海马脑片锥体神经元钙离子通道动力学特性的盲法膜片钳研究

目的 观察大鼠海马脑片盲法全细胞记录技术研究CA1区锥体神经元电压门控性Ca^2+通道的动力学特征，为在海马脑片上进行神经科新药开发提供依据。方法 选用出生20-30d的Wistar雄性大鼠20只，断头取脑，将海马切为厚400μm的薄片，解剖镜下选CA1区锥体神经元细胞线行盲法全细胞记录。结果 大鼠海马脑片CA1区锥体神经元电压门控性Ca^2+通道电流具有如下特点：①激活的阈电位偏低，为(-49&;#177;9)mV，范围为-65～-30mV(n=23)。②衰减时间常数τ值较大，且变化范围大(100-700ms)(n=12)，并且衰减具有Ca^2+电流幅值的依赖性。③稳态失活呈现电压依赖性，半失活电压为(-55&;#177;10)mV，斜率因子为(5．3&;#177;O．9)(n=10)。④当细胞外Ca^2+浓度为2．5mmol／L时，Ca^2+通道的反转电位为(55&;#177;13)mV(n=10)。⑤尾电流成分较为单一，不表现电压依赖性。另外，Ca^2+电流对戊脉胺及双氢吡啶娄化合物硝苯地平均不敏感。结论 海马脑片CA1区锥体神经元上的Ca^2+通道主要以N型为主．     

姜黄素通过新型蛋白激酶-θ亚型抑制大鼠海马神经元中通道的研究

目的探讨姜黄素对Ca2+通道电流的选择性抑制作用。方法使用10 mmol/L的钡离子作为电荷载体,利用膜片钳技术记录大鼠海马神经元的全细胞电流;免疫印迹法检测大鼠海马神经元中蛋白激酶C(PKC)的分型;进行全细胞膜片钳技术分析。结果姜黄素浓度依赖性抑制高电压门控Ca2+通道电流(IBa),姜黄素对Ca2+型通道的激活无显著影响,但能够使Ca2+通道的失活曲线向超极化方向移动;此外,在体外培养的大鼠海马神经元中,细胞内应用PKC-θ的抑制肽PKC-θ-IP,能消除黄素诱导抑制的作用;新型PKC-δ、PKC-ε和PKC-θ,但不包括PKC-η在神经元中内源性表达。结论姜黄素在大鼠海马神经元中通过新型的PKC-θ依赖途径抑制IBa,这个结论可能有利于证明姜黄素的神经保护作用。     

离体海马脑片CA1区锥体细胞缺氧期间电生理指标变化与N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂MK801干预后的变化

背景海马CA1区锥体细胞是对缺血缺氧性损伤最为敏感的神经元,缺血缺氧后海马CA1区锥体细胞膜电位表现为缺氧早期细胞膜的超极化,随着缺氧时间的延长,细胞膜发生缓慢去极化及快速去极化,引起神经元不可逆性损伤.目的应用细胞内记录技术,观察N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂MK801对离体海马脑片CA1区锥体细胞缺氧期间电生理指标的变化.设计观察对比实验.单位解放军第九七医院,徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室,Healthy-Science Center,State University of New York.材料实验于2002-09/2003-02在美国纽约州立大学医学中心完成.选择成年雄性SD大鼠5只,预吸纯氧3 min后以体积分数为0.02的异氟醚麻醉,快速断头取脑,制备离体海马脑片.方法大鼠海马脑片随机分为单纯缺氧组和MK801组,每组10个.单纯缺氧组海马脑片给予10 min缺氧;而MK801组的海马脑片在缺氧前10 min及10 min的缺氧期间分别应用100 μmol/L的MK801.所有脑片均给予60 min的复氧.应用细胞内记录技术记录海马CA1区神经元缓慢去极化及快速去极化的时间、快速去极化的幅度.在复氧末,应用细胞内注入电流及经Schaffer通路刺激,观察神经元对刺激的反应.主要观察指标①两组海马CA1区锥体神经元缓慢去极化速率.②两组海马CA1区神经元的快速去极化时间.③两组海马CA1区神经元的快速去极化幅度.④MK801对海马CA1区神经元功能恢复的影响.结果①海马CA1区锥体神经元缓慢去极化速率单纯缺氧组显著高于MK801组[(0.20±0.05)mV/s,(0.08±0.03)mV/s,(P＜0.05)].②海马CA1区神经元的快速去极化时间MK801组显著高于单纯缺氧组[(537±139)s,(261±26)s,(P＜0.05)].③海马CA1区神经元的快速去极化的幅度MK801组显著小于单纯缺氧组[(4±13)mV,(53±7)mV,(P＜0.05).④在复氧末期,MK801组的10个神经元中,9个神经元恢复对刺激的反应.结论N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂MK801可以显著降低缺氧引起的神经元缓慢去极化速率,延缓神经元快速去极化的发生及降低快速去极化的幅度,说明N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂可显著减轻神经元的缺氧性损伤,促进复氧后神经元功能的恢复.     

氟哌利多对大鼠脑缺血海马CA1区锥体细胞持续钠通道电流的影响

背景脑缺血后离子通道通透性的异常和神经细胞内外离子平衡的紊乱是缺血性脑损伤的重要因素,钠通道激活引起的去极化是脑缺血损伤的始动环节.目的采用膜片钳技术测定氟哌利多对脑缺血海马CA1区锥体细胞持续性钠通道电流的影响,分析氟哌利多是否对脑缺血损伤产生保护?设计随机对照动物实验.单位上海交通大学附属第六人民医院麻醉科,上海交通大学附属第一人民医院麻醉科.材料实验于2002-04/2003-04在上海交通大学附属第一人民医院麻醉实验室完成.选择出生10～14 d未断乳的SD大鼠14只,每只鼠各选择2个海马CA1区细胞,共28个细胞,随机分为4组缺血对照组、氟哌利多3 μmol/L组、氟哌利多10 μmol/L组、氟哌利多30μmol/L组,7个/组. 方法酶消化法急性分离全部大鼠脑海马CA1区锥体细胞,通过低氧和无糖法制备神经元缺血模型.选择贴壁良好、呈三角形或星形、胞体较亮,折光性良好、突起明显、胞浆均匀一致、核仁明显的细胞用于实验.采用"Y-tube"系统快速给药,氟哌利多3,10,30 μmol/L组各自给予氟哌利多3,10,30μmol/L,缺血对照组不给药.全细胞膜片钳技术记录各组持续钠电流的基础值以及缺血3 min和5 min时钠通道电流的变化.主要观察指标①脑海马CA1区神经元正常持续钠电流的记录.②脑缺血时海马CA1区神经元持续性钠电流的记录.③不同浓度氟哌利多对脑缺血时持续性钠电流的影响.结果实验选用14只大鼠脑海马CA1区的28个细胞,全部进入结果分析.①脑海马CA1区神经元正常持续钠电流的记录使用钙通道阻滞剂CdCl2 0.5 mmol/L及钾通道阻滞剂TEA 20 mmol/L,在钳制电压-105 mV、刺激电压-30 mV下给予长为400 ms的方波刺激,可记录到一个较小的、激活较晚且持续时间较长的内向电流,经河豚毒素阻断证实为持续性钠电流.②脑缺血时海马CA1区神经元持续性钠电流的记录缺血对照组缺血3 min时持续钠电流增加为正常情况的(1.60±0.21)倍,缺血5 min时持续钠电流增加为正常情况的(2.87±0.45)倍,差异显著(P＜0.05).③不同浓度氟哌利多对脑缺血时持续性钠电流的影响缺血对照组、氟哌利多3,10,30 μmol/L组持续钠电流的基础值分别是(77.42±15.17)pA,(87.44±21.56)pA,(84.13±20.06)pA,(80.22±19.30)pA,组间比较差异无显著性意义.缺血5min后氟哌利多3,10,30μmol/L组持续性钠电流分别为(105.36±17.16)pA,(94.74±18.88)pA,(84.88±13.94)pA,明显低于缺血对照组(218.31±29.34)pA.结论在钳制电压-105mV、刺激电压-30mV条件下,脑缺血损伤时持续性钠电流增加,氟哌利多可能通过抑制持续性钠电流的增强而发挥神经元保护作用.     

离体海马脑片CA1区锥体细胞缺氧期间电生理指标变化与N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂MK801干预后的变化

背景：海马CA1区锥体细胞是对缺血缺氧性损伤最为敏感的神经元，缺血缺氧后海马CA1区锥体细胞膜电位表现为缺氧早期细胞膜的超极化，随着缺氧时间的延长，细胞膜发生缓慢去极化及快速去极化，引起神经元不可逆性损伤。目的：应用细胞内记录技术，观察N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂MK801对离体海马脑片CA1区锥体细胞缺氧期间电生理指标的变化。设计：观察对比实验。单位：解放军第九七医院，徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室，Healthy-Science Center,State University of New York．材料：实验于2002—09／2003—02在美国纽约州立大学医学中心完成。选择成年雄性SD大鼠5只，预吸纯氧3min后以体积分数为0．02的异氟醚麻醉，快速断头取脑，制备离体海马脑片。方法：大鼠海马脑片随机分为单纯缺氧组和MK801组，每组10个。单纯缺氧组海马脑片给予10min缺氧；而MK801组的海马脑片在缺氧前10min及10min的缺氧期间分别应用100μmol／L的MK801。所有脑片均给予60min的复氧。应用细胞内记录技术记录海马CA1区神经元缓慢去极化及快速去极化的时间、快速去极化的幅度。在复氧末，应用细胞内注入电流及经Schaffer通路刺激，观察神经元对刺激的反应。主要观察指标：①两组海马CA1区锥体神经元缓慢去极化速率。②两组海马CA1区神经元的快速去极化时间。③两组海马CA1区神经元的快速去极化幅度。④MK801对海马CA1区神经元功能恢复的影响。结果：①海马CA1区锥体神经元缓慢去极化速率：单纯缺氧组显著高于MK801组[（0．20&;#177;0．05）mV／s，（0．08&;#177;0．03）mV／s，（P〈0．05）]。②海马CA1区神经元的快速去极化时间：MK801组显著高于单纯缺氧组[（537&;#177;139）s，（261&;#177;26）s，（P〈0．05）]。③海马CA1区神经元的快速去极化的幅度：MK801组显著小于单纯缺氧组[（4&;#177;13）mV，（53&;#177;7）mV，（P〈0．05）。④在复氧末期，MK801组的10个神经元中，9个神经元恢复对刺激的反应。结论：N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂MK801可以显著降低缺氧引起的神经元缓慢去极化速率，延缓神经元快速去极化的发生及降低快速去极化的幅度，说明N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂可显著减轻神经元的缺氧性损伤，促进复氧后神经元功能的恢复。     

地佐环平对缺氧缺糖海马脑片CA1区Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达的影响

目的:观察N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体非竞争性拮抗剂MK-801对缺氧缺糖海马脑片CA1区Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达的影响。方法:新生6～9dSD大鼠断头取脑,制备海马脑片,将各孔脑片单纯随机分为3组,分别为正常对照组(HOTC)、单纯缺氧缺糖组(OGD)和预加MK-801再缺氧缺糖组(MK-801+OGD)。海马脑片进行缺氧缺糖培养,最后进行免疫组织化学染色和图像分析处理。结果:各组海马脑片CA1区均有不同程度Bcl-2,Bax蛋白表达。OGD组Bcl-2蛋白的表达(15.7±1.1)弱于HOTC组(18.5±0.9)和MK-801+OGD组(18.0±0.9),差异均有显著性意义(F=6.495,P<0.05);OGD组Bax蛋白的表达(13.1±2.5)强于HOTC组(7.3±1.1)和MK-801组(8.7±1.1),其差异均有显著性意义(F=9.770,P<0.05)。同时,OGD组CA1区出现细胞缺失形成的空洞,其他两组与OGD组相比有所减少。结论:MK-801可增强缺氧缺糖海马脑片CA1区Bcl-2蛋白的表达,降低Bax蛋白的表达,并减轻该区锥体细胞损伤程度。     

胶质细胞源性神经营养因子对大鼠海马神经元N-甲基-D-天冬氨酸诱发电流的保护作用

目的:研究N-甲基-D-天冬氨酸N-methyl-D-asparate,NMDA在大()鼠海马神经元上诱发电流的特性以及胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)对大鼠海马神经元NMDA诱发电流(IN)的影响。MDA方法:实验于2002-10/2003-02在解放军第二军医大学膜片钳研究室进行,运用常规全细胞膜片钳技术,在原代培养第七八天的大鼠海马神经元上记录IN,以及GDNF对INMDAMDA的影响,由Clampex8.0软件采样系统获得的图形,直接进入Clampfit8.0软件处理数据。结果:NMDA可在海马神经细胞上诱发出大的内向离子流。当钳制电压为-60mV时,细胞外单独给予GDNF(0.1,1.0,10.0μg/L)对静息膜电导及电压门控离子通道无影响。但细胞外同时给予NMDA(100μmol/L)和GDNF10μg/L时,IN()MDA的峰值为(-578.238±100.493)pA,INMDA的峰值被抑制(t=-7.248,P<0.01),峰值受抑制率为(21.502±7.898)%。洗去GDNF后,抑制作用消失。结论:NMDA诱发的电流呈现出明显的内向整流特性,GDNF能抑制海马神经元NMDA通道的兴奋性,从而发挥神经保护作用。     

急性缺氧对大鼠海马神经元N-甲基-D-天门冬氨酸诱发电流的影响

目的:研究N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-asparate,NMDA)在大鼠海马神经元上诱发电流的特性以及急性缺氧对大鼠海马神经元NMDA诱发电流(INMDA)的影响。方法:运用常规全细胞膜片钳技术,在原代培养第七八天的大鼠海马神经元上记录INMDA,并建立神经细胞体外急性缺氧模型,由Clampex8.0软件采样系统获得的图形,直接进入Clampfit8.0软件处理数据。结果:①在钳制电压为-60mV时,100μmol/LNMDA可在海马神经元上诱发出一大的内向电流,INMDA的峰值为(-745.461±123.731)pA。I-V曲线显示在钳制电压为正值时INMDA呈外向电流,而钳制电压为负值时则为内向电流。给予NMDA后,海马神经元上即刻诱发出内向电流,随后尽管持续给药20s,但INMDA开始发生衰减。②在钳制电压为-60mV时,海马神经元急性缺氧2min后,细胞外给予100μmol/LNM-DA可诱发一大而增强的INMDA,峰值为(-1670.49±202.09)pA,峰值显著增大(t=12.572,P<0.01),峰值增加率为130%。结论:NMDA诱发的电流呈现明显的内向整流性和失敏特性,急性缺氧能提高海马神经元NMDA通道的兴奋性,NMDA受体参与了兴奋毒性的产生。     

小剂量藜芦碱诱发大鼠脑海马CA1区锥体神经元异常放电癫痫脑片模型的特征

背景阵发性去极化漂移是癫痫活动的脑神经元的细胞学特征,过去认为其产生与突触传递异常有关.近年来,阵发性去极化漂移的内因机制得到进一步关注和重视.;目的观察小剂量藜芦碱诱发大鼠脑海马CA1区锥体神经元产生癫痫样活动的特征,探讨其可能的离子机制.设计探索性观察实验.单位解放军第四军医大学的神经科学研究所.材料实验于2002-10/2004-10在解放军第四军医大学神经科学研究所完成.选择出生后14 d的健康SD大鼠40只,所需试剂购自天津市医药公司和Sigma公司.干预大鼠经腹腔麻醉后取脑切片,通过0.5 μmol/L藜芦碱诱发癫痫样活动.在6张脑片上诱发产生阵发性去极化飘移样放电后,灌流液中加入80 nmol/L河豚毒素,在另外5张脑片上,用抗癫痫药物苯妥英(5μmol/L)替换河豚毒素,观察在不同药物作用下细胞电生理特性的变化.主要观察指标①细胞放电模式.②电压钳模式下通过细胞Ⅰ-Ⅴ反应计算河豚毒素敏感性持续性钠电流的大小.结果小剂量藜芦碱细胞外灌流后,随着神经元膜的超极化,大鼠CA1区锥体细胞表现出固定模式的阵发性去极化漂移串样放电,这种电活动可被小剂量(80 nmol/L)河豚毒素或(5 μmol/L)苯妥英所阻断.电压钳模式下测量阈下河豚毒素敏感性钠电流,在膜电位-55,-60,-65mV范围内,癫痫放电神经元测值明显增大,表明小剂量藜芦碱可增强持续性钠电流,并具有电压依赖性.结论小剂量藜芦碱可在大鼠脑海马CA1区锥体神经元上诱发出阵发性去极化漂移样癫痫活动.小剂量河豚毒素或苯妥英可阻断这种癫痫活动,其离子机制可能与持续性钠电流的增强有关.     

二氧化硫衍生物对大鼠海马神经元外向钾电流特性的影响

背景二氧化硫(SO2)及其衍生物是细胞染色体断裂剂和基因毒性因子,还可引起机体组织的氧化损伤和酶活性的改变.但是,从膜损伤的角度来研究SO2及其代谢衍生物的毒作用,特别是神经毒效应,尚不十分清楚.目的研究大鼠海马神经元去极化激活的外向钾电流的特征,并在此基础上初步探讨SO2衍生物对此外向电流的影响.设计完全随机设计,自身对照实验对照.地点和材料本研究的地点为山西大学环境医学与毒理学研究所.材料为Wistar大鼠,约40只,鼠龄7 d,体重8～10 g,雌雄不限.中国辐射防护研究院动物房提供.干预利用全细胞膜片钳技术.主要观察指标短时去极化至-60 mV以上电位引发的外向电流;SO2衍生物作用前后此外向电流幅度的变化.结果短时去极化至-60 mV以上电位可引发快速上升的外向电流,之后缓慢衰减至一平台.当保持电位改变时,该峰电流与平台电流的幅度均会发生变化,但变化幅度不同,提示此外向电流包括两种成分.试验中测得峰电流与平台电流的翻转电位分别为(-76.1±5.97)mV和(-83.6±4.13)mV,与用Nerst方程计算出的本试验细胞外液与电极内液的钾离子平衡电位Ek=-88 mV接近,说明该外向电流是钾电流.SO2衍生物可剂量依赖地增大此两种成分的外向钾电流,使二者增大50%的剂量分别为26.19μmol/L和14.50 μmol/L.结论SO2代谢衍生物对大鼠海马神经元电压依赖性外向钾电流的增大作用,可导致神经元细胞内K+通过K+通道的外流,胞内K+浓度降低,造成中枢神经系统损伤.     

利多卡因惊厥对大鼠空间学习能力的影响

目的研究利多卡因对海马的神经毒性是否会对大鼠空间学习记忆能力产生影响,并探讨大鼠空间学习能力的变化与海马CA3区锥体细胞数目的相关性。方法将成年Wistar雄性大鼠随机分为基础值组(n=7)和利多卡因惊厥组(n=40)。基础值组大鼠静脉给予生理盐水后使用Y迷宫测定大鼠的空间学习能力。利多卡因惊厥组大鼠尾静脉持续输注利多卡因造成惊厥,待大鼠恢复正常运动以后放入鼠笼重新饲养。并于惊厥后第1、3、5、7天从中随机抓取大鼠测试其空间学习能力以及组织学改变。根据对应天数将利多卡因惊厥组的40只大鼠随机细分为Day-1、Day-3、Day-5、Day-7亚组,每亚组10只。所有大鼠在测定空间学习能力之后立即处死,取出大脑并做石蜡包埋,冠状面切片后进行组织学检测,显微镜下评估海马CA3区锥体细胞状态。结果①基础值组和Day-1、Day-3、Day-5、Day-7亚组大鼠的Y迷宫穿梭次数分别为(25.2±3.7)、(27.1±8.1)、(36.9±9.9)、(38.7±10.6)、(40.6±16.3)次,除Day-1亚组与基础值组比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各亚组与基础值组差异均有统计学意义(P<0.05);②与基础值组单位面积(10.3±4.5)个(异常锥体)细胞比较,利多卡因惊厥组大鼠海马CA3区异常锥体细胞数增加,Day-1、Day-3、Day-5、Day-7亚组计数值分别为13.0±7.2、15.6±5.0、19.6±8.1、18.1±5.1,且与大鼠Y迷宫穿梭次数呈正相关(r=0.711,P<0.05)。结论利多卡因引起的惊厥使成年大鼠海马依赖性空间学习能力下降,利多卡因的神经毒性引起的海马异常锥体细胞增多可能是造成这一现象的一种原因。     

Benzodiazepine withdrawal-induced glutamatergic plasticity involves up-regulation of GluR1-containing alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in Hippocampal CA1 neurons

Modification of glutamatergic synaptic function, a mechanism central to neuronal plasticity, may also mediate long-term drug effects, including dependence and addiction. Benzodiazepine withdrawal results in increased glutamatergic strength, but whether alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid (AMPA) receptors (AMPARs) are functionally and structurally remodeled during benzodiazepine withdrawal is uncertain. Whole-cell recordings of rat hippocampal CA1 neurons, either acutely dissociated or in hippocampal slices, revealed that AMPAR function was enhanced up to 50% during flurazepam (FZP) withdrawal, without changes in whole-cell channel kinetic properties. Agonist-elicited AMPA currents showed a negative shift in rectification in the presence of spermine, suggesting augmented membrane incorporation of glutamate receptor (GluR) 2-lacking AMPARs. As GluR1-containing AMPARs are critical for activity-dependent alterations in excitatory strength, we sought to determine whether changes in GluR1 subunit distribution in CA1 neurons occurred during benzodiazepine withdrawal. Confocal image analysis revealed that FZP withdrawal promoted GluR1 subunit incorporation into somatic and proximal dendritic membranes of CA1 neurons without GluR2 subunit alterations. Findings of immunoblot studies were consistent with immunofluorescent studies indicating increased GluR1, but not GluR2, subunit protein levels in cytosolic, crude membrane and postsynaptic density-enriched fractions from CA1 minislices. As with long-term potentiation (LTP), the FZP-withdrawal-induced GluR1 incorporation into CA1 neuron membranes may require the GluR1-trafficking protein, synapse-associated protein 97, which was also elevated in membrane-associated fractions. Together, our findings provide evidence that during FZP withdrawal, increased membrane incorporation of GluR1-containing AMPARs and associated up-regulation of AMPAR functions in hippocampal CA1 pyramidal neurons share fundamental similarities with the mechanisms underlying LTP. This implies that glutamatergic neuronal remodeling observed in LTP also subserves physiological adaptations to drug withdrawal.     

虎纹捕鸟蛛毒素对脑缺血模型大鼠海马肿瘤坏死因子凋亡通路的影响

背景：虎纹捕鸟蛛毒素经离子通道分析技术证明是一种作用于突触前膜的N型钙离子通道阻断剂。目的：观察新型钙通道拮抗剂虎纹捕鸟蛛毒素对全脑缺血再灌注损伤模型大鼠海马组织肿瘤坏死因子凋亡通路中肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase8表达的影响。方法：采用Pulsineli“四血管阻断法”构建全脑缺血结合蛛网膜下腔置管大鼠模型,通过留置的PE10管注入虎纹捕鸟蛛毒素或生理盐水。应用电镜、RT-PCR实验技术检测全脑缺血再灌注损伤大鼠海马CA1区锥体细胞超微结构和胞内线粒体形态变化及对海马组织中肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase8等肿瘤坏死因子凋亡通路相关因子基因表达。结果与结论：虎纹捕鸟蛛毒素能维持全脑缺血再灌注脑损伤大鼠线粒体基本形态且能不同程度降低肿瘤坏死因子凋亡通路中促凋亡因子肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase8mRNA表达。提示天然活性多肽虎纹捕鸟蛛毒素作为一种新型N-型电压依赖性钙通道阻断剂,能有效阻断胞外Ca2＋的大量内流,使细胞内游离钙降低,减少由于细胞内钙超载而引起的一系列病理损害,从而保护神经细胞,减轻缺血缺氧海马神经细胞的损伤。     

Effect of mibefradil on voltage-dependent gating and kinetics of T-type Ca(2+) channels in cortisol-secreting cells

We have studied the effect of the Ca(2+) antagonist mibefradil on low voltage-activated T-type Ca(2+) channels in whole-cell patch clamp recordings from bovine adrenal zona fasciculata (AZF) cells. AZF cells are distinctive in expressing only T-type Ca(2+) channels, allowing the mechanism of pharmacological agents to be explored without interference from other Ca(2+) channels. The inhibition of T-type Ca(2+) channels by mibefradil was voltage- and use-dependent. When Ca(2+) currents were activated from holding potentials of -80 and -60 mV, mibefradil inhibited currents with IC(50) values of 1.0 and 0.17 microM, respectively. When T-type Ca(2+) current (I(T)) was activated from a holding potential of -90 mV in the presence of 2 microM mibefradil, a single voltage step to -10 mV inhibited I(T) by 16.2% +/- 2.9% (n = 10). With subsequent voltage steps, applied at 10-s intervals, block reached a steady-state value of 51.9% +/- 5.0% (n = 5). Mibefradil (1 microM) produced a leftward shift of 5.7 mV (n = 4) in the voltage-dependent steady-state availability curve such that T-type Ca(2+) channels inactivated at more negative potentials, but this drug did not change the voltage-dependence of T channel opening. Mibefradil failed to alter the kinetics of T channel activation, inactivation, or deactivation, but markedly slowed T channel recovery following an inactivating prepulse. Mibefradil inhibited adrenocorticotropin-stimulated cortisol secretion from AZF cells with an IC(50) value of 3.5 microM. These results show that mibefradil is a relatively potent antagonist of T-type Ca(2+) channels in cortisol-secreting cells. The enhanced potency of mibefradil with sustained or repetitive depolarizations, its shifting of the steady-state inactivation curve, and its slowing of recovery all indicate that this drug preferentially interacts with Ca(2+) channels in the open or inactivated state. The inhibition of cortisol secretion by mibefradil at concentrations similar to those that block I(T) is consistent with a requirement for these channels in corticosteroidogenesis.     

Pharmacological protection of synaptic function, spatial learning, and memory from transient hypoxia in rats.

Hypoxia significantly reduced cholinergic theta activity in rat CA1 field and intracellular theta in the CA1 pyramidal cells, recorded in hippocampal slices. The hypoxic responses of the hippocampal CA1 pyramidal cells to a brief hypoxia consisted of a short period of "synaptic arrest", observed as an elimination of excitatory postsynaptic current under voltage clamp and recovered immediately as oxygenation was reinitiated. The hypoxic synaptic arrest was not associated with reduced postsynaptic responses of the pyramidal cells to externally applied L-glutamate, suggesting that the synaptic arrest might result from a presynaptic mechanism. The hypoxic synaptic arrest was abolished in the presence of 8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX), a specific adenosine A(1) receptor antagonist. Blocking adenosine A(1) receptors also eliminated effects of hypoxia on the hippocampal CA1 field theta activity and intracellular theta of the CA1 pyramidal cells. In behaving rats, brief hypoxia impaired their water maze performance in both the escape latency and probe tests. The impairment was prevented by intralateral cerebroventricular injections of DPCPX. These results suggest that hypoxia releases adenosine and produces an inhibition of synaptic transmission and intracellular signal cascade(s) involved in generation/maintenance of hippocampal CA1 theta activity. This protection of synaptic efficacy and spatial learning through adenosine A(1) receptor antagonism may represent an effective therapeutic strategy to eliminate functional interruption due to transient hypoxic episodes and/or chronic hypoxia secondary to compromise of respiratory function.     

痴呆模型鼠脑海马突触素改变及其与学习记忆的关系

背景学习记忆与中枢神经系统突触的结构和功能的可塑性密切相关.目的探讨痴呆模型鼠海马的突触素改变及其与学习记忆的关系,为老年性痴呆的发病过程提供实验依据.设计随机对照实验.单位广州医学院人体解剖学教研室.材料实验于2003-02/2004-05在广州医学院人体解剖学教研室完成.选取成年SD大鼠20只,随机分为正常组和损伤组,10只/组.方法损伤组大鼠切断左侧穹窿海马伞,建立基底前脑-海马胆碱能通路受损的痴呆模型.造模4周后,用三等分Y型迷宫检测两组大鼠的学习记忆能力.大鼠学习成绩以连续10次测试中有9次达到正确反应(2 min以内逃避电击并第一时间到达安全区)时所需的训练次数来表示,记录每只大鼠达到学会标准所需的训练次数,训练次数少说明学习能力强.训练结束24 h后测试记忆能力,以10次训练中的正确反应次数代表记忆保持能力的优劣,正确反应次数少则记忆能力低.然后用免疫组织化学染色和图像分析技术等方法对大鼠海马突触素进行定量分析,以实际吸光度值进行比较,以避免染色过程中的非特异性染色导致的误差.主要观察指标①两组大鼠行为测试中学会逃避电击并第一时间到达安全区所需的训练次数.②两组大鼠海马结构突触素免疫反应物检测结果.③两组大鼠损伤侧海马CA1区和齿状回分子层突触素免疫反应物的实际吸光度值.结果实验纳入大鼠20只,全部进入结果分析.①两组大鼠学会逃避电击并第一时间到达安全区所需的训练次数损伤组学习能力达到标准所需的训练次数明显多于正常组(98.40±4.51),(62.21±2.43)次,P＜0.01;而记忆能力达到标准所需的训练次数则明显低于正常组(3.82±0.64),(8.81±0.32)次,P＜0.01.②两组大鼠海马结构突触素免疫反应物检测结果海马结构突触素免疫反应物呈板层分布,神经元胞体、胶质细胞、血管及白质不被染色.神经毡内免疫反应产物呈持异性颗粒状或点状.海马CA1区以多形层和辐射层染色较深,腔隙分子层次之,锥体层和颗粒层细胞的轮廓边缘有点状标记.齿状回染色较浅,突触素免疫反应物分布稀疏.③两组大鼠损伤侧海马CA1区和齿状回分子层突触素免疫反应物的实际吸光度值与正常组相比,损伤组海马CA1区多形层、辐射层、腔隙分子层和齿状回分子层均明显降(80.34±4.33,43.40±2.57;78.25±5.48,40.21±3.2230.01±4.05,12.37±1.78;60.50±3.80,26.63±2.36;P均＜0.01).经相关分析表明,大鼠穹窿海马损伤后学习记忆能力与海马CA1区多形层、辐射层、腔隙分子层和齿状回分子层突触素免疫反应物的实际吸光度值呈显著正相关(多形层r=0.739,P＜0.01;辐射层r=0.624,P＜0.05;腔隙分子层r=0.892,P＜0.01;齿状回分子层r=0.853,P＜0.01).结论痴呆模型鼠损伤侧海马CA1区多形层、辐射层、腔隙分子层和齿状回分子层突触素免疫反应物的吸光度明显下降,并与其学习记忆能力呈显著正相关.提示海马突触素含量减少与学习记忆能力存在密切关系.     

艾滋病相关痴呆机制研究:鼠海马脑片 CA1区突触传递及可塑性与 HIV-1包膜糖蛋白 gp120的关系

背景目前对艾滋病相关性痴呆( HIV 1 associated dementia,HAD)仍没有特效的治疗药物,主要因为对 HIV 1感染引起的神经损伤和坏死的机制,仍没有完全阐明. 目的探讨人类免疫缺陷病毒 I型( human immunodeficiency virus I type, HIV 1)包膜糖蛋白 gp120对鼠海马脑片 CA1区的突触传递及可塑性的影响,以期阐明 HAD的形成机制. 设计配对设计. 单位暨南大学医学院的病理生理教研室. 材料实验于 2003- 01/10在暨南大学医学院病理生理教研室 [国家中医药管理局三级重点实验室(登记号 TCM- 03- 131) ]完成.实验用 2～ 5周龄雄性 SD大鼠. 干预应用离体脑片灌流及记录技术. 主要观察指标记录大鼠海马 CA1区的兴奋性突触后电位 (excitatory postsynaptic potential,EPSP),研究了 gp120对高频电刺激 Schaffer侧支引起的鼠长时程增强效应( long term potentiation, LTP)的影响. 结果发现 gp120对大鼠海马 CA1区 LTP产生抑制作用 [LTP的平均幅度由正常的( 216.1± 14.0)%降到( 90.8± 6.0)%, n=12, P< 0.01],对其基础 EPSP没有影响. PKA/PKC 蛋白激酶抑制剂 H7可以反转这种抑制效应 [LTP的平均幅度为( 198.8± 16.2)%, n=8, P< 0.01]. 结论 gp120可能是通过抑制海马 CA1区的 LTP而参与 HAD的形成.