抗TfR单链抗体-AP融合蛋白的构建、表达与鉴定

目的构建、表达和鉴定抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体———碱性磷酸酶(AP)融合蛋白。方法用SfiⅠ和NotⅠ分别酶切抗转铁蛋白受体scFv表达质粒pUC19/119,获得scFv基因,直接亚克隆到表达载体pDAP2中,在TG1菌中表达scFvAP融合蛋白,SDSPAGE分析scFvAP的分子量,酶免疫测定鉴定其抗体和酶活性。结果scFvAP融合蛋白表达载体经scFv特异性引物PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可见约700bp条带,符合scFv基因理论值大小,IPTG诱导产物经SDSPAGE分析可见约为75ku的蛋白条带,符合scFvAP融合蛋白分子量的理论值大小,直接细胞ELISA测定证明表达产物scFvAP融合蛋白具有结合人TfR和AP活性的双重功效。结论抗人scFvAP融合蛋白表达载体构建成功,表达产物具有结合人TfR和AP活性的双重功效,为其临床检测应用奠定了基础。     

抗TfR scFv-SLC融合蛋白的构建、表达与鉴定

目的:构建、表达和鉴定抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体(scFv)-次级淋巴组织趋化因子(SLC)融合蛋白.方法:以pDsRed2-N1-CCL21为模板,设计引物,采用PCR扩增得到两端有EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点的SLC基因.以EcoRⅠ、NotⅠ双酶切pET28a+scFv载体和PCR产物,连接后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导TfR scFv-SLC融合蛋白的表达.SDS-PAGE、Western blot分析TfR scFv-SLC的表达特性.FCM测定scFv-SLC与肿瘤细胞结合活性.结果:EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定可见约350 bp的小片段,与SLC的理论值相符,DNA测序结果表明含有TfR scFv-Linker-SLC序列,表明pET28a+scFv-SLC融合基因表达载体构建成功.IPTG诱导产物经SDS-PAGE分析可见约41 kD的条带,符合scFv-SLC理论值.FCM结果显示TfR scFv-SLC可与MCF-7、HepG2细胞结合,且结合的阳性率较TfR scFv有所提高.结论:成功构建与表达scFv-SLC融合蛋白,且能与MCF7、HepG2等细胞特异性结合.     

人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定

目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定。方法:从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,用直接PCR及半巢式PCR扩增人抗体重链(VH)及轻链(Vκ和Vλ)可变区基因。采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL(Vκ和Vλ)基因连接成人单链抗体(scFv)基因,并将scFv文库基因克隆到噬菌体载体pCANTAB-5E中,电转化E.coliTG1,构建单链抗体文库。结果:采用直接PCR和半巢式PCR扩增得到42条VH基因片段,16条Vκ基因片段,18条Vλ基因片段。混合的VH和VL等摩尔比连接后,产生的单链抗体文库基因大小为750bp左右;转化后构建了文库容量为1.35×108的单链抗体文库。BstNⅠ酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示,酶切得到的scFv指纹图谱均不相同。结论:构建的抗体文库多样性好,可用于多种人源性单链抗体的筛选。     

抗人乙酰胆碱受体scFv-人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:制备抗人乙酰胆碱受体单链抗体637(scFv637)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,提高scFv637的稳定性。方法:用PCR扩增人HSA基因,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体scFv637基因的载体pHEN2中构建重组载体pHEN2-scFv637-HSA。以重组载体转化E.coliHB2151,表达产物用斑点杂交试验检测,并以SDS-PAGE和Westernblot鉴定其融合蛋白的相对分子质量(Mr)。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,扩增的人HSA基因和融合基因的大小分别为1770bp和7054bp。构建的scFv637-HSA经测序证实核苷酸序列正确,并且正确克隆至载体的开放读码框架内。表达产物仅存在于pHEN2-scFv637-HSA转化的E.coliHB2151外周质裂解液中。表达的融合蛋白的Mr约为95900。结论:在E.coli中成功地表达scFv637-HSA融合蛋白,为进一步对其进行功能研究和应用奠定了基础。     

抗G7单链抗体-AP融合蛋白的构建、表达与鉴定

目的:为了便于临床检测,建立一种G17新型免标自指示剂,用原核表达系统表达抗胃泌素单链抗体融合蛋白(ScFv-AP).方法:通过构建重组质粒pET32a-scFv-AP,选择合适的感受态细胞Rosetta(DE3)及优化表达条件制得目的蛋白.利用固定化金属离子亲和层析技术得到纯品蛋白.再将其作为检测探针运用到双抗体夹心...     

抗转铁蛋白受体抗体的筛选和鉴定

目的:从全人源噬菌体抗体库中筛选抗转铁蛋白受体(TfR)的抗体。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,分两段反转录TfR胞外区cDNA,经两轮PCR后,获得胞外区基因。测序正确后,将其插入表达载体pPROEXTMHTa中,并在E.coliBL21(DE3)中表达。目的蛋白通过NiNTA金属螯合层析柱进行纯化、复性。用复性的TfR包被免疫管,从库容为1013cfu/L的全合成人源噬菌体单链抗体库中,筛选抗TfR的抗体。结果:得到约1.9kb的TfR胞外区基因,该基因以包涵体的形式在大肠杆菌中表达;利用纯化、复性的TfR从抗体库中筛选到了8个可与人TfR特异性结合的单链抗体。结论:利用TfR在大肠杆菌表达的复性产物,可以筛选到与天然TfR特异性结合的单链抗体。     

HCC特异性结合的scFv-AP融合蛋白的构建与表达

目的：构建与肝癌细胞特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白，并诱导表达。方法：提取从大型人源噬菌体抗体库中筛选的含有与HCC特异性结合的scFv-10基因的质粒，用SfiⅠ、NotⅠ分别酶切，连接至经同样双酶切后的原核分泌型表达载体pDAP2上，转化和筛选后，阳性细菌经IPTG诱导表达，细胞ELISA鉴定融合蛋白活性。结果：重组质粒经PCR扩增，Eco91Ⅰ单酶切及Eco91Ⅰ／NotⅠ双酶切鉴定，证明scFv-10基因已插入到原核分泌型表达载体pDAP2上。表达产物的定位分析表明融合蛋白主要分泌性表达到周质腔，细胞ELISA证明表达产物有与HCC结合的活性。结论：成功地构建并表达了与HCC特异性结合的单链抗体．AP融合蛋白，为其应用奠定了基础。     

抗人大肠癌单链抗体与绿色荧光蛋白融合基因的构建和表达

目的构建并表达绿色荧光蛋白(GFP)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,产生具有荧光的抗体。方法将鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的基因克隆到pET28a(+)-GFP的表达载体,转化到大肠杆菌BL21中进行融合基因ND-1-scFv/GFP诱导表达。Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离、纯化,免疫印迹和荧光显微镜方法验证融合蛋白的表达。结果 ND-1scFv被克隆到表达载体pET28a(+)-GFP中,诱导表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量为58kDa。SDS-PAGE灰度扫描结果显示纯化后的蛋白纯度为90%,荧光显微镜检测显示,表达有目的蛋白的大肠杆菌BL21具有明显的绿色荧光。结论成功构建并表达融合基因ND-1-scFv/GFP,为该单抗的肿瘤特异成像研究奠定了基础。E.coli     

二硫键稳定的抗肝癌单链抗体-PE38融合基因的构建、表达与功能检测

目的：制备高特异性有杀伤活性的新型抗肝癌免疫毒素。方法：应用适当的酶切位点，将二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体(dsFv)基因及PE38基因克隆入原核表达载体pTIG中。诱导表达上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化，用MTT比色法检测纯化表达产物的细胞毒活性。结果：目的融合蛋白在大肠杆菌中得到可溶性表达，表达产物的Mr为66000，表达量占菌体总可溶性蛋白量的21％。细胞毒实验表明，抗肝癌免疫毒素对肝癌细胞具有杀伤作用，而对正常肝细胞无损伤。结论：抗肝癌dsFv与PE38融合基因的成功构建及表达，为其作为抗肝癌药物的进一步研究打下了基础。     

病毒肽/HLA-A2与单链抗体融合蛋白介导病毒特异性CTL杀伤肿瘤细胞

目的 研究人工构建的病毒肽/HLA-A2复合物与抗转铁蛋白受体(CD71)单链抗体融合蛋白(HBC-A2/scFv)介导病毒特异性CTL杀伤肿瘤细胞的作用.方法 将HBC-A2/scFv融合蛋白结合到高表达CD71的肿瘤细胞表面,利用加载HBC抗原肽的 T2细胞在体外诱导产生抗原特异性CTL,用乳酸脱氢酶释放法检测CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤作用.结果 HBC-A2/scFv融合蛋白可结合于CD71阳性的肿瘤细胞K562、HepG2及U937表面,结合率分别为:37.30%±8.25%、27.20%±3.88%和21.80%±6.49%.体外诱导产生的CTL/HBC能杀伤结合有HBC-A2/scFv的K562、HepG2及U937细胞,杀伤率明显高于未结合HBC-A2/scFv的对照组(K562:42.08%±1.14%vs 8.07%±1.39%;HepG2:49.72%±1.59%vs12.46%±1.26%;U937:39.72%±3.26%vs 7.13%±1.48%).结论 HBC-A2/scFv融合蛋白能介导病毒特异性CTL杀伤肿瘤细胞,为肿瘤细胞免疫治疗提供了新的思路和实验依据.

Abstract：

Objective To study whether the HBC-A2/scFv fusion protein mediates killing of tumor cells by viral specific cytotoxic T cells. Methods The fusion protein was attached to the CD71-expressing, HLA class Ⅰ negative tumor cells. And then, cytolysis by viral peptide-specific CTLs which were generated by co-culture of peripheral blood lymphocytes from HLA-A2 positive donors with inactivated T2 cells pulsed with the viral peptide were tested by lactate dehydrogenase (LDH) releasing. Results The fusion protein can attach the active viral peptide/HLA-A2 complex to K562, HepG2 and U937 cells through binding of CD71 scFv to CD71 (37.30% ±8.25%, 27.20% ±3.88%, 21.80% ±6.49% ) and mediate cytotoxicity of viral peptide-specific CTLs against those cells in vitro ( K562: 42.08% ± 1.14% vs 8.07%± 1.39%; HepG2: 49.72% ± 1.59% vs 12.46% ± 1.26%; U937: 39.72% ± 3.26% vs 7.13% ±1.48% ). Conclusion This viral peptide/HLA-A2 complex targeted by CD71 scFv is able to redirect viral peptide-specific T-cell mediated immune responses against tumor cells.     

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建表达

背景：重组融合蛋白是根据凝血酶识别顺序将葡激酶与水蛭素串联而成的蛋白,具有双重功能,分子质量为23 ku,可在工程菌高密度发酵状态下获得高效表达。 目的：通过对工程菌进行高密度发酵,构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并探讨其构建可行性及表达价值。 方法：对工程菌进行高密度培养,并诱导表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白,对菌体进行离心收取,多次冻融后通过超滤、两部阴离子交换层析方法收集上清液,对重组葡激酶-水蛭素融合蛋白进行分离纯化,观察其纤溶比活性及在菌体中的高效表达价值。 结果与结论：发酵培养工程菌,并在第17小时时予以诱导。结果发现,诱导0.5 h时,便能观察到重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达,且发酵时间越长重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达量相应越大;至发酵20 h时,表达达到顶峰。菌体干质量为32.20 g/L,目的蛋白表达量约为1.48 g/L。经过纯化处理后,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯度高达98%,纤溶比活性约为2.6×10⁴ IU/mg,回收活性的概率为56%。实验通过构建重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯化工艺,并分析其表达价值,提示该纯化工艺较为便捷,耗时较短,且能重复使用,可用于大规模生产。     

乳腺癌相关的乳腺珠蛋白基因的克隆、表达及纯化

目的 克隆人乳腺珠蛋白(hMAM)基因,原核表达重组蛋白并纯化,为建立一种新的乳腺癌诊断方法奠定基础.方法 从人乳腺癌组织中提取总RNA,经RT-PCR合成cDNA,设计特异性的引物,用PCR的方法扩增出目的片段,构建PET-32A-hMAM和PGEX-4T1 -hMAM表达载体,在BL21菌中表达hMAM重组蛋白,纯化,并进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定.结果 经RT-PCR、PCR扩增后得到一条207 bp的DNA片段,构建载体后DNA测序,结果与预期序列一致.表达和纯化的融合蛋白相对分子质量大约为28 000,与预期结果一致.结论 成功克隆hMAM基因,并获得高纯度的hMAM重组蛋白,为进一步开发hMAM诊断试剂打下基础.     

Tat融合蛋白表达载体TAT-SOX2的克隆化及蛋白表达研究

目的 构建重组表达载体TAT-SOX2,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白.方法 经PCR获得编码人SOX2的全基因序列,连接到原核表达载体PET-28b-TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-SOX2,转化大肠埃希菌,IPTG诱导TAT-SOX2融合蛋白的表达.表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化融合蛋白,并应用Western Blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光检测融合蛋白转导HSF细胞的效果.结果 成功构建了TAT-SOX2融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白,Western Blot鉴定正确.免疫荧光提示融合蛋白可快速转导入HSF细胞内.结论 为进一步的通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供了物质基础.     

hIL—2／mGM—CSF融合蛋白的构建及表达

目的构建hIL-2/mGM-CSF原核表达载体,获得具有hIL-2和mGM-CSF活性的hIL-2/mGM-CSF融合蛋白.方法利用PCR重叠延伸术,将人白细胞介素-2(hIL-2)和鼠粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)基因,通过2个脯氨酸(Pro)基因的中间接头连接起来,扩增出hIL-2/mGM-CSF融合基因,并克隆于表达载体pBV220和pLY4中.结果获得序列正确的hIL-2/mGM-CSF融合基因,并在大肠杆菌中成功表达,表达率在20%左右.活性测定其hIL-2活性为4.5×105U/mg,mGM-CSF活性为3.85×106U/mg.结论获得了具有hIL-2和mGM-CSF活性的hIL-2/mGM-CSF融合蛋白,为研究hIL-2/mGM-CSF融合蛋白的新生物学功能奠定基础.     

TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白原核载体的构建及表达

目的：构建蛋白质转导结构域（protein transduciton domain,PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶（targeted ribonuclease,TR）融合蛋白的原核表达载体。并在大肠杆菌中表达。方法：将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因，乙肝病毒核心蛋白（HBVcore protein,HBVc)基因，人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素（human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因，克隆入含PTDTAT的pTAT原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）LysS内，以I：PTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果：成功地构建了乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其两个对照的融合蛋白原核表达载体，并在IPTG诱导下获得特异性表达。结论：Tat-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白的构建。为体内应用靶向核酸酶治疗乙型肝炎奠定了基础。     

GST-hVinexin融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-hVinexin融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hVinexin基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hVinexin,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果电泳后酶切结果证实hVinexin大小为990bp,测序证明成功构建了原核表达质粒GST-hVinexin,并诱导表达GST-hVinexin融合蛋白,进一步用Western blot方法验证了其融合蛋白的表达。结论成功构建了GST-hVinexin原核表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌表达,为进一步纯化Vinexin及研究其结构与功能提供了前提基础。     

Construction and expression of hTNF-alpha fusion protein mediated by MMP1

This paper is aimed to present a research on fusion protein of human tumor necrosis factor-alpha (hTNF-alpha), matrix metalloproteinase 1 (MMP1), and foldon sequence using the methord of gene engineering. We transformed the recombinant plasmid, which contains the DNA sequences of hTNF-alpha, MMP1, and foldon sequence, into Rosetta2, and successfully induced the fusion protein to express under given conditions by isopropyl beta-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG). Then we purified the expression product through a glutathione S-transferase (GST) resin and collected the interested protein. This research may lay the groundwork for scientific research and clinical application.     

CD146基因重组质粒的构建及蛋白表达

目的构建CD146原核、真核表达载体,证实融合蛋白在原核细胞的诱导表达以及在胃癌细胞内的表达和定位。方法提取人黑色素瘤细胞A875的总mRNA并进行反转。以反转录的cDNA为模板PCR扩增CD146全长编码基因,分别克隆至pCDNA3.1-myc/his以及pGEX-4T-3表达载体中。原核重组质粒鉴定后转入BL21细胞中并经了诱导表达及纯化,真核表达质粒转入胃癌MKN45细胞中,分别利用westernblot和激光共焦扫描显微技术检测了重组质粒的表达以及在胃癌细胞中的定位。结果 CD146全长基因序列克隆到原核、真核表达载体中,酶切鉴定片段为1930bp。原核诱导出了GST-CD146并进行了纯化,CD146在真核细胞中表达为113KD的糖蛋白,Westernblot检测到真核转染的myc/his-CD146表达,条带约为120KD,免疫荧光显示蛋白定位在胃癌MKN细胞膜。结论成功构建了CD146原核、真核表达载体,融合蛋白在胃癌MKN45细胞表达。