PARP-1及其抑制剂在卵巢癌治疗中的研究进展

卵巢癌早期症状隐匿,临床发现时多属于疾病晚期,其死亡率在妇科恶性肿瘤中最高。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)在卵巢癌中高表达,它与卵巢癌的发展、侵袭和预后有密切联系。PARP-1抑制剂可与存在同源重组修复缺陷的肿瘤细胞发生协同致死作用,但不会杀伤正常细胞,若抑制PARP-1介导的单链DNA修复将导致DNA开始半保留复制,随后造成双链DNA损伤,从而导致细胞死亡。因此,PARP-1成为目前卵巢癌靶向治疗的热点。未来,应进一步研究PARP-1及其抑制剂的作用机制和它们的代表药物在卵巢癌中的靶向治疗。     

低表达Cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴定

目的:构建针对核心结合因子a1(Cbfa1)的mU6小干扰RNA载体,并将其转染到人牙周膜细胞hPDLCs,观察其干扰效果,以期建立稳定的低表达Cbfa1基因的hPDLCs模型. 方法:设计针对Cbfa1基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经双酶切线性化的小干扰载体mU6中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定. 以脂质体法将mU6空载体和重组质粒分别导人hPDLCs细胞系. 用含G418的培养液筛选,挑取阳性克隆后用RT-PCR技术检测各hPDLCs克隆内Cbfa1 mRNA水平的表达情况. 结果:经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒Cbfa1-siRNA中插入的目的基因片段与预计片段完全一致. G418筛选转染细胞4wk后获得稳定转染mU6空载体的细胞克隆株hPDLCs-mU6和稳定转染重组质粒的细胞克隆株hPDLCs-siRNA. 经RT-PCR鉴定,Cbfa1在hPDLCs-siRNA细胞中的表达比对照细胞明显降低. 结论:成功构建了针对Cbfa1的小干扰RNA载体,成功建立了稳定的低表达Cbfa1的hPDLCs模型,为进一步研究Cbfa1的功能奠定了实验基础.     

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制Bmi-1基因表达对MCF-7细胞的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)抑制Bmi-1基因表达后对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡和增殖的影响.方法:将表达Bmi-1短发夹RNA(shRNA)的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si瞬时转染MCF-7乳腺癌细胞株,携带针对绿色荧光蛋白干扰序列的载体pSuper-retro/GFPsi作为阴性对照.用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA,蛋白水平检测Bmi-1的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测MCF-7细胞周期和凋亡的变化.结果:pSuper-retro/Bmi-1si明显抑制MCF-7细胞Bmi-1 mRNA及蛋白表达.与空白对照组及阴性对照组相比较凋亡细胞数无明显增加;抑制Bmi-1基因表达使MCF-7细胞G1/S周期转换及细胞增殖速率受抑制.结论:表达shRNA的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si能显著抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Bmi-1基因表达,从而有效抑制MCF-7细胞增殖,为乳腺癌的基因治疗提供了实验依据.     

PARP-1基因多态性与临夏回族自治州回族人群胃癌易感性的关联研究

目的探讨聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)Val762Ala的单核苷酸多态与临夏回族自治州回族人群胃癌易感性的关系。方法采用病例-对照研究设计,研究对象为临夏回族自治州居民(20岁以上,居住满20年以上,3代无族外通婚)。分两组:胃癌组200例,均经组织学确诊。对照组210例,按年龄、性别进行匹配的无肿瘤史的健康回族志愿者。抽提血液DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)进行基因分型。使用ELISA(enzyme-linkedimmunosorbent assay)法检测血浆中H.pylori的IgG抗体,以检测研究对象是否有H.pylori感染。用SPSS 13.0统计软件分析试验结果。结果 PARP-1 762Val/Ala+Ala/Ala在胃癌组显著增高(OR:2.158,95%CI:1.404～3.315,P=0.020)。交互作用分析显示:家族史阳性的Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的风险是家族史阴性的Val/Val基因型的4.125倍(OR:4.125,95%CI:2.117～8.038,P=0.000);食腌菜的Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的风险是不食腌菜的Val/Val基因型的3.814倍(OR:3.814,95%CI:2.150～6.766,P=0.000);H.pylori感染阳性的Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的风险是H.pylori感染阴性Val/Val基因型的4.085倍(OR:4.085,95%CI:2.197～7.597,P=0.000)。结论 PARP-1 Val762Ala单核苷酸多态与临夏回族自治州回族人群胃癌易感性增高相关。PARP-1 Val/Ala+Ala/Ala基因型分别与家族史、食腌菜、H.pylori感染在胃癌的发病风险中存在着加乘交互效应。     

Dnd1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建小鼠Dnd1基因的RNAi慢病毒载体.方法:针对小鼠Dnd1基因RNAi设计有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA.退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的舍Dnd1...     

卵巢癌化疗前后肿瘤组织中PARP-1的表达及其与细胞上皮间质转化的相关性

目的:研究卵巢癌化疗前后肿瘤组织中PARP-1的表达及其与细胞上皮间质转化的相关性。方法:选择在本院接受紫杉醇联合卡铂方案(TC方案)化疗的晚期卵巢癌患者,化疗前和化疗后4个周期时分别采集肿瘤组织,测定PARP-1、上皮间质转化标志分子、血管新生分子的mRNA表达量。结果:化疗后,卵巢癌组织中PARP-1、Snail、ZEB1、N-cadherin、Vimentin、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、Ang-2、Tie-2的mRNA表达量显著低于化疗前,E-cadherin的mRNA表达量显著高于化疗前;化疗后PARP-1低表达卵巢癌组织中Snail、ZEB1、N-cadherin、Vimentin、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、Ang-2、Tie-2的mRNA表达量显著低于PARP-1高表达卵巢癌组织,E-cadherin的mRNA表达量显著高于PARP-1高表达卵巢癌组织。结论:TC方案化疗能够通过抑制卵巢癌病灶内PARP-1的表达来抑制上皮间质转化及血管新生过程。     

RNAi沉默Polo-like kinase-1基因表达对大肠癌细胞端粒酶活性的影响

 目的 探讨polo-like kinase-1（PLK1）基因对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。 方法根据PLK1基因序列特点,设计并用化学方法合成小干扰核糖核酸分子（small interfering RNA,siRNA）,转染人大肠癌SW480细胞后,分别采用实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因mRNA和蛋白表达水平。分别采用MTT法和TRAP-ELISA方法检测PLK1基因转染对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。 结果 所设计的5个siRNA均能明显抑制大肠癌SW480细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好。以P4转染处理大肠癌细胞后,PLK1 mRNA水平和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。MTT和TRAP-ELISA方法检测发现,P4siRNA转染组细胞增殖和端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.05,P＜0.05）。 结论 PLK1基因对大肠癌细胞增殖具有重要的调控作用,以PLK1 siRNA转染处理大肠癌细胞,可明显抑制大肠癌细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关。     

人参皂苷Re对人脐静脉内皮细胞 PARP-1表达的抑制作用

目的：筛选对多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1（PARP-1）有潜在抑制作用的中药单体,研究中药单体对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）PARP-1表达的抑制作用。方法在中国天然产物数据库中通过计算机虚拟筛选初步得到对PARP-1有潜在抑制作用的6种中药单体,对加入中药单体的细胞分设高、低剂量组,浓度分别为1×10-4、1×10-6 mol/L,另将加入3-氨基苯甲酰胺（3-AB）的细胞作为阳性对照组、只加2×10-4 mol/L ONOO -的细胞作为模型组。Western blotting检测PARP-1表达。若待筛药物对PARP-1表达有抑制作用,则以1×10-4～1×10-8 mol/L的药物进行浓度依赖性实验。结果1×10-4、1×10-6 mol/L人参皂苷Re与1×10-4 mol/L人参皂苷Rb1对ONOO -引起的PARP-1激活有抑制作用。1×10-4～1×10-8 mol/L人参皂苷Re对 PARP-1的表达有明显的抑制作用,且呈现出剂量依赖性（P＜0．05）。结论人参皂甙Re对HUVEC上ONOO -激活的PARP-1蛋白表达有抑制作用,对ONOO -引起的细胞损伤具有保护作用,其效应呈现出剂量依赖性。     

CRBP-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol-binding protein-I,CRBP-1)基因RNAi(RNA interfer-ence,RNAi)慢病毒载体。方法:针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的含CRBP-1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论:成功构建大鼠CRBP-1基因RNAi慢病毒载体。     

低剂量氢醌对大鼠骨髓间充质干细胞生物学性状及PARP-1表达的影响

目的：探讨低剂量氢醌(HQ)对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）生物学性状及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)基因表达的影响,阐明低剂量HQ对骨髓的毒效应。方法：磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0和10.0 μmol•L^-1 HQ染毒大鼠BMSCs为处理组。应用Cell Counting Kit-8试剂盒检测细胞活力和细胞增殖能力,通过磷脂结合蛋白(Annexin V) /碘化丙啶(PI)标记的流式细胞技术检测细胞凋亡,用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PARP-1基因表达的改变。结果：与PBS对照组比较,各剂量组细胞增殖能力明显提高(P<0.05);染毒48 h后,5.0和10.0 μmol•L^-1 HQ组细胞的凋亡率均明显降低(P<0.05);染毒48 h后,2.5、5.0和10.0 μmol•L^-1 HQ组细胞PARP-1表达量分别为对照组0.92、0.56(P<0.05)和0.45倍(P<0.05)。结论：低剂量HQ能抑制大鼠BMSCs凋亡和PARP-1基因表达,促进细胞增殖。     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。     

RNAi干扰HMGB1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的 探讨高迁移率族蛋白1 (high mobility group box 1,HMGB1 )siRNA干扰后对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响.方法 构建靶向HMGB1 mRNA的质粒载体pRI-GFP-1、pRI-GFP-2以及阴性对照载体pRI-GFP-Neg,分别转染乳腺癌细胞MCF-7,48 h、72 h后免疫印迹法(Western blot)检测HMGB1基因蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测体外增殖活性.结果 转染后,与空质粒组pRI-GFP-Neg相比,pRI-GFP-1组、pRI-GFP-2组MCF-7细胞HMGB1蛋白表达下降,MTT显示干扰组细胞增殖速率与质粒对照及空白对照组相比显著降低.结论 应用RNAi技术可以显著干扰HMGB1蛋白的表达,进而有效抑制MCF-7细胞的增殖活性.     

特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因SiRNA表达载体的构建、鉴定及对高糖状态下INS-1细胞周期的影响

目的 构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响.方法 根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至INS-1细胞中,Westernblotting观察PTH1R表达,鉴定其转染效率,筛选出最佳抑制基因后,应用流式细胞仪检测25mmol/LD-葡萄糖处理INS-1细胞周期.结果 菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确.并能成功转染到INS-1细胞株中,Westernblot筛选最佳抑制基因.细胞周期检测提示PTHIR沉默后抑制INS-1细胞从G0/G1期进入S期.结论 成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,高糖状态下PTH1R表达可能为INS-1细胞自我保护的一种作用.     

人气道上皮细胞内皮素转换酶-1反义RNA构建

目的　研究内皮素转换酶 -1(ECE -1)反义RNA对人气道上皮细胞ECE -1表达的抑制作用。方法　构建ECE -1反义RNA表达载体 ,用脂质体 (FuGENG 6)转染人气道上皮细胞株 (16HBE) ,G418筛选得到稳定表达反义ECE -1RNA的细胞株 (anti -16HBE)。RT -PCR检测转染细胞ECE -1mRNA的表达 ,Westernbloting检测细胞ECE蛋白表达情况。结果　①经酶切及DNA测序鉴定证明 ,0 7kb的ECE -1DNA片段反向连接到带有萤光蛋白基因为报告基因的pEGPC1表达载体 ;荧光倒置显微镜显示大量细胞分泌荧光蛋白并能反复传代稳定表达 ;②anti -16HBE细胞ECEmRNA基因表达 (ECE/actinβ 0 0 12 5± 0 0 5 8)比 16HBE细胞 (ECE/actinβ 0 13 4 7± 0 0 67)明显低 (P <0 0 5 ) ;而Westerbloting亦显示anti -16HBE细胞ECE表达量比 16HBE细胞明显低。结论　ECE反义RNA表达载体可抑制人气道上皮细胞ECE -1表达与分泌     

DNMT1靶向RNAi重组体对胃癌细胞周期的影响

目的 :本研究利用RNA干扰 (RNAinterfering ,RNAi)技术 ,以DNMT1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因 ,设计构建重组体 ,研究其对胃癌细胞周期的影响。方法 :设计有小发夹结构的两条DNA序列 ,经退火成互补双链 ,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体 ,经鉴定正确后 ,转染胃癌细胞AGS ,最后使用流式细胞仪分析细胞周期。结果 :转染后的胃癌细胞的S期细胞较前有明显减少 ,G2 -M期细胞明显增多。结论 :DNMT1靶向RNA干扰重组体转染到胃癌细胞中后促使S期细胞进入G2 -M期 ,最后衰老死亡。从而为肿瘤的治疗开辟了新途径。     

RNAi逆转肾癌细胞MDR1基因表达导致的替尼泊苷耐药

目的：研究RNA干扰（RNAinterference,RNAi）对肾癌细胞多药耐药基因（MDRl）表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对替尼泊苷（VM一26）敏感性的变化。方法：根据MDRI基因设计3条小干扰RNA（smalJinterferingRNA,siRNA）序列,在质粒的介导下转染肾癌A498细胞,RT—PCR法分析转染前后MDRlmRNA表达水平,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT—PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆,Westernbolt法检测MDRl蛋白表达水平,MTT法对比干扰前后替尼泊苷对细胞半抑制浓度（ICSO）的变化。结果：3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDRl基因的表达,其中siRNA一1序列能更有效地封闭MDRl基因,使MDRlmRNA表达水平下降67％;筛选出的稳转细胞株与未干扰细胞株相比,MDRl蛋白表达量明显下降,并使替尼泊苷对细胞的IC50降低约79．8％,差异具有统计学意义（P〈O．01）。结论：RNAi可抑制肾癌A498细胞MDRl基因的表达从而逆转其对替尼泊苷的耐药,使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能。     

EB病毒BARF1基因对人胃上皮细胞恶性转化的作用

目的 探讨EB病毒编码BARF1基因在人胃上皮细胞恶性转化中的作用.方法 用携带BARF1基因的真核载体PIRES2-EGFP/BARF1,转染人胃上皮细胞系GES-1,通过G418筛选,获得稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株.GES-1细胞被分为4组,包括1个转染BARF1基因的细胞组,1个转染BARF1基因并...     

人支架蛋白IQGAP1-shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 制备携带人支架蛋白IQGAP1基因小分子干扰RNA的重组慢病毒.方法 分别设计合成针对IQGAP1的4个shRNA慢病毒干扰载体;分别转染293T细胞,利用Western blot验证shRNA的沉默效果,选择其中一个沉默效果较好的shRNA慢病毒干扰载体同源重组产生Lentivirus- IQGAP1-shRNA并测定病毒滴度.结果 测序证实,构建携带IQGAP1-shRNA的慢病毒载体具有较好的沉默靶基因的效果,包装慢病毒,病毒滴度为2.0×l010TU/ml.结论 成功制备携带IQGAP1-shRNA的重组慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒.