VEGF-C对膀胱癌T24细胞增殖与丝裂霉素诱导T24细胞凋亡影响的研究

目的:探讨VEGF-C对膀胱癌T24细胞增殖及抑制丝裂霉素(MMC)诱导T24细胞凋亡的影响。方法:采用MTT及流式细胞术(FCM)等方法观察不同浓度(0、50、100、200μg/L)VEGF-C对T24细胞生长及MMC诱导的T24细胞凋亡的影响。所有实验重复3次。结果:随着预处理VEGF-C浓度的增加,T24细胞的增长率由27.3%上升到65.0%;MMC诱导的T24细胞凋亡率由29.5%下降至14.0%。结论:VEGF-C促进膀胱癌T24细胞的增殖和抑制MMC诱导的细胞凋亡;抑制VEGF-C作用通路可能防治膀胱癌复发。     

膀胱癌组织中Wnt拮抗因子分泌型卷曲相关蛋白1甲基化和异常表达的意义

目的 探讨Wnt拮抗因子分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)甲基化和表达在膀胱癌发病机制中的作用. 方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应检测人膀胱癌细胞株T24、5637和SCaBER及45例膀胱癌组织和对应癌旁正常组织的SFRP1基因甲基化状态,蛋白质印迹方法检测SFRP1蛋白表达. 结果 SFRP1在膀胱癌细胞株T24和5637中呈现甲基化状态,而SCaBER细胞未检出SFRP1甲基化.将去甲基化试剂5’-氮杂-脱氧胞苷酸(1μg/ml)加入发生甲基化的膀胱癌细胞株T24和5637后,细胞SFRP1 mRNA和蛋白出现表达.45例膀胱癌组织中SFRP1甲基化表型28例(62.2％),癌旁正常组织6例(13.3％),组间频率差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 SFRP1甲基化及表达下调可能参与了膀胱癌的发病过程.     

新型光敏剂叶绿酸e6对人膀胱癌5637细胞作用的研究

目的:研究新型光敏剂叶绿酸e6对人膀胱癌5637细胞的杀伤作用,并对其作用机制进行探讨。方法:将5637细胞培养至对数生长期,加入光敏剂叶绿酸e6共同孵育,以650nm激发光照射,MTT法检测叶绿酸e6对5637细胞的杀伤作用,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:在能量密度为1J/cm2条件下,在2.5、5、10μg/ml浓度时叶绿酸e6对5637细胞的生长抑制率分别为15.92%、43.18%和67.00%,在能量密度为4J/cm2条件下,叶绿酸e6在2.5、5、10μg/ml浓度时对5637细胞的生长抑制率分别为36.78%、72.23%和75.32%;流式细胞仪结果显示5637细胞经光动力作用后,凋亡率为(42.67±1.2)%,与对照组有显著差异。结论:新型光敏剂叶绿酸e6对人膀胱癌5637细胞有明确的杀伤作用,诱导细胞凋亡是可能机制之一。     

二甲双胍增强膀胱癌5637细胞对TRAIL的敏感性及其机制研究

目的探讨二甲双胍能否增强膀胱癌5637细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导细胞凋亡的敏感性及其机制。方法 MTT法检测不同浓度TRAIL(0、10、20、40、60、100 ng/mL)和二甲双胍(10 mM)联合用药对膀胱癌5637细胞的增殖抑制作用。Annexin V-FITC/PI双染检测二甲双胍对TRAIL诱导5637细胞凋亡的影响。Western blot检测二甲双胍和/或TRAIL干预5637细胞24小时后对caspase-8、caspase-3、PARP、DR4、DR5和c-FLIPL表达的影响。结果二甲双胍可增强TRAIL对膀胱癌5637细胞的增殖抑制作用和凋亡诱导作用,二甲双胍单独用药并未上调DR4和DR5表达,但显著下调c-FLIPL表达。结论二甲双胍显著增强膀胱癌5637细胞对TRAIL的敏感性,其机制可能与二甲双胍下调c-FLIPL表达有关。     

白藜芦醇促进膀胱癌细胞对TRAIL凋亡诱导作用的研究

目的探讨白藜芦醇对膀胱癌细胞的作用及其与TRAIL联合对膀胱癌细胞的凋亡诱导作用及其可能的机制。方法MTT法检测白藜芦醇或/和TRAIL对膀胱癌细胞5637和T24体外生长能力的影响。流式细胞术测定白藜芦醇和/或TRAIL对细胞凋亡和线粒体跨膜电位的影响。Western blot检测白藜芦醇对死亡受体(DR)4、5与细胞凋亡相关蛋白表达水平的变化。结果 MTT证实白藜芦醇可抑制膀胱癌细胞体外生长能力,且呈剂量与时间依赖性。单独应用TRAIL未能抑制膀胱癌细胞的生长,但与白藜芦醇联合应用时可显著抑制细胞的增殖速度。白藜芦醇能够诱导膀胱癌细胞发生凋亡,而TRAIL则不能诱导细胞凋亡,但联合应用白藜芦醇和TRAIL可诱导膀胱癌细胞发生显著的凋亡。此外,在白藜芦醇或联合应用白藜芦醇与TRAIL可诱导肿瘤细胞丢失线粒体膜电位(ΔΨm),而单独应用TRAIL则未能诱导线粒体膜电位的丢失。Western blot结果表明,白藜芦醇可上调DR4和DR5的表达,并下调Bcl-2与survivin的表达。结论白藜芦醇可抑制膀胱癌5637和T24细胞增殖并诱导细胞凋亡。此外,白藜芦醇可以提高膀胱癌细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡作用。单独应用白藜芦醇或与TRAIL联合应用可能成为临床膀胱癌治疗的新策略。     

MiR-519d靶向调控OCT4抑制膀胱癌细胞系5637增殖

目的:探讨miR-519d对膀胱癌细胞系5637增殖的影响及分子机制。方法:通过转染miRNA mimics在膀胱癌细胞系5637中过表达miR-519d,分别利用MTS及细胞集落形成试验,检测膀胱癌细胞系5637增殖能力的改变。通过双荧光素酶报道实验和Western Blot方法验证miR-519d对OCT4的靶向调控。利用OCT4特异性干扰RNA证实miR-519d通过靶向调控OCT4抑制膀胱癌细胞系5673增殖。结果:在膀胱癌细胞系过表达miR-519d后,细胞活性、增殖能力明显下降;双荧光素酶报道实验结果表明,相对于各对照组,共转染OCT4 3'UTR载体与miR-519d组荧光素酶相对活性明显降低(P0.05)。过表达miR-519d后5637细胞中OCT4蛋白表达下调。利用siRNA特异性下调OCT4表达后,5637细胞活性及增殖能力同样受到抑制。结论:miR-519d能靶向结合OCT4 3'UTR序列,通过下调OCT4的表达抑制膀胱癌细胞系5637的增殖。     

SRPK1基因对膀胱癌细胞生物学行为的影响及机制研究

目的观察丝氨酸/精氨酸蛋白特异性激酶1(SRPK1)对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响, 并进一步探究其分子机制。方法利用Oncomine癌症数据库分析SRPK1基因在膀胱癌组织及正常膀胱组织中的表达;构建SRPK1特异的慢病毒干扰质粒(sh1和sh2)和阴性对照质粒(NC), 包装慢病毒颗粒, 分别感染T24细胞和5637细胞。设空白对照组(T24和5637)、阴性对照组(T24/NC和5637/NC)、干扰组1(T24/sh1和5637/sh1)和干扰组2(T24/sh2和5637/sh2);采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞中SRPK1 mRNA和蛋白水平的表达变化;采用CCK-8法检测各组细胞增殖能力的变化;采用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测各组细胞迁移和侵袭能力的变化;采用Western blot检测各组细胞上皮间质转化(EMT)及AKT通路相关蛋白表达变化。结果 Oncomine癌症数据库中SRPK1 mRNA在膀胱癌组织中的表达明显高于正常膀胱组织(P<0.001)。通过qRT-PCR和Western blot检...     

比较雷帕霉素和吡柔比星抑制膀胱癌T24细胞生长活性的实验研究

目的对单独使用雷帕霉素（RPM）和吡柔比星（THP）抑制膀胱癌T24细胞生长活性的作用进行比较,探究雷帕霉素在膀胱肿瘤患者中的应用前景。方法建立空白对照组,将雷帕霉素和吡柔比星分别调整至10μg/mL、0.8μg/100μL,作用于膀胱癌T24细胞,处理24h后分别使用MTT法、流式细胞仪、RT-PCR和划痕法探索比较在此浓度下两种药物对膀胱癌T24细胞的影响;在体内实验,BALB/c裸鼠种植转移性人膀胱癌构建荷瘤模型。随机分为RPM（2mg/kg）、THP（0.015mg/cm2）组和空白对照组（生理盐水）,观察RPM和TPH对肿瘤生长及转移的影响。结果 RPM和THP分别在10μg/mL、0.8μg/100μL质量浓度下均对膀胱癌T24细胞生长活性具有明显抑制作用,同时此浓度下RPM和THP抑制T24细胞增殖的作用无明显差异（P〉0.05）;RPM组下调血管生长因子（VEGF）的作用明显强于THP组（P〈0.05）;体内实验中,RPM和THP均显著抑制肿瘤的生长及转移。结论雷帕霉素（RPM）和吡柔比星（THP）均具有良好的抑制T24细胞生长的作用,但在此浓度下THP的细胞毒性较雷帕霉素更强,并且雷帕霉素（RPM）明显抑制膀胱癌T24细胞的生长活性的作用为治疗膀胱癌治疗提供了实验参考,表现出良好的临床应用前景。     

丙戊酸钠增强免疫细胞对人膀胱癌细胞的杀伤作用

目的:探讨丙戊酸钠(VPA)对膀胱癌细胞MICA表达的影响以及所产生的肿瘤免疫作用,以期为防治膀胱癌复发和浸润提供新的治疗方法。方法:采用不同浓度VPA处理人膀胱尿路上皮癌T24细胞后,用半定量RT-PCR和流式细胞术检测癌细胞中MICA mRNA和蛋白表达。用乳酸脱氢酶法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对经VPA处理的T24细胞的杀伤作用。结果:VPA从mRNA和蛋白水平诱导T24细胞表达MICA,并增强T24细胞对PBMCs细胞毒作用的敏感性。结论:VPA能增强膀胱癌对免疫细胞杀伤作用的敏感性,可作为防治膀胱癌的辅助药物。     

RNA干扰下调p53抑制因子iASPP表达对膀胱癌细胞的影响

目的 探讨RNA干扰使p53抑制因子iASPP表达下调对膀胱癌细胞的影响.方法 iASPP siRNA慢病毒感染入膀胱癌细胞株5637和T24,实时定量PCR和蛋白质印迹法检测iASPP的表达;噻唑盐法测定细胞生长;集落形成测定法检测集落形成比率;荧光激活细胞分选术检测细胞周期.结果 iASPP siRNA慢病毒感染后细胞iASPP mRNA为0.60±0.02,低于阴性对照慢病毒组(1.00±0.03,P＜0.05).膀胱癌细胞iASPP蛋白表达降低.iASPP下调能抑制入膀胱癌细胞5637和T24的生长和增殖(P＜0.05),每个集落中细胞数显著减少(P＜0.05),集落数目也低于阴性对照组(P＜0.05).iASPP siRNA慢病毒5637细胞培养中的G1期细胞比率明显高于阴性对照慢病毒组,分别为(51.94±0.98)%和(46.00±0.77)%;T24细胞结果与之类似,分别为(60.04±0.45)%和(53.62±0.69)%;组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 RNA干扰能够使膀胱癌细胞iASPP表达下调,从而抑制膀胱癌细胞的生长和增殖.

Abstract：

Objective To discuss the effects of silencing of iASPP gene on human bladder cancer cells. Methods RNAi silencing of iASPP gene in bladder cancer cell 5637 and T24 cells were used by lentiviral mediated interfering short hairpin RNAs. Cell proliferation was tested by MTT assay, and rate of colony was tested by colony formation assay. Cell cycles were tested by using fluorescence-activated cell sorting. Results Down-regulation of iASPP could inhibit the growth and proliferation of human bladder cancer cells (P＜0.05). iASPP know-down could decrease the colony formation of 5637 and T24 cells (P＜0, 05). Knocking down of iASPP in 5637 and T24 cells showed cell arrested at G1. Conclusions Silencing of iASPP gene could inhibit proliferation and colony formation of bladder cancer, iASPP might be an important target for gene therapy of bladder cancer.     

羟基喜树碱对高危浅表性膀胱癌模型5637细胞的凋亡作用研究

目的：观察羟基喜树碱（HCPT）对高危浅表性膀胱癌模型5637细胞的凋亡作用,研究HCPT不同作用时间和不同浓度对5637细胞的影响,进一步讨论HcPT在膀胱灌注化疗中的作用。方法：采用四甲基偶氮唑盐（MIT）检测不同浓度、不同作用时间下HCPT对5637细胞增殖的影响;采用流式细胞术测定低浓度（5μmol／L）、不同作用时间（12、24h）HCPT诱导5637细胞的凋亡率;用Hochest33258染色观察细胞凋亡情况;采用荧光定量PCR检测5μmol／L HCPT作用5637细胞12h相较未加药5637细胞中凋亡相关基因的变化。结果：5μmol／L HCPT作用5637细胞12h后,早期凋亡细胞占23.5％。HCPT随着作用时间的延长,凋亡率并不会随之增加,HCPT诱导凋亡的作用在肿瘤细胞与药物作用后的某一时间点达到高峰。Hochest33258染色和荧光定量PCR检测凋亡相关基因也证明HCPT这一浓度在这一时间点有诱导癌细胞凋亡的作用。结论：羟基喜树碱具有诱导高危浅表性膀胱癌细胞凋亡的作用。适当延长药物作用时间,可以促进其药效的发挥。     

膀胱癌细胞中DAPK基因启动子甲基化状态分析

目的 分析DAPK抑癌基因在T24、5637、ScaBER三种膀胱癌细胞中的表达情况及该基因启动子区的甲基化状态。方法 采用半定量RT-PCR和Westernblot分别检测三种膀胱癌细胞中DAPK基因的表达，用甲基化特异PCR（MSP）方法检测三种细胞中的DAPK基因启动子甲基化状态。观察甲基转移酶（DMNT）抑制剂5-aza-2’-deoxy．cytidine（5-aza-CdR）对各细胞中的基因表达和甲基化状态的影响。结果 T24细胞中未检测到DAPK基因的表达，也未检测到启动子甲基化；5637细胞中该基因表达水平极低，在SeaBER细胞中该基因的表达较前两者要高。5637细胞和ScaBER细胞中均有甲基化改变。2．5μmol／l浓度的5-aza-CdR可以有效上调5637和ScaBER细胞的DAPK基因的表达。结论 抑癌基因DAPK的表达异常与移行细胞癌的发生发展有重要联系，且基因启动子区CpG岛的异常甲基化在调节DAPK基因的表达中发挥重要作用。     

端粒酶反义寡核苷酸对膀胱癌T24细胞的作用

目的 探讨全硫代修饰的端粒酶反义寡核苷酸（ASODN-t)抑制人膀胱癌T24细胞增殖并诱导其凋亡的可能性。为膀胱癌基因治疗提供新靶点。方法 采用光镜、电镜、四唑盐比色（MTT）法及流式细胞术等检测不同浓度（2-10umol/L)ASODN-t对T24细胞生长、细胞周期和诱导其凋亡的作用。结果 不同浓度ASODN-t对T24细胞生长有抑制作用。且具有序列特异性及剂量依赖性,6umol/lASODN-t作用细胞72h,电镜观察可见典型凋亡特征,流式细胞仪检测到凋亡峰,凋亡率为10.4%,而无关寡核苷酸（N-ODN）则无此作用。结论 ASODN-t对T24细胞生长有抑制作用,可诱导其发生凋亡,说明端粒酶与T24细胞恶性增殖有关。抑制端粒酶活性可能成为膀胱癌基因治疗的新靶点。     

miR-451对膀胱癌细胞迁移、侵袭及E-cadherin和Vimentin基因表达的调控作用

目的研究miR-451对膀胱癌细胞迁移、侵袭及E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)基因表达的调控作用。方法培养人膀胱癌细胞株T24、5637、SW790并采用荧光定量PCR检测miR-451的表达量;T24细胞随机分为不转染模拟物的对照组、转染NC模拟物的NC组、转染miR-451模拟物的miR-451组,采用荧光定量PCR检测miR-451的相对表达量,采用Western blot检测E-cadherin和Vimentin的相对表达量,采用Transwell检测细胞的迁移、侵袭能力。结果T24细胞中miR-451的相对表达量均低于5637细胞、SW790细胞;在T24细胞中,miR-451组的miR-451相对表达量、E-cadherin相对表达量明显高于对照组、NC组,迁移能力、侵袭能力均明显弱于对照组、NC组,Vimentin相对表达量明显低于对照组、NC组。结论miR-451能够抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭且该抑制作用与增加E-cadherin表达、减少Vimentin表达有关。     

蒲公英甾醇调控膀胱癌T24 细胞迁移与侵袭能力的作用及机制研究

目的:探索蒲公英甾醇对膀胱癌T24细胞迁移与侵袭能力的作用及机制。方法:体外培养膀胱癌T24细胞,在其中加入不同浓度(10、20、40μg/mL)蒲公英甾醇进行干预。采用划痕实验和Transwell小室法分别观察膀胱癌细胞迁移能力及侵袭能力;Western blotting实验考察细胞中SDF-1/CXCR4信号通路相关蛋白的变化;ELISA试剂盒检测细胞上清中基质金属蛋白酶(MMP)-2/9的水平。结果:蒲公英甾醇可抑制膀胱癌T24细胞的迁移与侵袭能力(P<0.05,P<0.01),降低细胞分泌MMP-2及MMP-9的能力(均P<0.05,P<0.01)。同时蒲公英甾醇能有效抑制膀胱癌T24细胞内基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、CXCR4、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)及磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:蒲公英甾醇通过干扰SDF-1/CXCR4信号通过,下调Akt/mTOR的传导,削弱了细胞分泌MMP-2及MMP-9的能力,从而有效抑制膀胱癌T24细胞的迁移与侵袭。     

胡椒碱对人膀胱癌 T24细胞增殖及侵袭作用的研究

目的：探讨不同浓度胡椒碱对膀胱癌 T24细胞增殖和侵袭作用的影响。方法用不同浓度的胡椒碱（5、10、20、40、80、160μmol／L）处理体外培养的膀胱癌 T24细胞,然后通过 MTT实验、Transwell 实验、Western blot 等方法检测 bax 和 bcl-2的表达以及 T24细胞的增殖和凋亡情况。结果胡椒碱作用于 T24细胞24 h 后,IC50值为38．73μmol／L,并且呈剂量依赖性。随着胡椒碱浓度的增加,T24细胞活性被抑制作用明显增加,且抑凋亡蛋白 bcl-2的表达量减少,促凋亡蛋白 bax 的表达量增加。结论胡椒碱对膀胱癌 T24细胞具有抑制增殖及促进其凋亡的作用。     

KPNA2基因沉默和过表达对人膀胱癌细胞株5637增殖能力的影响

目的观察KPNA2(karyopherin a2)基因沉默和过表达对人膀胱癌细胞株5637增殖能力的影响。方法将KPNA2siRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1(+)-KPNA2用LipofectaminTM2000方法瞬时转染膀胱癌细胞株5637,转染后48h,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中KPNA2蛋白表达,CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞增殖活性,通过生长曲线检测KPNA2基因沉默和过表达后细胞增殖能力的改变。结果与阴性对照组比较,KPNA2siRNA干扰质粒转染5637细胞后,转染组细胞KPNA2蛋白表达水平显著下降,细胞增殖能力明显受到抑制,pcDNA3.1(+)-KPNA2过表达质粒转染5637细胞后,转染组细胞KPNA2蛋白表达水平显著升高,细胞增殖能力明显增强(P0.05)。结论 KPNA2基因沉默和过表达可以调节人膀胱癌细胞株5637的增殖能力,为膀胱癌的临床治疗提供了新方向。     

E-cadherin和CAR在人膀胱癌细胞中的表达及其意义

目的检测上皮型钙黏素（E—cadherin）和柯萨奇-腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor，CAR）在多种人膀胱癌细胞中的表达情况，初步讨论E-cadherin与CAR在人膀胱癌细胞中表达的意义及两者间的关联。方法用Western印迹法测定人膀胱癌细胞中E—cadherin和CAR的表达情况。结果E—cadherin，CAR在RT4、5637细胞中表达较高，在253J细胞中表达较低；E—cadherin在J82、T24细胞中不表达，CAR在J82细胞中微弱表达，在T24中不表达。结论E-cadherin和CAR在人膀胱癌细胞中的表达趋势一致，两者可能相互协作，共同参与膀胱癌的侵袭转移过程。     

CDH13表达下调对膀胱癌细胞迁移和侵袭及PI3K/Akt表达的影响

目的：研究膀胱癌5637细胞中CDH13表达下调后对细胞迁移、侵袭和PI3K/Akt表达的影响以及它们间的关系。方法应用 RNA 干扰技术抑制人膀胱癌5637细胞株中 CDH13的表达,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell 小室法检测细胞侵袭能力,Western blot 检测CDH13、PI3K及 Akt的表达水平。结果膀胱癌5637细胞中CDH13表达下调后细胞迁移和侵袭能力增强,PI3K及 Akt 的表达增加。结论膀胱癌细胞中 CDH13表达下调可能通过激活PI3K/Akt通路促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。     

蛇葡萄素对人膀胱癌细胞株T24的作用

目的 观察蛇葡萄素对体外人膀胱癌细胞株T24的增殖抑制作用.方法 以浓度为20、10、5、320、160、80、40 mg/L的蛇葡萄素作用于体外培养的人膀胱癌细胞株T24应用噻唑蓝(MTT)的培养检测增殖抑制方法.结果 浓度为20、10、5 mg/L的蛇葡萄素对体外人膀胱癌细胞株T24的增殖抑制率明显高于浓度为320、160、80、40 mg/L的蛇葡萄素.结论 蛇葡萄素对体外人膀胱癌细胞株T24的增殖有抑制作用,而且增殖抑制率与蛇葡萄素的浓度剂量不成正比例,在一定范围内的浓度达到最大的抑制率,不会因浓度增加而抑制率增加.浓度为20、10、5 mg/L更能有效的抑制人膀胱癌细胞株T24的增殖.