用于PCR实验的毕赤酵母基因组DNA制备方法的比较

目的：比较4种用于PCR实验的毕赤酵母基因组DNA的制备方法，以寻求一种稳定、简便的DNA模板制备方法，用于毕赤酵母重组子的分析。方法：分别用玻璃珠法、煮沸法、煮—冻—煮法以及直接法制备毕赤酵母基因组DNA模板，在相同条件下进行PCR扩增并比较其差异。结果：煮—冻—煮法与玻璃珠法制备的模板进行PCR均可取得理想的实验结果。以煮沸法制备模板作PCR时结果受所用模板浓度的影内很大，稳定性较差。直接法(即直接用未经处理的菌体作模板)的PCR结果随机性较大，实验结果最不理想。结论：煮—冻—煮法所需时间少、费用低、操作简便而且结果稳定，是采用毕赤酵母表达系统进行PCR鉴定时制备模板DNA的首选方法。     

毕赤酵母重组子PCR模板制备方法的比较

目的比较5种用于PCR实验的毕赤酵母(Pichia pastoris)重组子基因组DNA的制备方法,以寻求一种稳定、可靠、简便的DNA模板制备方法,用于毕赤酵母重组子的分析。方法分别用酵母基因组提取试剂盒法、蜗牛酶法、煮沸法、煮-冻-煮法、微波法制备重组毕赤酵母基因组DNA模板,在相同条件下进行PCR扩增并比较其差异。结果以5种方法制备的重组酵母DNA作为模板进行PCR,其结果均可达到鉴定酵母重组子的效果,其中酵母基因组提取试剂盒法和微波法可以鉴定酵母重组子的基因表型。结论微波法所需时间短、费用低、操作简便而且结果稳定,并能够鉴定酵母重组子的基因表型,是采用毕赤酵母表达系统进行PCR鉴定时制备模板DNA的首选方法。     

产生芳香环聚酮类天然产物放线菌的分子筛选研究

目的建立一套简便、快速、高效的芳香环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系，为聚酮类药物筛选搭建一个新的技术平台；认识PKS—Ⅱ基因在不同环境放线菌群中的分布规律，为新药筛选中微生物资源的定向分离提供依据。方法通过对芳香环聚酮类化合物生物合成途径所用的Ⅱ型聚酮合酶氨基酸和核苷酸序列的同源性比较分析，设计一对简并引物且以微波炉法提取的基因组DNA为模板扩增KS／CLF功能域约0．8kb目的基因片段，依据放线菌基因组中Ⅱ型PKS合酶基因的存在与否标定可能的芳香环聚酮类天然产物产生菌。结果利用建立的芳香环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系对99株嗜碱放线菌、100株链霉菌、47株嗜盐放线菌和776株一般放线菌进行了筛选，研究表明链霉菌、嗜碱放线菌、嗜盐放线菌和一般放线菌Ⅱ型聚酮合酶基因的阳性率分别为54％、29．3％、25．5％和24．1％。结论组合放线菌基因组DNA快速提取技术和PKSⅡ基因简并引物PCR扩增技术建立了快速、简便、高效的芳香环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系并对不同环境条件的放线菌菌群的PKSⅡ基因分布进行了研究。结果表明放线菌PKSⅡ聚酮合酶分布具有广泛性；而且同时表明链霉菌是芳香环聚酮类化合物的最丰富来源；在极端环境放线菌中，嗜盐放线菌的PKSⅡ基因在中度嗜盐放线菌分布的频率远高于嗜盐放线菌，嗜碱和中度嗜盐放线菌也是芳香环聚酮类化合物潜在的丰富资源。本研究为新药筛选中新的有效菌源的确定提供了可靠依据。     

浅谈聚合酶链反应在输血医学中的应用

聚合酶链反应简称——PCR技术.是近年来发展的一种体外高效扩增特异DNA或RNA序列的新技术.1985年由美国cetus公司创建以来,很快就成为分子生物学发展史上的又一里程碑.目前,我国仅有部分大、中型医院在开展此项工作.但由于技术操作工程较复杂,成本也较高.无法用于输血工作中对献血员的筛选.现就PCR技术在现代输血中的主要作用进行以下几方面的简述.1 聚合酶链反应技术1.1一般程序PCR技术与常规的分子生物技术在扩增靶DNA方面的比较,前者在方法上简便而快速.其一般程序包括:①模板DNA的提取.②引物的设计.③靶DNA的扩增.④扩增产物的分析判断.目前已有许多检测方法可用PCR扩增产物和测定.这些方法在灵敏度、特异型以及具体应用还是比较好     

荧光定量PCR检测重组人干扰素α2b中宿主基因组的残留DNA

目的 采用荧光定量PCR法检测注射用重组人干扰素α2b半成品中宿主基因组的残留DNA.方法 选择重组人干扰素α2b工程菌的宿主菌23S核糖体RNA基因为模板设计扩增引物,建立基于SYBR Green Ⅰ荧光染料的荧光定量PCR检测法.结果 宿主基因组DNA的量与荧光定量反应的Ct(循环阈值)值呈良好的线性关系(r~2=0.9803).结论 所用方法操作简便、快速,可用于重组人干扰素α2b制备过程中的质量监控及半成品的检定.     

冬虫夏草特异性PCR鉴定方法研究

目的建立一种准确、简便的方法鉴别冬虫夏草真伪。方法采用改良CTAB法从冬虫夏草样品中提取总DNA,根据r DNA中ITS1区序列设计一对特异性引物,对虫草样品进行特异性扩增。结果冬虫夏草标准品和部分市售虫草样品能扩增出255bp大小的目的片段,其余虫草样品未能扩增出相应条带。结论改良CTAB法提取DNA所需时间短对DNA分子破坏性小。特异PCR鉴别冬虫夏草真伪的方法准确快捷,对珍贵药材的甄别具有广阔的前景。     

微波法快速提取丝状真菌基因组DNA

丝状真菌基因组DNA的提取是一个费时、费力,并且费用较高的工作,效率较低。本文报道一种以微波热振破壁处理真菌菌丝,快速、简便和高效提取真菌基因组DNA的方法。以提取的DNA为模板可以扩增出18S rRNA基因。     

实时荧光定量PCR方法应用于药品无菌快速检测的研究

目的 建立应用实时荧光定量PCR进行无菌快速检测的方法。方法 选取金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌,用裂解试剂盒抽提细菌基因组DNA,进行实时荧光定量PCR检测,并应用叠氮溴化丙锭（PMA）抑制样品中死菌基因组DNA的PCR扩增。结果 PMA能有效去除样品中死菌干扰,针对16S rRNA基因保守序列进行扩增的荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度。在金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌检测中,最低含菌量组与阴性对照组Ct值有明显差异（P〈0.05）,其最低检出限为2 CFU/PCR。在对人工污染药品的无菌检测中,该方法与药典检测方法结果一致。结论 进行无菌检查时,采用PMA去除样品中死菌基因组DNA干扰,以裂解试剂盒抽提细菌基因组后用荧光定量PCR分析样品中细菌污染,可将检测时间缩短到4 h左右,操作简单,灵敏性高,可应用于药品无菌检查的快速筛查。     

三种全血基因组DNA提取方法的比较

目的比较高盐法、改良高盐法和超声波处理法三种方法对全血基因组DNA的提取效果。方法取200ul肝素抗凝血，分别采用上述三种方法提取基因组DNA，用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和含量。结果三种方法提取的基因组DNA含量分别为：高盐法38ug／ml全血；改良高盐法76．5ug／ml全血；超声波处理法20ug/ml全血；三种方法提取的基因组DNA纯度用A260／A280表示分别为：高盐法1．62；改良高盐法1．46；超声波处理法4．10。结论三种全血基因DNA提取方法操作简便、安全、快速，以改良高盐法提取效率最高。     

PCR技术在阴道念珠菌感染检测中的应用

目的 探讨聚合酶链式反应(PCR)在阴道念珠菌病检测中的应用.方法 取82例初步诊断患有阴道念珠菌病患者的阴道分泌物,接种于科玛嘉培养基上.采用PCR法进行念珠菌的检测；同时也用显色法和快速凝集法检测,比较检测结果.结果 PCR法阴道念珠菌阳性检出率为79.27％,显著高于显色法和快速凝集法的45.12％和48.78％(P＜0.05).通过对PCR过程进行优化,用菌液直接热裂解作DNA模板进行扩增和单菌落溶解于20μl的菌液PCR电泳均可检测出结果.结论 与显色法和快速凝集法比较,PCR方法检测阴道念珠菌的阳性检出率高,且方法简便、检测快捷.     

广西茅尾海红树林根围淤泥放线菌多样性及抗菌活性

目的 对广西茅尾海红树林保护区植物根部淤泥中的放线菌进行分离鉴别,研究放线菌的多样性和抗菌活性。方法 选用10种分离培养基,经稀释涂布法分离放线菌;通过PCR扩增,测序后获得菌株16S rRNA基因序列;邻接法构建系统发育树并进行同源性分析,探测放线菌的多样性;针对发酵液经乙酸乙酯萃取后的有机相、水相及菌丝丙酮浸泡液共3类样品,采用纸片扩散法开展抗菌活性研究。结果 从8份红树林植物根围淤泥样品中分离纯化得到244株放线菌,分布于5个目13个科29个属,优势菌属为链霉菌属和小单孢菌属;16S rRNA基因序列相似性低于98.65%的放线菌共有4株,可能为潜在新物种;抗菌活性筛选结果表明,83株放线菌的抗菌活性阳性率达71.1%。结论 广西茅尾海红树林保护区植物根围淤泥中抗菌活性放线菌的多样性丰富。     

广西沿海红树林土壤放线菌多样性、新颖性及抗菌活性研究

摘要：目的 研究广西3个主要红树林生态区土壤放线菌资源的多样性和新颖性,为研发微生物药物提供菌种资源储备。 方法 从广西茅尾海、北仑河口、山口红树林自然保护区采集27份土壤样品;采用稀释涂布法和8种分离培养基进行放线菌的 分离纯化;菌株纯化后,采用Chelex-100法提取基因组DNA;通过PCR扩增和测序,获得菌株16S rRNA基因序列,并提交到 EzBioCloud数据库中进行相似性搜索比对;构建基于16S rRNA基因序列的系统进化树,进行多样性和新颖性分析;潜在放线 菌新种经发酵离心后,上清液用乙酸乙酯萃取、浓缩,采用纸片扩散法进行抗菌活性检测。结果 分离出菌株246株,其中放 线菌181株,分布于6个目12个科19个属,菌株M2SK6-2、M2SK3-10、M5SK3-12和M1QZ16-11分别与最近有效种Streptomyces avicenniae DSM 41943T、Rhodococcus olei JCM 32205T、Agromyces kandeliae Q22T和Humibacillus xanthopallidus KV-663T的16S rRNA基因序列相似性最高,相似率分别为97.4%、97.7%、98.4%和98.4%,为潜在新种;4株潜在放线菌新种中,菌株M2SK6-2 对多种革兰阳性菌具有较强的抗菌活性。结论 广西沿海红树林放线菌资源丰富多样,新颖性高,具有从中发现放线菌新物种 和新次级代谢产物的潜力,值得深入研究。     

海南三亚红树林放线菌多样性及抗菌活性

目的 研究海南三亚红树林底泥样品中放线菌的多样性及抗菌活性,以期发现可以产生新颖活性物质的药用放线菌资源。方法 采用11种分离培养基以稀释涂布法对样品中的放线菌进行选择性分离;对分离菌株的16S rRNA基因序列进行扩增、比对,开展多样性分析;放线菌发酵液经乙酸乙酯萃取,采用纸片法对粗提物进行抗菌活性筛选;同时对放线菌的生物合成基因NRPS、PKS I和PKS II进行筛选。结果 共分离到149株放线菌,它们分布于6个目12个科16个属,其中小单孢菌属为优势菌属;菌株MG16072的16S rRNA基因序列与最近有效菌株Actinomadura hallensis H647-1T的相似率为97.94%,为潜在Actinomadura属新种;抗菌活性检测结果显示,有20株放线菌至少对1株检定菌具有抗菌活性;NRPS、PKS I、PKS II基因筛选结果显示,有82株放线菌至少含有1种生物合成基因。结论 海南三亚红树林含有丰富的药用放线菌资源,具有从中发现新颖活性物质的潜力。     

中药材龟甲的分子鉴定研究

用PCR产物直接测序法对中药材龟甲(板)进行鉴别。从乌龟 Chinemys revesii 和其他20种产地为中国或东南亚国家的龟类的组织材料中提取DNA,扩增约110bp的线粒体12SrRNA,基因片段并进行序列分析,构建了21种龟类的12SrRNA基因片段序列数据库。序列比较的结果表明乌龟与其它20种龟类的这段序列均有差别,序列差异在3.7～15.7%之间。从江苏省药品检验所提供的19块龟甲检品上各取样0.1～0.5g提取 DNA,扩增与上述相同的基因片段,与构建的数据库进行比较,结果表明19块龟甲中只有3块的原动物为乌龟,其余的龟甲均为混淆品。本文的结果为药材龟甲的鉴定找到了有效、可靠的分子遗传标记方法。     

发菜基因组DNA提取方法比较与分子鉴定研究

目的 以发菜为研究对象比较不同的提取DNA方法,筛选出了一种适合快速提取发菜DNA的方法。方法 分别利用自主研发的硅珠DNA纯化技术、细菌试DNA提取试剂盒和植物DNA提取试剂盒提取发菜基因组DNA。结果 本实验室开发的硅珠DNA提取纯化技术具有快速、无毒以及获得的发菜DNA纯度高等优势。通过PCR扩增和测序得到16S rRNA基因,利用Blast软件进行序列比对,与发菜同源性为99%。结论 本研究研制的发菜基因组DNA提取方法可用于发菜源性的分子鉴定。     

海马类药材的分子遗传标记鉴定研究

应用古DNA研究技术从5种海马药材中提取DNA,用PCR技术扩增约450bp的12SrRNA基因片段和约490 bp的细胞色素b基因片段。对扩增产物进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析和DNA序列分析。用RFLP分析方法可以鉴别2种海马,用DNA序列分析方法得到的分子遗传标记可以鉴别所有5种海马。对其它动物类药材的鉴定有一定参考价值。     

Long term effect of methylparathion contamination on soil microbial community diversity estimated by 16S rRNA gene cloning

The long-term effects of methylparathion contamination on the diversity of soil microbial community was investigated by a culture-independent approach using small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) gene-based cloning. Microbial DNA extracted from both the control soil sample and methylparathion contaminated soil sample was subjected to PCR amplification with primers specific for bacterial 16S rRNA gene sequences. From the PCR amplification product, clone libraries were constructed for both samples. Phylotypes were defined by performing a restriction fragment length polymorphism analysis of 16S rRNA gene sequences with the enzymes RsaI and HhaI. A total of 603 phylotypes were identified among the 16S ribosomal DNA (rDNA) clones, the phylotype richness, frequency distribution (evenness) of the two clone libraries were compared by using a variety of diversity indices. Phylogenetic analysis of the sequences of the dominant phylotypes revealed that the bacterial communities changed noticeably. In the control soil, the dominant bacterial groups included a member of a novel bacterial division, the bacillus genus, and a member of α-proteobacteria, while in methylparathion contaminated soil, the dominant phylotypes were replaced by a member of the flexibactera-cytophaga-bacteroides division and two members of the γ-proteobacteria subdivision. This is the first report of the long-term effects of methylparathion (one of the major pesticides widely used in developing countries) on soil microbial community diversity and structure by a culture-independent method, and provides the evidences to assess the long-term environmental toxicological effects of methylparathion from the microbial community viewpoint.     

中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究

目的:建立一种简便、实用的龟甲药材DNA 分子鉴定方法。方法:根据22 种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA 基因片段序列,设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物乌龟的鉴别引物,用该对引物扩增从乌龟和其他18 种龟共48 个样品的DNA 模板。结果:在72℃的复性温度下进行PCR,4 个乌龟的模板DNA 均得到约180 bp 的阳性扩增带,而其他各龟的模板DNA,在同样条件下无扩增产物,用这对鉴别引物经一次PCR 反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟。同法对江苏省药品检验所提供的17 块样品龟甲进行了鉴定,结果表明只有4 块样品为正品,其余皆为伪品,与性状鉴定和DNA序列分析鉴定结果完全一致。结论:所设计的鉴别引物对乌龟有高度特异性,所配制的龟甲药材鉴定试剂盒可在龟甲药材鉴定中使用。     

Sequence analysis of Chinese and Japanese Curcuma drugs on the 18S rRNA gene and trnK gene and the application of amplification-refractory mutation system analysis for their authentication

The botanical origins of Chinese and Japanese Curcuma drugs were determined to be Curcuma longa, C. phaeocaulis, the Japanese population of C. zedoaria, C. kwangsiensis, C. wenyujin, and C. aromatica based on a comparison of their 18S rRNA gene and trnK gene sequences with those of six Curcuma species reported previously. Moreover, to develop a more convenient identification method, amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of both gene regions was performed on plants. The ARMS method for the 18S rRNA gene was established using two types of forward primers designed based on the nucleotide difference at position 234. When DNAs of four Curcuma species were used as templates, PCR amplification with either of the two primers only generated a fragment of 912 base pairs (bp). However, when DNAs of the purple-cloud type of C. kwangsiensis and C. wenyujin were used, PCR amplifications with both primers unexpectedly generated the fragment, suggesting that these two were heterozygotes. The ARMS method for the trnK gene was also established using a mixture of four types of specific reverse primers designed on the basis of base substitutions and indels among six species, and common reverse and forward primers. C. phaeocaulis or the Chinese population of C. zedoaria, the Japanese population of C. zedoaria or the purple-cloud type of C. kwangsiensis, the pubescent type of C. kwangsiensis or C. wenyujin, and C. aromatica were found to show specific fragments of 730, 185, 527 or 528, and 641 or 642 bp, respectively. All species including C. longa also showed a common fragment of 897-904 bp. Using both ARMS methods, together with information on producing areas, the identification of Curcuma plants was achieved. Moreover, the ARMS method for the trnK gene was also useful for authentication of Curcuma drugs.     

地鼠多瘤病毒PCR检测方法的建立

目的  建立地鼠多瘤病毒（hamster polyomavirus, HaPyV）PCR检测方法,并应用于乙型脑炎减毒活疫苗生产过程中地鼠肾细胞的感染检测。方法  设计针对HaPyV衣壳蛋白VP1基因片段的特异引物,以含HaPyV VP1片段的质粒PMD19T-HaPyV688为模板进行PCR扩增并测序确认扩增产物。以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增并对扩增产物进行斑点杂交鉴定以验证PCR方法的特异性。将定量的质粒PMD19T-HaPyV688 10倍系列稀释后进行PCR敏感性检测。以小鼠多瘤病毒(murine polyomavirus, MuPyV)检验PCR法对质粒DNA和病毒DNA检测的一致性。应用建立的方法对生产用地鼠肾细胞悬液进行HaPyV DNA检测。结果  仅含有质粒PMD19T-HaPyV688和MuPyV DNA的样品能够扩增出600 bp的片段,经斑点杂交及测序证明其分别为HaPyV和MuPyV的VP1特异基因片段。PCR所能检出的PMD19T-HaPyV688和MuPyV 的最少DNA拷贝数分别为5300和590。7个亚批生产用地鼠肾细胞悬液的HaPyV检测结果均为阴性。结论  建立的PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于生产用地鼠肾细胞HaPyV感染的检测。