人miR-378慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建人miR-378慢病毒表达载体。方法酶切法从已构建的质粒获得pri-miR-378,克隆于含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的PGCSIL载体,转化感受态细胞,产生重组慢病毒质粒PGCSIL-miR-378,并进行PCR及测序鉴定。将PGCSIL-miR-378、pHelper 1.0和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平用逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。结果成功构建miR-378的慢病毒表达载体,测序证实所插入基因序列完全正确。荧光显微镜检测证实PGCSIL-miR-378携有正确的miR-378基因,并能在293T细胞中表达。检测病毒滴度为8×108 TU/ml。结论成功建立了miR-378慢病毒表达系统。     

雌激素受体α基因shRNAi慢病毒载体的构建与滴度测定

目的:构建雌激素受体(ER)α基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,检测病毒感染细胞的滴度.方法:针对已经筛选确定的ERα基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCsil-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生 shERα-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用shERα-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果:PCR和测序证实,成功构建ERα shRNA的慢病毒载体shERα-LV.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/mL.结论:成功构建人ERα基因RNAi慢病毒载体,为ERα在乳腺癌发生发展中的研究提供了基础.     

负载hTERT调控相关miR-138慢病毒的包装及鉴定

目的:构建hTERT(人端粒酶逆转录酶)调控相关miR-138慢病毒表达载体.方法:化学合成miR-138前体序列,连接到包含U6启动子及GFP(绿色荧光蛋白)报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中,获得重组质粒,经双酶切和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0共转染至HEK 293T细胞包装病毒,并对病毒进行鉴定.结果:双酶切和测序结果证实miR-138前体核苷酸链序列捕入正确,包装的慢病毒滴度达7×107TU/ml;包装成功的慢病毒可有效增加感染细胞内miR-138的表达丰度,并可下调hTERT表达水平.结论:成功包装并鉴定人miR-138慢病毒表达载体.     

CDC25B3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建CDC25B3基因RNAi慢病毒载体.方法 合成CDC25B3基因RNAi有效靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与双酶切后的pGCL-GFP载体(含有U6启动子和GFP基因)连接产生LV-shCDC25B3慢病毒载体,挑选阳性克隆经PCR和测序鉴定.用脂质体转染法将LV-shCDC25B3、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功地构建了CDC25B3 shRNA的慢病毒载体LV-shCDC25B3.浓缩病毒悬液的滴度为1×108TU/ml.结论 成功构建人CDC25B3基因RNAi慢病毒载体.     

ERα基因shRNAi慢病毒载体的构建与滴度测定

目的：构建ERα基因RNAi慢病毒载体,检测病毒感染细胞的滴度。方法：针对已经筛选确定的ERα基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I和EcoRI 酶切后的pGCsil-GFP载体［含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）］连接产生shERα-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。 用shERα-LV载体、pHelper 1.0 载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结论：PCR和测序证实,成功构建ERα shRNA的慢病毒载体shERα-LV. 包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2E+8TU/ml。讨论：成功构建人ERα基因RNAi慢病毒载体,为ERα在乳腺癌发生发展中的研究提供了工作基础。     

USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体,为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列,序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和X hoⅠ。寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链,5＇端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。连接产物经转化、培养,提取其质粒,提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定,鉴定正确的质粒进行测序。构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA与包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×10^7 TU/ml。结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体,为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

CYP4F3基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建

目的构建细胞色素P450(CYP)4F3基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体。方法设计并合成CYP4F3 siRNA序列,与含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pGCL载体连接产生PscsiCYP4F3慢病毒载体,PCR和测序鉴定。用PscsiCYP4F3、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染人肾上皮细胞系293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度,并以人肺腺癌A549细胞中CYP4F3mRNA表达水平确定该基因干扰的有效靶点。结果成功构建CYP4F3siRNA的慢病毒载体,并筛选出该基因的有效干扰靶点。结论成功构建人CYP4F3基因RNAi慢病毒载体,为后期研究CYP4F3基因功能奠定基础。     

HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。方法选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7（pLL3.7）连接,产生pLL3.7HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定 用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞（磷酸钙转染法）,包装产生慢病毒,将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。结果酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7HIF-1α 包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ml。结论成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。     

含IL-24基因重组慢病毒表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨白细胞介素(IL)24基因表达目的蛋白IL-24的方法,检测IL-24对肝癌细胞生长的影响.方法 自经5μg/ml植物血凝素(PHA)刺激的正常人单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,RT-PCR扩增出IL-24 cDNA,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒转移载体pHAGE-IL-24,转染HEK 293T细胞.荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达;梯度稀释法测定病毒滴度,感染HEK 293T细胞48 h后进行RT-PCR和Western blot检测IL-24的基因和蛋白表达;MTT法检测细胞的增殖.结果 限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带IL-24基因的慢病毒表达载体,滴度为5×106TU/ml.以MOI为5.0的重组慢病毒感染靶细胞HepG2 48 h后,能够检测到外源基因IL-24的蛋白表达.IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.结论 成功构建了含IL-24基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染HepG2细胞,并在其中大量表达目的蛋白;IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.     

Neuritin基因高表达系统构建及转染大鼠雪旺细胞的鉴定

目的构建neuritin基因的高表达系统,观察其转染雪旺细胞后neuritin的表达。方法根据大鼠neuritin mRNA序列体外合成编码序列(CDS区),构建到pGH载体,与酶切后的GV208-绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体片段进行连接、转化、酶切及测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆,转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞。将雪旺细胞分为三组:空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)、高表达组(C组)。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测细胞neuritin的表达。结果大鼠neuritin正确插入慢病毒载体,C组neuritin mRNA水平显著高于A组、B组(P<0.01)。检测到neuritin蛋白与GFP的融合蛋白。结论成功构建neuritin慢病毒高表达系统;其转染的雪旺细胞neuritin表达升高。     

白花前胡提取成分对心血管作用的研究进展

目的介绍国内外中药白花前胡提取成分对心血管作用的研究进展 ,为研究和开发中草药提供参考。方法以国内外大量有代表性的文献为基础 ,进行分析、整理和归纳。结果白花前胡提取成分保护心血管作用可能通过以下机制 :a .阻滞钙内流 ;b .抑制血小板聚集作用 ;c .促钾通道开放 ;d .调节心肌细胞动作电位 ;e .抗氧自由基和脂质过氧化作用实现。结论白花前胡及其有效成分在研究和开发防治心血管疾病新药方面具有广阔前景     

由于毛细现象液面上升高度计算的思考

毛细现象在日常生活和科技生产中都有着重要的作用。大部分同学在计算毛细管中液面上升高度时,往往因为不能抓住模型的本质而产生错误。本文针对两种不同的模型通过对比计算方法,指出了错误产生的原因从而加以规避。     

质疑处方“划价”易位的合理性

目的:合理推进医院服务改革,促进《处方管理办法》的深入落实。方法:比较财务"划价"与调剂"划价"对患者的优势与劣势。结果与结论:财务人员"划价"注重的是经济收入;调剂人员"划价"注重的是处方的合理性,后者对于防范医疗风险、保障患者用药安全起着无可替代的作用。建议将药品价格内容与财务收费联网,让财务划价人员与药剂人员联合办公。     

治疗痤疮药物使用情况分析

目的了解目前医院治疗痤疮的药物使用情况。方法选取本院门诊300张临床诊断为痤疮的处方进行分析。结果本院治疗痤疮药物的使用频率前六位依次是螺内酯、维生素B6、氯唑乳膏、克林霉素、羚羊角滴丸、异维A酸;抗生素的使用存在一些不合理情况。结论痤疮治疗中抗菌药物的使用应规范合理,以减少耐药的产生和药物不良反应的发生率。     

铸造桩核修复老年人后牙残根残冠的探讨

目的铸造桩核在修复老年人后牙残根残冠的效果。方法选择60～80岁老年患者42例,患牙48颗、上(牙合)牙25颗。下(牙合)牙23颗。首先将残根残冠经过完善的根管治疗后,进行常规备牙,选择相对粗、直、长的根管为桩核固定的主根管。经取模灌注后制作铸造金属桩核,固定于残根残冠。再进行固定或活动义齿修复。结果在46件义齿修复中,2例2颗在1年后因根折而拔除,相对患者和患牙的成功率分别为95.2%和95.8%,效果理想。结论选择性的保留老年人的残根残冠,并作完善的根管治疗,再行铸造桩核修复可以取得较好的效果。     

龟板的质量鉴别

目的促进临床准确合理用药。方法从药材基源和性状特征对正品和伪品进行鉴别。结果正品和伪品的出膏率存在很大差距。结论伪品功效甚微,应限制使用。     

人体脚长、脚掌宽与身高相关关系的研究

对489名男女青年进行了脚长、脚掌宽与身高的测量,并记录相关数据,将测量数据输入计算机中进行回归分析,得出脚长、脚掌宽推测身高的直线回归方程,利用脚长推测身高:男性:y=93.55+3.26x,女性:y=130.53+1.41x;利用脚掌宽推测身高:男性:y=130.79+4.18x,女性:y=137.99+2.72x。结果表明,人体脚长、脚掌宽与身高存在一定的线性关系。     

Clinical use of the polymyxins: the tale of the fox and the cat

Background

There is a need to identify practice patterns of polymyxin use, quantify gaps in knowledge, and recognize areas of persistent confusion.

新生儿使用多巴胺时静脉血管保护方法的探讨

目的 探讨新生儿在使用多巴胺药物治疗时的静脉血管保护方法.方法 提取2008年2月至2010年5月期间儿科病例资料60例,对静脉输液的治疗方法及护理方法进行分析,并与同期未进行相应血管保护方法60例进行对比.结果 60例新生儿在应用多巴胺静脉输注过程中,4例出现轻微不良反应.2例出现严重不良反应;对照组患者出现轻微不良反应8例,出现严重不良反应6例,两组不良反应经过治疗全部痊愈.结论 血管选择优化,均匀给药,控制给药时间及良好的固定措施,配合临床密切观察来预防不良反应,是预防和保护血管发生损害的工作重点.