表皮细胞培养与移植研究——表皮细胞分离技术

表皮细胞培养量重要的一步就是分离过程,目前广泛使用的方法是用胰蛋白酶消化皮片。由于消化过程中真皮始终存在。因此不可避免地存在成纤维细胞的污染。为此我们设计了一种可获得全部基底细胞的改良表皮分离方法。材料与方法一、表皮细胞分离人表此细胞从烧伤病人(18～24岁)植皮手术后所剩中厚皮中分离。对 Rheinwald 法(Tr)、我们实验室常规方法(Tr-C)及 Dispase 方法(D-Tr)进行比较。1.Dispase 方法     

大张皮片法与小皮条法培养表皮细胞的比较研究

目的　比较研究用大张皮片和小皮条培养表皮细胞的方法。　方法　将皮肤组织切成大张皮片 ,用锐刀网状切割真皮面 ,Dispase酶消化充分后用镊子分离真、表皮 ,然后消化表皮进行表皮细胞培养 (大张皮片法 )。将同样大小的皮肤组织切割成小皮条 ,消化充分后用镊子分离真、表皮 ,然后进行表皮细胞培养 (小皮条法 )。记录两种方法切割皮肤和分离真、表皮所需时间 ,比较培养出表皮细胞的数量和纯度。　结果　将 5 cm2 大小的皮肤切割成小皮条需要 8～10分钟 ,而将同样大小皮肤切割成大张皮片仅需 1～ 2分钟 ;从小皮条上分离真、表皮耗时 10～ 15分钟 ,大张皮片法仅需2分钟。通过对比培养发现 ,大张皮片法获得的表皮细胞较多 ,活力较强 ,发生成纤维细胞污染的机会少。　结论　大张皮片法较小皮条法操作更简便、快捷 ,培养获得的表皮细胞活性高 ,成纤维细胞污染机会明显减少     

人体表皮细胞培养的研究进展及应用前景

在综述有关两种表皮细胞分离技术－Ｔｒ法和Ｔｈ－Ｔｒ法有关文献基础上，着重比较三种表皮细胞培养方法的优缺点及最新进展；并分析了ＥＧＦ、Ｃａ＾＋＋、ＣＴ等因素的影响以及表皮培养技术在临床的应用前景。     

组织工程皮肤种子细胞的同期快速分离

目的 寻找一种快速可行的同期分离组织工程皮肤种子细胞——表皮细胞及成纤维细胞的方法。方法 取手术切除包皮，利用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶消化法，同期分离表皮细胞及成纤维细胞，观察细胞形态。对表皮细胞及表皮干细胞行PAN—FITC、K19-FITC荧光免疫染色及K19流式细胞仪鉴定；对成纤维细胞行波形蛋白FITC免疫荧光鉴定。并分别对两种细胞培养7d，观察其生长情况。结果 应用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶，在3h内快速分离得到表皮细胞及成纤维细胞，免疫荧光染色表皮细胞PAN—FITC染色均为阳性、K19-FITC染色部分阳性，流式细胞仪鉴定其K19阳性表达的细胞接近17％。表皮细胞培养48h开始呈克隆样增长，至7d生长停滞，向终末的角细胞分化。成纤维细胞体外培养7d可扩增100倍，波形蛋白FITC免疫荧光染色呈阳性。结论 利用胶原酶结合胰蛋白酶消化法可在3h内同期分离到用于构建复合型组织工程皮肤的种子细胞，为复合组织工程皮肤的快速构建提供了可能。     

表皮干细胞的快速高效分离

目的 寻找一种快递高效分离组织工程化皮肤种子细胞-皮肤干细胞的方法.方法 取成人手术切除之包皮,利用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶消化法,快速分离表皮干细胞,并对其进行鉴定及相关的生物学特性的研究.结果 应用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶,可在3小时内快速分离到表皮干细胞及成纤维细胞,经流式细胞仪及细胞免疫荧光鉴定,表皮细胞群体中角蛋白19(K19)阳性表达的细胞即表皮干细胞约占18%,但是其体外短期扩增仍较困难.结论 利用胶原酶消化法可在短期内高效分离到用于构建组织工程化皮肤的种子细胞,这为快速构建组织工程化皮肤提供了可能.     

人表皮干细胞的体外分离和培养

目的:建立人表皮干细胞的体外分离和培养体系的方法,探索表皮干细胞体外大量扩增的途径.方法:采用0.375%的DispaseⅡ和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,采用MTF法筛选表皮细胞基础培养基和表皮细胞生长因子(epidermal growthfactor,EGF)的最适浓度,建立表皮干细胞培养的干预体系.逐日观察培养的细胞呈表皮干细胞样的形态,免疫组化方法检测β1整合素和角蛋白19的表达.结果:以表皮细胞数量和活性作指标,不同浓度EGF干预条件细胞活性不同,以15 ng/mL EGF的无血清SFM培养液为最适培养液,可使细胞呈表皮干细胞克隆样生长,β1整合素和角蛋白19表皮干细胞活性表达呈阳性.结论:采用0.375%的Dispase Ⅱ和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,以15 ng/mL EGF的无血清SFM培养液培养,此方法是一种简便、快速、经济的表皮干细胞分离和培养的方法.     

表皮细胞培养与移植进展

自体－异体表皮细胞混合培养及基因转染表皮细胞培养移植为缩短表皮细胞体外培养时间、促进皮肤缺损创面愈合，提高愈合质量提供了新的思路与方法。     

增生性瘢痕表皮细胞双向电泳图谱的建立及差异蛋白展示

目的 建立在体增生性瘢痕表皮细胞蛋白质分子双向电泳(2-DE)技术，筛选出增生性瘢痕表皮细胞较正常表皮细胞差异表达的蛋白质，为揭示表皮细胞在增生性瘢痕形成过程中的作用奠定基础。方法 利用消化法分离出在体的增生性瘢痕组织中的表皮细胞，提取其中总蛋白质，利用双向电泳技术展示蛋白质分子的表达，通过MeIanie 3．0软件对凝胶图像进行分析，将结果与数据库中正常表皮细胞2-DE图谱进行比较。结果建市了能够显示超过600个蛋白质点的在体增生性瘢痕表皮细胞双向电泳图谱，通过比较筛选出在位置、形状或密度上存在差异的蛋白质点24个。其中高表达的点有8个，低表达点有9个，表达缺失或极低表达点有4个，新发现蛋白质点3个。结论 采用消化法分离在体增生性瘢痕表皮细胞建立其2-DE图谱的方法是可行的，为进一步进行增生性瘢痕相关性蛋白质组研究奠定了基础。初步筛选出的24个差异蛋白质点提示增生性瘢痕表皮细胞的异常可能与增生性瘢痕的形成有关。     

不同接种密度对人表皮细胞培养融合的实验研究

目的:研究不同密度接种对人表皮细胞体外培养融合的影响。方法:外科切取无菌皮肤或包皮环切手术标本,经两步酶消化处理后,制备单个表皮细胞悬液。以不同细胞密度接种于含有3T3滋养细胞的培养瓶中,实验室体外原代培养扩增。结果:观察不同接种密度表皮细胞的体外培养增殖,结果表明人表皮细胞具较高的生长、增殖、融合能力。2×106cell/75cm2培养瓶密度接种人表皮细胞于含3T3滋养细胞培养瓶中,表皮细胞贴壁良好,细胞融合时间较短。结论:鼠3T3细胞能促进人表皮细胞贴壁,仍不失为较好的表皮细胞培养滋养层。适宜的表皮细胞接种密度为2×106cell/75cm2培养瓶。     

表皮细胞培养移植的现状与展望

表皮细胞培养技术于 1975年首次建立。随着时间的推移,组织工程学和细胞分子生物学迅速发展,表皮细胞培养及移植的基础研究和临床应用也进入了新的阶段。1.表皮细胞的修复功能:表皮修复功能主要来自基底层具有分裂能力的角质形成细胞,包括表皮干细胞、短暂扩充细胞和有丝分     

表皮干细胞的分离培养和鉴定

目的分离培养和鉴定人表皮基底层干细胞。方法中性蛋白水解酶选择性的消化表皮与真皮之间的细胞连接,采用改良的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法分离、培养表皮中的干细胞,观察培养第2、4、6天时a6、β1整合素、K19、K14、p63、Nestin、CD34、PCNA及K10在表皮干细胞中的表达差异。结果改良过的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法能够有效地促进表皮干细胞的贴壁和伸展。原代分离的表皮基底层干细胞a6、β1整合素,K19,K14,p63,Nestin,CD34及PCNA表达为强阳性而K10不表达。这些细胞具有干细胞的特点,可以形成克隆。随着培养时间的增加,表皮干细胞形态发生变化,a6、β1整合素、K19、K14,表达逐渐减弱,K10表达逐渐增强。此外,在原代分离的细胞中可见单个核样干细胞表达a6、β1整合素,K19,K14,p63,Nestin,CD34及PCNA,这些细胞形态相似体积较表皮基底层干细胞大,胞核为肾形,染色较深。结论中性蛋白水解酶消化合并改良过的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法能够高效地分离表皮中的干细胞。分离的细胞具有干细胞的特点,可以形成集落。此外,原代分离培养的表皮干细胞中仍然可见单个核样干细胞,这些细胞形态相似,类似血液系统来源的单核细胞,胞质内均匀分布着粗大的阳性颗粒。单个核样干细胞可能与皮肤的发生、发育以及创伤修复有关。     

牵拉培养对表皮细胞生长及EGF分泌的影响

目的：研究牵拉培养对表皮细胞生长的影响以及内源性EGF的分泌情况。方法：用酶消化法对表皮细胞进行原代培养，将实验分为二组：实验组和对照组，实验组采用细胞负压牵引装置培养，对照组细胞不受牵拉，连续观察72小时，分别于12、24、36、48、60、72小时，收集细胞培养液，同时于72小时观察表皮细胞在牵拉条件下和非牵拉条件下的生长情况：用ELISA法测定表皮细胞在牵拉条件下和非牵拉条件下分泌EGF的情况。结果：实验组表皮细胞经72小时牵拉后生长良好，而对照组的细胞死亡，实验组牵拉36小时EGF浓度为16．03μg／mL，其他时间点未测到，而非牵拉组各时间点均未测出EGF。结论：牵拉不但可促进表皮细胞的增殖和生长，而且可促进表皮细胞分泌EGF．     

成人表皮干细胞和汗腺细胞的体外分离和培养

背景：人表皮干细胞和汗腺细胞的分离培养及鉴定,为探讨人表皮干细胞再生汗腺的可行性打下基础。目的：探讨体外分离培养人表皮干细胞及汗腺细胞的有效方法。方法：采集不同年龄段的泌尿外科患者术后包皮组织,充分清洗消毒后去除皮下组织,将其修剪成0.5cm×0.5cm的皮片,用Ⅳ型胶原纯化、富集成人表皮干细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态：使用免疫荧光染色对成人表皮干细胞表型进行分析;CCK-8检测细胞的增殖曲线;采用胶原酶消化法从人全层无损伤皮肤中分离提取汗腺细胞,并进行扩增和鉴定。结果：倒置相差显微镜下见分离培养的成人表皮干细胞呈卵圆形、细胞之间紧密相连,呈铺路石状,免疫荧光染色显示细胞表达CK19、β1整合素。倒置相差显微镜下见汗腺细胞呈扁平多角形,表达汗腺细胞标志细胞CK7、18、19及CEA。结论：本实验结果说明胶原酶消化法分离培养成人表皮干细胞及汗腺样细胞是可行的。     

人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建

目的：改良传统人表皮干细胞（hESCs）分离、培养方法,为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞。方法：应用改良的酶消化法（改良法）及传统酶消化法（传统法）分离、培养hESCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法绘制生长曲线、免疫组化法测定hESCs标志物角蛋白19（K19）和β1整合素的表达,并且进一步比较上述两种方法所获种子细胞构建的组织工程皮肤的形态学的特性。结果：台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61个,传统法细胞消化分离数为68.50±26.91个（P〈0.01）;改良法活细胞比率是（94±0.01）%,传统法活细胞比率是（75±0.04）%（P〈0.05）。在8天时改良法细胞MTT法OD值为1.300,传统法为0.779,改良法较传统法活力好,增殖快;细胞免疫组织化学染色显示表皮干细胞标志物角蛋白19（K19）和β1整合素均为阳性染色;HE染色结果显示采用改良法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐,传统法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3～4层、基底细胞排列散乱。结论：利用改良的酶消化法可获得数量更多、活力更好的人表皮干细胞,为以hESCs为种子细胞构建组织工程皮肤奠定基础。     

自体表皮移植修复面颈部白癜风29例

自体表皮移植治疗白癜风术中如何制备良好的供，受皮床是保证疗效的关键。用自制的加温负压表皮分离同并结合液氮冷冻表皮分离术行自体表皮移植修复面颈部白癜风２９例，皮损６１块。     

十全大补汤兔血清对人传代表皮细胞生长影响的研究

目的:探索快速增殖表皮细胞的方法。方法:采用3T3滋养细胞培养法,将传代表皮细胞和3T3细胞共同接种于DF12十全大补汤兔血清培养系统中,对传代表皮细胞生长的情况进行研究。结果:在3T3成纤维细胞和兔血清共同存在时,即使低密度接种表皮细胞,表皮细胞也能以单个细胞为克隆,以单层形式生长,增殖迅速,融合成膜片时间缩短,细胞数量大,克隆形成效率高,与对照组比较均呈显著性差异(P<0.05)。结论:本将为表皮细胞培养和移植在整形外科临床中应用开拓前景。     

人表皮细胞中侧群细胞表型的初步分析

目的:检测人表皮细胞中是否存在侧群(side population,SP)细胞,并研究该表型细胞是否表达通用干细胞标志物ABCG2和表皮干细胞的标志物整合素α6和β1.方法:运用中性蛋白酶和胰蛋白酶两步消化法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮细胞.经Hoechst33342荧光染料和PI染色,流式细胞仪分析并分选SP细胞.采用流式细胞仪分析SP细胞ABCG2、整合素α6和β1的表达情况.结果:人表皮细胞中存在SP细胞,其比例为0.2%～0.3%.用流式细胞仪可检测到在SP细胞以及总表皮细胞中均有少量细胞表达通用干细胞标志物ABCG2以及表皮干细胞的标志物整合素α6和β1,但二者阳性细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05).结论:表皮细胞中的SP细胞是否是富集的表皮干细胞仍存在疑问,还需要进一步的动物体内移植实验、克隆形成能力和增殖能力的研究证实.     

去分化表皮干细胞的来源鉴定和分析

目的：利用染色体特异性分析方法鉴定去分化表皮干细胞的来源。方法：包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮。分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮干细胞。处理后的表皮片经免疫组化鉴定无表皮干细胞后移植到雌性BALB／c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,5d后用免疫组化法检测皮片内角蛋白10（CK10）、CK19和β1整合素的表达,然后用Ⅳ型胶原粘贴法分离皮片内去分化来源的表皮干细胞,并采用PCR的方法检测去分化细胞内的Y染色体。结果：未经处理的表皮片基底部细胞呈CK10染色阴性,CK19和β1整合素染色阳性;Ⅳ型胶原处理后的表皮片内细胞全呈CK10染色阳性。而去基底皮片移植后5d,在皮片的基底侧重新出现CK10染色阴性、CK19和β1整合素染色阳性的细胞。Ⅳ型胶原粘贴分离去分化来源的表皮干细胞,结果表明,移植皮片组在10min内约有4．56％的贴壁细胞出现,而未移植皮片组3h内无贴壁细胞出现。PCR分析结果显示在上述贴壁细胞内能检测到Y染色体的特异序列,而宿主来源的组织检测不到。结论：去分化表皮干细胞来源于移植皮片内成熟表皮细胞的去分化,而非宿主体内的干细胞。     

表皮生长因子对宫内膜细胞体外增殖的影响

本研究观察了表皮生长因子（ＥＧＦ）在体外对子宫内膜上皮细胞及基质细胞增殖的影响。采用酶消化加物理方法分离人子宫内膜上皮细胞及基质细胞，分别在体外培养，细胞汇合后消化，一部分用盖片法培养，用特异性抗体鉴定细胞纯度，另一部分做细胞增殖实验。在细胞中加入不同浓度的ＥＧＦ，培养２４、４８、７２小时，用ＭＴＴ法及流式细胞仪测定ＥＧＦ对子宫内膜上皮细胞及基质细胞增殖的作用。结果：ＥＧＦ浓度为５．０及１０．０ｎ     

以胶原海绵为载体培养的人表皮细胞移植

目的：将体外培养的人表皮细胞接种到胶原海绵上,构建一种表皮替代物,移植到鼠创面后研究观察皮肤的再生,方法：将手术切下的包皮经中性蛋白酶分离表皮,真皮,再经胰蛋白酶消化制成表皮细胞悬液,移入培养瓶中培养,将处于对数生长期的人表皮细胞直接接种到培养皿中的胶原海绵 ,再加上表皮细胞液培养3天后,移植到裸鼠全层皮肤缺损的创面上,以单纯无接种细胞的胶原海绵作为对照,并进行组织学,免疫组织化学及电子显微镜观察。结果：这种表皮替代物移植到创面后,表皮细胞继续增殖分化,形成一层新生表皮,与对照组相比,创面闭合早且收缩程度小,表皮成熟早且分层较多,基底膜形成较早,表皮下胶原纤维较少。结论：体外培养的表皮细胞能在胶原海绵上生长,移植到创面上后,该细胞可自动移行到创面并形成多层表皮结构,抑制创面收缩,可用于修复皮肤缺损。