25mmol/L甘露醇）,高糖组（30mmol/L D-葡萄糖）,高糖＋PERK-小干扰RNA（siRNA）转染组（30mmol/L D-葡萄糖＋PERK-siRNA转染）,高糖＋RNA干扰阴性对照组（30mmol/L D-葡萄糖＋乱序RNA转染）。分别作用48和72h。逆转录-聚合酶链反应及Western blot分别从信使RNA（mRNA）和蛋白质水平检测不同时间点内质网应激相关分子GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4的改变,以及成骨样细胞标志性分子核心转录因子（Cbfα-1）、骨钙素以及平滑肌细胞标志性分子α-SMA的改变情况。应用碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒检测ALP的活性。结果与正常对照组和甘露醇组比较,在mRNA水平,高糖组和高糖＋RNA干扰阴性对照组PERK和eIF2α表达升高（P＜0.05）,PERK-siRNA转染后其表达水平均降低（P＜0.05）,在蛋白质水平,PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α表达升高（P＜0.05）,PERK-siRNA干预后其表达均降低（P＜0.05）。高糖刺激VSMCs后ALP活性升高（P＜0.05）,PERK-siRNA转染后其表达均降低（P＜0.05）。结论内质网应激PERK途径在高糖诱导VSMCs由收缩表型向成骨样细胞表型转化中发挥作用,抑制PERK途径可以部分阻止这一转化过程。