体外培养及冻存对大鼠胚胎神经干细胞生物学特性的影响

目的体外培养、冻存、移植大鼠胚胎神经干细胞（NSCs），观察细胞生物学特性有无改变。方法取孕15d的大鼠海马区细胞，体外培养；以20％牛血清白蛋白（BSA）加10％二甲基亚砜（DMSO）作冷冻保护剂，于液氮中冻存；复苏后计数活细胞数，免疫细胞化学鉴定其分化状态；移植入C6大鼠胶质瘤模型观察其存活情况。结果第1-4代NSCs复苏后神经干细胞存活率在40％-63％之间，差异无显著性意义。冻存复苏后的NSCs能够增殖、传代，移植入胶质瘤模型体内能够大量存活。结论大鼠胚胎NSCs能够在体外增殖、分化。并且冻存复苏不影响其生物学特点和细胞活性。     

大鼠胚胎神经干细胞的冷冻复苏

目的:建立大鼠胚胎神经干细胞冷冻复苏方法,探讨冻存后神经干细胞的活力及生物学特性.方法:采用10%BSA+7.5%DMSO作冷冻保护剂,于液氮中冻存;采用细胞培养和间接免疫荧光染色方法对冻存后细胞的活力、形态及分化能力作鉴定.结果:不同的冻存时间、细胞代数、组织来源以及神经营养因子对冻存后细胞存活率没有明显差异(P＞0.05).冷冻保存复苏后培养的大鼠胚胎神经干细胞能够存活,能在体外多次传代,并能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.结论:大鼠神经干细胞的冻存复苏并不影响其原有的生物学特性包括其正常的形态、增殖能力和多向分化能力.     

大鼠胚胎神经干细胞的冷冻复苏

目的：建立大鼠胚胎神经干细胞冷冻复苏方法，探讨冻存后神经干细胞的活力及生物学特性。方法：采用10％BSA＋7．5％DMSO作冷冻保护剂，于液氮中冻存；采用细胞培养和间接免疫荧光染色方法对冻存后细胞的活力，形态及分化能力作鉴定。结果：不同的冻存时间，细胞代数，组织来源以及神经营养因子对冻存后细胞存活率没有明显差异（P＞0．05）。冷冻保存复苏后培养的大鼠胚胎神经干细胞能够存活，能在体外多次传代，并能分化成神经元，星形胶质细胞细胞和少突胶质细胞。结论：大鼠神经干细胞的冻存复苏并不影响其原有的生物学特性包括其正常的，增殖能力和多向分化能力。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 原代培养．培养细胞生长状况观察用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）检测以作细胞鉴定。结果 成功培养出大鼠胚胎神经干细胞，了解其生长规律，并对其进行传代、冻存及复苏，培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论 大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏，并具有多向分化潜能。     

人小龄胚胎神经干细胞的分离培养、扩增及鉴定

目的 探索人胚胎神经干细胞的体外分离培养条件，从而在体外大量扩增神经干细胞；并观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎脑分离神经干细胞，部分细胞冻存，另一部分细胞进行体外培养。采用无血清培养液，加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激细胞增殖，进行体外扩增、传代培养。采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元及胶质细胞。结果 从人胚胎脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经干细胞球，这些神经干细胞球可在体外扩增及传代培养。免疫荧光法鉴定神经干细胞球中大部分为神经上皮干细胞蛋白(nestin)表达阳性细胞。贴壁后可以分化出神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性的细胞。经冻存后的胎脑细胞也能培养出具有同样特征的神经干细胞。结论 在含有EGF和bFGF的无血清培养液中，从人胚胎脑能分离培养出神经干细胞，并能在体外大量扩增。这为人类神经干细胞的进一步研究和应用提供了材料。     

大鼠胚胎神经干细胞的培养与鉴定

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点。方法取孕15d的大鼠,采用机械分离法获取海马区细胞,以106个细胞/m l的密度接种到无血清NSCs培养基中培养,分离纯化至第5代。以10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果取NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈小鼠抗巢蛋白(nestin)、小鼠抗微管蛋白(-βtubu lin)、豚鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及小鼠抗O4免疫化学反应阳性。结论大鼠胚胎脑海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。     

体外神经干细胞培养特性观察

目的 探讨神经干细胞(NSCs)体外分离培养和增殖的特性.方法 从新生24h内的SD大鼠脑组织分离NSCs,采用无血清悬浮培养法进行NSCs体外扩增培养.倒置相差显微镜观察细胞形态,通过绘制细胞生长曲线观察NSCs的自我更新和增殖能力,采用免疫细胞化学法检测NSCs标志物神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和2,3-环核甘酸磷酸二脂酶(CNP)的表达.结果 从新生SD大鼠脑组织分离的细胞在无血清的培养基中形成悬浮的神经球.神经球具有自我更新和表达Nestin的能力,分化后的细胞能表达神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞的特异性抗原.结论 从新生大鼠的脑组织中成功分离出NSCs,其具有在体外自我更新和增殖、多向分化潜能及表达Nestin的能力.     

胚胎大鼠嗅神经干细胞的培养及分化特性

目的建立胚胎大鼠嗅神经干细胞(NSCs)体外培养方法,研究其增殖和分化特性.方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养胚胎14 d(E14)大鼠嗅球NSCs,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSCs及自然分化为特异性神经细胞的类型,测定NSCs的生长曲线.结果从E14大鼠嗅球分离、培养出表达nestin,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSCs.嗅NSCs的增殖依赖表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF.结论从E14大鼠嗅球培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSCs.     

悬浮培养与贴壁培养方式神经干细胞分化表型特点

目的观察神经干细胞在悬浮培养与贴壁培养方式下的形态学特点及分化表型。方法新生6 h内的大鼠皮质应用无血清悬浮培养与贴壁培养神经干细胞(NSCs)技术培养,观察神经干细胞的形态学特点。体外胎牛血清(FBS)诱导NSCs分化,通过巢蛋白(Nestin)和GFAP免疫荧光染色鉴定分化表型。台盼蓝活细胞计数法比较细胞增殖能力。结果新生大鼠皮质应用无血清悬浮培养可获得稳定的NSCs细胞球,应用贴壁培养形成长梭状NSCs,NSCs巢蛋白免疫荧光染色结果呈阳性。体外FBS诱导分化后,神经球内开始出现放射状的神经纤维丝,免疫荧光染色可见GFAP阳性细胞向外伸展以及Nestin阳性细胞边集。贴壁的NSCs分化成星形胶质细胞,免疫荧光染色可见Nestin和GFAP染色阳性细胞。在相同条件下,应用悬浮培养在第2~3 d时增殖速度最大,而以贴壁培养方式培养出的神经干细胞在第4~5 d时增殖速度最大。结论应用无血清培养物B27与b FGF、EGF组合的NSCs完全培养基通过悬浮培养法与贴壁培养法,都可以成功在体外培养出NSCs;悬浮培养法培养NSCs在早期增殖速率上优于贴壁培养法。     

大鼠胚胎NSCs与人胚NSCs的比较

目的 探讨体外培养的大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）及人胚NSCs的生长增殖特点。方法 取孕15d的大鼠，采用胰酶消化法获取海马区细胞，以106个／ml的细胞密度接种到无血清NSCs培养基中培养，分离纯化至第5代后，以10％胎牛血清（FBS）和2％多聚赖氨酸诱导分化，免疫细胞化学鉴定。同样方法分离、培养人胚海马区细胞。结果 取大鼠胚胎NSCs和人胚NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定，细胞分别呈巢蛋白（nestin）、微管蛋白（β—tubulin）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学反应阳性。结论 大鼠胚胎海马区与人胚海马区均有NSCs存在，离体培养时能分裂增殖，并能被诱导分化，且两者形态相似，但是其生长速度、体积大小有差异。     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞分离、培养和分化特性

目的建立大鼠神经干细胞（NSCs）分离、培养方法，观察其生长、增殖和分化特点。方法利用无血清培养技术，从新生大鼠海马、室管膜下区分离NSCs，进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定NSCs及其分化结果。结果分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力，原代及传代培养均可形成细胞克隆，克隆中的细胞巢蛋白（nestin）表达阳性，显微镜下观察见典型的干细胞特征，诱导后可分化神经元和星形胶质细胞。结论上法分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs，可诱导分化为终末神经细胞。     

Wistar大鼠胚胎脑源性神经干细胞分离、培养及其鉴定

目的 分离培养、鉴定Wistar大鼠胚胎脑源性神经干细胞.方法 从Wistar大鼠胚胎脑组织中分离胚胎脑源性神经干细胞,采用无血清培养技术进行培养、传代,应用免疫细胞化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定.结果 分离培养获得大量悬浮生长的细胞团,该细胞具有连续增殖的能力,并能分化为神经元和神经胶质细胞,经传代培养8代后仍具干细胞特性.结论 Wistar大鼠胚胎脑组织中可成功分离培养神经干细胞,该细胞在体外适宜的条件下能够大量增殖,并具有多向分化潜能.

Abstract：

Objective To isolate and culture the brain-derived neural stem cells (NSCs) from Wistar rat embryos and identify the ability of proliferation and differentiation of NSCs. Methods The neural stem cells were obtained from the brain of Wistar rat embryos. They were cuhured and passaged with serum-free medium. Cultured and differentiated cells were identified with immunocytochemistry staining. Results Clusters of neural stem cells were obtained in suspension and these cells could be continuously proliferated. And the cells could be differentiated into neurons and astrocytes which maintaining the main characteristics of NSCs after 8 passages of culture. Conclusions The neural stem ceils derived from rat embryonic brains are able to proliferate and multiple potent for differentiation.     

大鼠胚胎脑皮层神经干细胞的分离和培养

目的探讨分离、培养、纯化大鼠胚胎神经干细胞(neuralstem cell,NSCs)的最佳条件,以获得充足的神经干细胞来源,用于中枢神经系统疾病的治疗.方法分离孕13～15 d胎鼠大脑皮层,在无血清含神经生长因子N2培养液中培养,利用有限稀释法单克隆培养和改良法连续传代纯化并扩增NSCs,免疫组织化学法对NSCs及分化细胞进行鉴定.结果可以通过体外培养获得大量神经源性干细胞,在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能.结论NSCs的存活和分裂依赖于神经生长因子和N2添加剂的浓度,胚胎脑组织和神经球分离方法影响NSCs的形成速度和数量.掌握NSCs的体外纯化培养和鉴定手段可为进一步研究NSCs生物学特性及神经系统损伤的治疗提供新方法.     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

大鼠胚胎神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究

目的 研究大鼠胚胎神经干细胞移植治疗脑出血的可行性。方法 从孕龄16天的大鼠胚胎脑组织中分离、培养神经干细胞并诱导其分化，通过免疫组化学技术研究其特性。制作大鼠脑出血模型，3天后将未分化的神经干细胞注入血肿同侧或对侧的尾状核内，记录损伤和移植后的大鼠运动功能。不同时间杀死大鼠，研究移植后的干细胞在体内分化和迁徙的情况。结果 实验中分离、培养的神经干细胞体外能够被诱导分化成神经元、光突胶质细胞和星形胶质细胞，血肿同侧移植干细胞的大鼠运动功能的改善显著好于血肿对侧移植干细胞组及未移植干细胞的对照组。免疫组化方法证实移植后的干细胞在体内可分化成神经元和胶质细胞，并向损伤区域迁徙。结论 大鼠胚胎神经干细胞体内、体外均具有多向分化潜能，其分化成各种类型神经细胞的比例与所处的外界环境有关，在脑内靠近损伤部位移植胚胎神经干细胞后能够有效改善脑出血动物的运动功能。     

人胚海马神经干细胞体外培养及分化研究

目的 研究人胚胎海马神经干细胞体外长期培养的条件和其在自主分化条件下的分化能力和分化特点。方法 从人胚胎海马分离神经干细胞。采用无血清培养法，进行体外培养、扩增，形成神经球。使神经球贴壁分化，分化培养基不含有任何细胞有丝分裂促进剂。使用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记分裂增生的细胞，观察细胞的分裂增殖情况。使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞及其在不加诱导剂下的自主分化能力。结果 从人胚胎海马分离的神经干细胞具有增殖能力，细胞倍增时间为3．2d。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。细胞贴壁分化后可以出现Nestin、GFAP、Tuj-1表达阳性的细胞。神经干细胞共培养6个月，传代14代。结论 分离培养的海马神经干细胞具有自我更新和增殖能力，可以长期培养。在不加任何诱导剂的自主分化条件下可以向神经元、胶质细胞分化。少突胶质细胞的培养需要不同的培养条件。分离培养的干细胞具有神经干细胞的特征。可用于基础和临床的相关研究。     

大鼠胚胎神经干细胞两种不同分离、传代方法的比较

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),比较不同分离、传代方法对其生长的影响。方法取怀孕15d的大鼠,分别用机械分离法和含0.01%EDTA的胰蛋白酶消化法分离海马区细胞,均以1×106/mL的活细胞密度接种到无血清的NSCs培养基中培养,分离纯化至P5代。以含10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸的DMEM/F12诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果机械分离组获得的活细胞及培养后的神经干细胞球数目明显多于胰蛋白酶消化组,其细胞贴壁率却高于胰蛋白酶消化组。取神经干细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈Nestin、β-tubulin-Ⅲ、GFAP和O4阳性反应。结论大鼠胚胎海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。机械分离法和胰蛋白酶消化法各有利弊,可以根据实验情况交叉采用两种不同的分离方法,以稳定高效地培养出NSCs。     

脊髓神经干细胞培养及体外诱导分化实验研究

目的探讨胚胎大鼠脊髓神经干细胞(SNSCs)的分离培养及体外诱导分化的特点和规律。方法利用无血清培养技术和细胞免疫化学方法。结果在表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的作用下,SNSCs快速增殖,形成多细胞组成的细胞球,将这些细胞球分离成单细胞重新培养,单个的细胞又很快变成细胞球。虽然白血病抑制因子(LIF)不是SNSCs培养所必需的,但是它可明显促进SNSCs增殖。诱导分化实验显示:SNSCs可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,而LIF组则分化很少。结论从胚鼠脊髓分离神经干细胞是可行的,这些细胞在体外经多次传代后仍具有较强的增殖能力和多向分化潜能;LIF可以促进SNSCs增殖并抑制其分化。     

体外三步法诱导胚胎干细胞定向生成神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的方法。方法 模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境，以脑星形胶质细胞为支持细胞，用全反式维甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)等分三阶段诱导ESCs定向生成NSCs。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定；形态学观察结合免疫组织化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志OCT-4和神经干细胞标志Nestin蛋白和(或)基因表达对诱导全过程进行动态监测；NSCs分化试验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测。结果(1)体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养，仍保持向三胚层分化的能力；(2)随着诱导的进行，OCT-4表达逐渐减弱并消失，而Nestin表达逐渐增强，经三步法最终可诱导形成纯度高达90％以上的Nestin阳性细胞；(3)所诱导生成的细胞在NSCs选择性培养基中反复传代，仍表现为Nestin阳性和具有生成神经球的能力，在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞。结论采用星形胶质细胞作为诱导基质，模拟体内神经分化过程的三步诱导法，可诱导ESCs生成较高纯度的NSCs，并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力。     

人胚神经干细胞体外长期培养系统的建立

目的建立人胚神经干细胞的体外长期培养系统并研究其生物学特性.方法从胚龄为20周的人胚胎皮质组织分离出神经干细胞,连续传代培养并检测生长曲线,测定长期培养对细胞周期和细胞分化及冻存的影响.结果体外培养神经干细胞达到了10个月,传代25代,总的细胞数增加了105倍.干细胞只有培养1个月后才能有效去除前体细胞.细胞周期显示细胞保持了活跃的增殖,多次传代后细胞冻存对细胞的存活力无明显影响,多向分化潜力表现出稳定性.结论人神经干细胞可于体外长期培养,这也是细胞纯化的有效方法.