宁波地区肠道病毒71型VP1基因特征分析

目的 了解宁波地区肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)流行株VP1基因特征.方法 采集手足口病患者的样本进行病毒分离和鉴定,用逆转录-聚合酶链反应对EV71流行株VP1进行扩增和测序.对流行株VP1进行进化分析,并将流行株VP1与各基因型代表株进行序列比对.同时测定EV71流行株的半数组织培养感染量(median tissue culture infective dose,TCID50).结果 2008-2009年,宁波地区分离出23株病毒,其中6株为EV71.EV71流行株VP1进化分析显示,6株EV71流行株与C4亚型代表株聚于同一分支,流行株VP1的核苷酸和氨基酸序列与C4亚型代表株的同源性最高,分别为92.0%～93.1%和98.9%～99.3%.6株EV71流行株的滴度为101.16～103.33TCID50/ml.结论 2008-2009年宁波地区EV71流行株属于C4亚型.     

柯萨奇病毒A组16型毒株的分离及其生物学特性初步分析

 目的  对柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16,CA16）毒株进行分离、鉴定,并分析其生物学特性,为CA16疫苗候选毒株的筛选奠定基础。方法  从手足口病患者的咽拭子或疱疹液样本中分离CA16毒株,经噬斑纯化后,用逆转录-聚合酶链反应进行病毒鉴定。将病毒连续传代后,对其VP1基因进行序列测定,分析VP1基因和氨基酸序列的同源性和遗传稳定性。结果  通过Vero细胞适应传代和噬斑纯化,获得遗传稳定的CA16毒株,感染Vero细胞后引起典型的细胞病变。病毒分离株经CA16特异性引物扩增后可见208 bp的特异性条带,经VP1基因测序进一步确定这些分离株为CA16。同源性和系统进化树分析表明,各毒株与shzh04-J31株的同源性最高,为92.4%~96.1%,均属于C基因亚型。病毒分离株在Vero细胞上连续传12代后,仅1株病毒的1个氨基酸发生改变。结论  成功分离到CA16毒株,其生物学特性稳定,可用于CA16疫苗的研发。     

5种不同细胞对柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒71型的敏感性研究

 目的   评价肠道病毒研究中常用的5种细胞对柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16,CA16）和肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）的敏感性,为分离和培养CA16和EV71提供实验室依据。方法  用分离的各15株CA16和EV71分别感染RD、Vero、KMB17、Hep2和L20B细胞,每天观察细胞病变情况,按Karber法计算病毒感染性滴度。采用不同的统计学方法（包括方差分析和卡方检验）比较5种细胞对CA16和EV71的敏感性差异。 结果   5种细胞的CA16和EV71病毒感染性滴度间的差异具有统计学意义（CA16：F＝18.481,P＝0.000;EV71：χ²＝63.106,P＝0.000）。在5种细胞中,RD细胞对2种病毒的敏感性最高,CA16和EV71的病毒感染性滴度分别可达7.8和8.2 lgCCID₅₀/ml,且均于接种细胞后48 h达增殖高峰,第4天进入增殖平台期;2种病毒在Hep2和L20B细胞中的病毒感染性滴度均较低,CA16分别为5.2和4.2 lgCCID₅₀/ml,EV71分别为4.9和4.0 lgCCID₅₀/ml,且2种病毒在接种后第6~7天才达增殖高峰,但仅L20B细胞中的2种病毒于接种后第7天进入增殖平台期;CA16在Vero和KMB17细胞中的病毒感染性滴度分别为6.9和7.3 lgCCID₅₀/ml,EV71分别为7.1和6.8 lgCCID50/ml,2种病毒均在接种Vero和KMB17细胞后第3天达到增殖高峰,第5天进入增殖平台期。 结论   RD细胞对CA16和EV71的敏感性最好,其次是Vero和KMB17细胞,而Hep2和L20B细胞并非是分离和培养这2种病毒的理想细胞。     

福州地区肠道病毒EV71基因型特征的研究

目的 研究福州地区肠道病毒71型(EV71)基因型特征,观察其年度变化及地区分布特点,以了解病毒变迁及传播方式.方法 对住院患者肛拭子EV71阳性的样本,RT-PCT扩增VP1基因的部分片段,再进行核酸测序,以获得的基因片段构建系统发生树,观察不同地区及不同年度之间病毒基因同源性,了解病毒变迁情况.结果 总共获得EV71病毒VP1基因片段64例,其中2013年10例,2014年14例,2015年40例,构建系统发生树,与网上发布的shzh98、shzh03和zhejiang08病毒株相比,均属于C4亚型.福州地区的病毒株,不同年度之间病毒变异不大;同一地区的病毒同源性很高,提示病毒在小范围内保存并持续传播.结论 2013-2015年福州地区手足口病主要病原EV71病毒属于C4亚型;系统发生树显示EV71同源性有较明显的地区分布特点,3年内病毒未出现明显变异.     

2011～2015年合肥市手足口病流行病学及病原学特征分析

目的 分析2011～2015年合肥市手足口病的流行病学和病原学特征,为手足口病的防控工作提供参考。方法 手足口病发病资料来自2011～2015年传染病监测报告信息管理系统,病原学检测数据来自监测点和现场调查采样,统计方法运用描述性分析和χ²检验,对粪便标本采用RT-PCR扩增基因序列测定,并利用生物学软件分析。结果 手足口病年平均发病率196.11/10万,发病高峰在4～6月,发病年龄以5岁以下儿童为主,占总发病人数的94.45%;肠道病毒71型（EV71）为优势株,感染机体引起重症手足口病风险较大。进化树分析表明合肥市EV71属于C4a亚型。幼儿园健康儿童病毒携带率6.80%,均为其它肠道病毒。结论 合肥市手足口病发病率较高,EV71是优势株,为C4a亚型,与中国大陆优势毒株流行趋势一致。在做好全面防控的同时,应重点做好5岁以下儿童的防控工作。     

免疫异源黄病毒可防御致死性西尼罗病毒脑炎

作者对同属于黄病毒属的乙型脑炎病毒( JEV)、圣路易脑炎病毒 ( SLEV)和黄热病病毒 ( YFV)的疫苗间的交叉免疫及用于防御西尼罗病毒 ( WNV)感染的可能性进行了研究。　　研究应用 4种黄病毒 :WNV385- 99株、JEV SA1 4 - 2 - 8减毒疫苗株、YFV1 7- D减毒疫苗株和 SLEV Be Ar2 3379株 ,实验动物为雌性叙利亚仓鼠 (重 70～ 1 0 0 g)。病毒滴定在白纹伊蚊细胞的 C6 /36克隆培养物中进行 ,结果以每 ml标本中的 TCID50 计。 WNV和YFV经腹腔注射、JEV和 SLEV皮下注射 ,注射剂量分别为 1 0 4 .0 TCID50 、1 0 6.0 TCID50 、1…     

抚州市2011～2012年手足口病病原学检测结果分析

目的 了解抚州地区手足口病的病原学特征和流行情况.方法 采集2011～2012年抚州市第一人民医院送检的临床诊断手足口病例咽拭子样本338份,实时荧光RT-PCR进行肠道病毒通用型（PE）、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxA16）的核酸检测.结果 338例手足口病咽拭子样本中,总阳性率为65.68％（222/338）,2011年咽拭子样本EV71阳性检出率（44.44％）高于2012年（26.89％）,差异有统计学意义（P＜0.01）;2011、2012年均以EV71感染为主,病毒流行株差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 EV71是抚州地区手足口病的主要致病病毒,流行特征和病原学分型分析有助于手足口病的早期防控和治疗.     

表达甲型H5N1禽流感病毒结构蛋白的重组痘苗病毒的构建与鉴定

目的  构建表达甲型H5N1禽流感病毒（H5N1 avian influenza A virus,H5N1 AIAV）NIBRG14株结构蛋白的重组痘苗病毒,为研制新型人用流感疫苗奠定基础。方法  通过反转录PCR扩增H5N1 AIAV NIBRG14株的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）编码基因,并将改造的HA、NA基因克隆至痘苗病毒穿梭质粒 pSCCK。在重组质粒与痘苗病毒天坛株（vaccinia virus Tiantan,VTT）于Vero细胞中发生同源重组后,筛选同时表达HA和NA的重组痘苗病毒（rVTT-HA/NA）,并对其进行鉴定。结果  反转录PCR扩增的HA和NA基因大小约分别为1 700和1 400 bp,与预期相同。DNA测序证实,改造的HA和NA序列正确。对获得的rVTT-HA/NA进行PCR及测序表明,HA和NA基因正确插入VTT。蛋白质印迹显示,rVTT-HA/NA感染的Vero细胞表达的HA和NA能与相应的抗体发生反应。表达的HA具有血凝活性,血凝滴度为1∶32。结论  重组痘苗病毒rVTT-HA/NA可稳定表达H5N1 AIAV NIBRG14株的HA和NA。     

我国及广西手足口病流行病学研究进展

自从1948年Dalldorf在美国纽约州格林县的柯萨奇镇(Coxsackie New York)的患儿中发现并描述了一种后来被命名为柯萨奇病毒(Coxsackie virus)以来,直到1960 Alsop将由萨科奇病毒引起的疾病命名为手足口病(HFMD),随后在世界各地均发现存在手足口病的流行。我国于1980年首次报告手足口病,广西于1989年第一次发现并报告了该病,自2008年手足口病列为国家法定丙类传染病以来,广西对手足口病的病原体的基因型进行了详细的研究,结果显示其中肠道病毒71型(EV71)占41.70%,柯萨奇病毒A16型(CoxA16)阳性8.50%。同时证实广西分离的EV71与国内其他省流行的EV71流行株具有高度的同源性,同属于C4基因亚型C4b分支。资料显示手足口病在国内呈现自然流行消长趋势,尽管该病的疫苗研究取得了多方面的进展,但离现场应用仍然存在多方面的挑战。     

肠道病毒71型H6株在Vero细胞上的传代适应及理化特性

目的 研究肠道病毒71型(EV71)在Veto细胞上传代适应的可行性,为用Vero细胞制备EV71疫苗提供科学依据.方法 将EV71 H6株病毒在Veto细胞上进行3次蚀斑筛选并连续传代培养,然后检测适应株的生物学性状及稳定性.结果 经筛选后的Vero细胞适应株可被特异抗EVT1血清中和.传至第5代,病毒滴度可达8.13 LogCCID50/ml.制备毒种的适宜感染剂量(MOI)为0.01,在96 h左右收获的病毒滴度较高.理化学试验结果表明,EV71核酸类型为RNA,不具有耐热性,但可耐受乙醚、酸的作用.结论 EV71 H6株能较好的适应Vero细胞,并保持稳定的生物学性状.     

Immunogenicity of enterovirus 70 capsid protein VP1 and its non-overlapping N- and C-terminal fragments

Currently no practical treatment method or effective virus vaccine is available for acute hemorrhagic conjunctivitis (AHC) caused by enterovirus 70 (EV70). Antibodies to UV-inactivated EV70 (J670/71 epidemic isolate) and to the inclusion bodies of recombinant proteins of full-length EV70 VP1 (GST-VP1m), its non-overlapping terminal fragments N138 (1-138 aa) and C170 (141-310 aa) (or GST-N138m and GST-C170) were developed in rabbits. The anti-EV70 neutralizing activities of the rabbit sera were determined by standard neutralization assays. The antibodies to UV-inactivated EV70, were immuno-reactive with EV70 capsid proteins VP1 and VP3 of four EV70 epidemic isolates (KW/97, T260/74, J670/71 and AE/72) in Western-blot analysis, and immunoprecipitated the capsid proteins VP1 and VP3 from the cell lysates of virus-infected human Chang's conjunctival (HCC) cells. The antibodies to GST-VP1m, GST-N138m and GST-C170, immunoprecipitated only the VP1 proteins of the four EV70 isolates. Anti-EV70 J670/71 antibodies and the antibodies to the three recombinant VP1 proteins were all capable of immunoprecipitating EV70 whole-virus of the four EV70 epidemic isolates grown in HCC cells. The anti-EV70 virion antibodies neutralized EV70 isolates with titers of 6000-10,000 units/ml while the antibodies to GST-VP1m, GST-N138m or GST-C170 neutralized EV70 isolates with titers of 20-320units/ml. The results suggest that (a) immunization with bacterially produced recombinant EV70 VP1 and its non-overlapping N- and C-terminal fragments, was capable of eliciting EV70-neutralizing antibodies; (b) the neutralization titers of antibodies to the recombinant VP1 proteins were lower than that of antibodies to the UV-inactivated EV70 virions; and (c) the non-overlapping N138 and C170 fragments of EV70 VP1 both harbor independent anti-EV70 neutralization antigenic sites.     

2004-2006年上海市麻疹病毒基因特征分析

目的 对2004-2006年上海市麻疹暴发、流行的野毒株进行基因特征分析和分子流行病学研究,为提出更好的免疫策略,实现麻疹消除目标提供科学依据.方法 采集的血清用ELISA法检测麻疹病毒IgM抗体;用Vero/SLAM细胞对采集的咽拭子标本进行病毒分离,分离到的麻疹病毒株用RT-PCR方法扩增其核蛋白基因C端的部分序列,并对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,以C端456个核苷酸为目的 片段进行基因亲缘性关系分析.结果 2004-2006年上海市疾病预防控制中心对148例疑似麻疹病人的血清进行麻疹IgM抗体检测,132份血清阳性,148份咽拭子中分离到66株麻疹野病毒,阳性率分别为89.2%和44.6%.病毒分离阳性标本的对应血清麻疹IgM抗体检测均为阳性.分离到的66株麻疹野毒株均为H1基因型,除Shanghai04-5为H1b基因亚型外,其余均为H1a基因亚型.所有分离毒株之间的核苷酸同源性为95.8%～100%,氨基酸同源性为95.8%～100%.所有毒株与中国疫苗株S191的核苷酸同源性为91.2%～93.2%,氨基酸同源性为86.8%～90.1%;与疫苗株Changchun-47的核苷酸同源性为92.5%～93.4%,氨基酸同源性为88.2%～91.4%.结论 引起2004-2006年上海市麻疹暴发、流行的野毒株为HI基因型,并以H1a为绝对优势亚型.上海市2005年和2006年可能都有一个主传播链的存在.     

杨梅素体外抗EV71病毒作用的研究

目的初步探究杨梅素抗肠道病毒71型(EV71)的活性及其机制。方法采用EV71感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)模型,采用致细胞病变(CPE)法和空斑实验观察杨梅素的抗病毒效果。以不同浓度的杨梅素处理细胞,结合结晶紫染色的方法检测杨梅素的细胞毒性。以免疫印迹法检测杨梅素对VP1蛋白表达的影响。应用RT-PCR的方法评价杨梅素对VP1基因表达的影响。结果杨梅素在2.5~20μmol·L^-1的浓度下预处理病毒能够显著抑制EV71感染诱导的细胞死亡,且这种抑制作用具有剂量依赖性,IC50为5.6μmol·L^-1。与病毒组相比,杨梅素在2.5~20μmol·L^-1的浓度下还能够显著降低病毒滴度。免疫印迹和RT-PCR的结果显示,杨梅素还能够明显降低病毒衣壳蛋白VP1的基因和蛋白表达。结论杨梅素具有显著的体外抗EV71病毒活性。     

我国肠道病毒71型（EV71）疫苗株生物信息学分析

目的 比较3个EV71疫苗株病毒的生物信息学特点,为疫苗的质控和探讨该病毒疫苗的免疫机制提供参考.方法 本研究利用DNAstar MegAlign、DNAMAN Alignment、ANtheProt等生物学软件,比较了我国已进入临床试验的3家EV71全病毒灭活疫苗毒株的基因组及氨基酸序列,并对英衣壳蛋白二级结构及可能存在的抗原表位进行了预测分析.结果 3个疫苗株病毒基因同源性为97％～99％;氨基酸同源性为98％～99％;二级结构一致率在95％以上;均存在35个潜在抗原表位区域.结论 3个疫苗株生物信息学分析结果存在高度的一致性,提示疫苗具有相似的抗原性和免疫原性.     

EV71疫苗研究进展

肠道病毒71型(enterovims 71,EV71)是手足口病的主要病原体,由于尚无治疗手足口病的有效抗病毒药,因此,开发预防手足口病的有效EV71疫苗成为所有控制措施的首选.目前,EV71疫苗研究已取得一定的进展,正在研发的疫苗包括减毒或灭活疫苗、VP1亚单位疫苗和DNA疫苗.虽然各种疫苗均具有一定的免疫效果,但最适疫苗的确认还需对各种疫苗的安全性和保护效力进行评估.     

EV71疫苗研究进展

肠道病毒71型(enterovims 71,EV71)是手足口病的主要病原体,由于尚无治疗手足口病的有效抗病毒药,因此,开发预防手足口病的有效EV71疫苗成为所有控制措施的首选.目前,EV71疫苗研究已取得一定的进展,正在研发的疫苗包括减毒或灭活疫苗、VP1亚单位疫苗和DNA疫苗.虽然各种疫苗均具有一定的免疫效果,但最适疫苗的确认还需对各种疫苗的安全性和保护效力进行评估.     

Modeling the ligand-receptor interaction for a series of inhibitors of the capsid protein of enterovirus 71 using several three-dimensional quantitative structure-activity relationship techniques

The structure of enterovirus 71 (EV71) capsid protein VP1 has been constructed by using homology modeling and molecular dynamics simulation techniques. The ligand structures were a series of EV71 VP1 inhibitors synthesized by Shia et al. in 2002 and Chern et al. in 2004. The training set was selected by the VOLSURF4.1/PCA program and the IC50 values varied from 0.06 to 10.83 microm. Then, the training set was analyzed by the following three-dimensional quantitative structure-activity relationship techniques: CoMFA, CoMSIA, CATALYST4.9, and VOLSURF4.1/PCA. The model generated by a two-stage flexible docking procedure and without any structural alignment has far more significant statistics. Highly accurate activities for the test sets were then predicted by the top hypothesis of the CATALYST program and were compared with those predicted by CoMFA, CoMSIA, and VOLSURF. These studies identified some important clues for searching or making more potent inhibitors against the EV71 infection.     

Antiviral Activity of Hederasaponin B from Hedera helix against Enterovirus 71 Subgenotypes C3 and C4a

Enterovirus 71 (EV71) is the predominant cause of hand, foot and mouth disease (HFMD). The antiviral activity of hederasaponin B from Hedera helix against EV71 subgenotypes C3 and C4a was evaluated in vero cells. In the current study, the antiviral activity of hederasaponin B against EV71 C3 and C4a was determined by cytopathic effect (CPE) reduction method and western blot assay. Our results demonstrated that hederasaponin B and 30% ethanol extract of Hedera helix containing hederasaponin B showed significant antiviral activity against EV71 subgenotypes C3 and C4a by reducing the formation of a visible CPE. Hederasaponin B also inhibited the viral VP2 protein expression, suggesting the inhibition of viral capsid protein synthesis.These results suggest that hederasaponin B and Hedera helix extract containing hederasaponin B can be novel drug candidates with broad-spectrum antiviral activity against various subgenotypes of EV71.