肺炎链球菌黏附素A基因疫苗的构建及对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用

目的 探讨肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)基因疫苗的免疫原性及其对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用.方法 PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增PsaA基因,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-PsaA,脂质体法转染BHK-21细胞,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western blot)检测重组质粒在BHK-21细胞中的转录和表达.应用PsaA基因疫苗肌肉注射免疫BABL/c小鼠,ELISA检测脾细胞上清IFN-γ分泌,特异性抗体IgG水平及其亚型分布(IgG1/IgG2a).利用BABL/c小鼠肺炎链球菌D39株鼻咽部携带模型,鼻咽部灌洗液菌落计数观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带改变.结果 RT-PCR及Western blot显示重组PsaA蛋白在BHK-21细胞瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清高水平的IFN-γ及特异性IgG抗体(IsG1/IgG2a＜1),小鼠攻击实验证明PsaA基因疫苗免疫组小鼠D39携带菌落计数明显少于对照组(P＜0.01).结论 肺炎链球菌表面毒力蛋白PsaA基因疫苗免疫小鼠激发了抗原特异性的细胞及体液免疫反应,显著减少了小鼠鼻咽部肺炎链球菌的携带,为肺炎链球菌DNA疫苗理想侯选抗原之一.     

幼儿及儿童使用的肺炎链球菌疫苗研究进展

肺炎链球菌是导致肺炎的主要致病菌,而儿童又常常是最大的受害者。接种肺炎链球菌联合疫苗（PCV）是有效的防治方法。接种PCV对儿童抗侵入性疾病的能力、肺炎链球菌载菌量、急性中耳炎和抗微生物抗药性有一定的影响,接种疫苗可在一定程度上防止疾病的传播。但非疫苗血清型病菌更易在接种疫苗者中发现,以及疫苗价格高的问题,是影响PCV广泛使用的原因。     

肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究进展

肺炎链球菌是一种对人类健康危害较大的条件致病菌,目前其疫苗研究已取得了巨大突破,但既往研究主要集中在荚膜多糖疫苗上,存在诸多局限性。近年来,随着生物学技术及基因工程技术的飞速发展,由肺炎链球菌毒力因子及表面蛋白制作的蛋白疫苗研发迅速。其中,将肺炎链球菌不同的表面蛋白质作为免疫原组分构建的融合蛋白疫苗,极大地增强了疫苗的免疫原性,且已取得一定的试验效果,未来进一步研究将有望取代荚膜多糖疫苗。     

肺炎链球菌溶菌酶作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价

目的:肺炎链球菌溶菌酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase,LytA)作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价.方法:PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增LytA基因序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-LytA,免疫印迹(western-blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达.与前期构建的肺炎链球菌表画蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)N端序列基因构建的质粒pcDNA3.1-PspA'核酸疫苗联合或单独肌肉注射免疫BABL/c小鼠,检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,并观察免疫小鼠肺炎链球菌D39腹腔攻击21d生存情况.结果:ELISA检测发现3组(pcDNA3.1-LytA组,pcDNA3.1-PspA'组,pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组)实验组小鼠特异性IgG水平较空质粒对照组显著升高(P＜0.001),pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组小鼠抗LytA特异性抗体IgG水平较pcDNA3.1-LytA组明显升高(P＜0.01),但是与pcDNA3.1-PspA'组比较抗PspA特异性抗体IgG水平无显著差异(P＞0.05).小鼠攻击试验提示pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组小鼠中位生存时间较pcDNA3.1-LytA组及空质粒对照组显著延长(P＜0.01),但与pcDNA3.1-PspA'组比较中位生存时间无显著差异(P＞0.05),生存曲线相似.结论:LytA联合PspA'的肺炎链球菌多价核酸疫苗免疫效能并不优于单一抗原PspA'的肺炎链球菌核酸疫苗,LytA作为肺炎链球菌多价核酸疫苗的优势候选抗原组分之一有待进一步研究.     

肺炎链球菌毒力相关基因检测及临床意义

目的:检测肺炎链球菌临床分离株毒力基因存在情况。方法:以临床分离出的91株肺炎链球菌作为研究对象,利用PCR法对肺炎链球菌5种毒力基因实施检测。结果:在全部的91株肺炎链球菌中LytA、PsaA、NanA、PspA、Ply这5种基因的检测阳性率分别为94.5%、85.7%、85.7%、61.5%、82.4%。结论:肺炎链球菌毒力因子是肺炎链球菌致病的基础,5种常见的毒力基因在肺炎链球菌检测中,其阳性率都比较高,此实验为进一步阐明毒力因子的作用机制并应用于指导抗肺炎链球菌新药和新型疫苗研制奠定了一定的基础。     

肺炎链球菌毒力蛋白DNA疫苗优势抗原组合筛选及鉴定

目的 探讨肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原联合免疫的优势抗原组合方式.方法 分子克隆肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)N端及肺炎链球菌溶血素(Ply)基因序列,构建重组质粒pcDNA3.1-PspA'和pcDNA3.1-PBD(PBD为Ply 点突变减毒体),免疫印迹(Western blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达(包括前期工作中构建的重组质粒pcDNA3.1-PsaA).将3种重组基因疫苗以不同方式组合肌肉注射免疫150只BALB/c小鼠(B组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA',C组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PBD,D组:pcDNA3.1-PspA'+pcDNA3.1-PBD,E组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA'+pcDNA3.1-PBD),检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌D39携带改变和D39腹腔攻击小鼠21 d生存情况.结果 成功构建3种重组真核表达载体,ELISA检测结果显示B组小鼠血清特异性IgG抗体水平与E组相似(P>0.05),均明显高于A、C、D组[A组:对照空质粒组pcDNA3.1(+)]小鼠(P<0.01);免疫小鼠鼻咽部D39携带菌落计数提示B组小鼠相似于E组小鼠(P>0.05),并明显少于C、D组和阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01),并且D39腹腔攻击小鼠21 d生存时间分析亦提示其中位生存时间明显长于C组及阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01).结论 PspA'联合PsaA的抗原组合方式具有高效的协同保护效能,可作为肺炎链球菌DNA疫苗的优势候选抗原组合.     

肺炎链球菌表面蛋白A多价DNA疫苗交叉免疫保护作用评价

目的 评价肺炎链球菌表面蛋白A (PspA)优势家族亚类抗原的肺炎链球菌多价DNA疫苗抵御不同肺炎链球菌来源的异种PspA分子毒力作用的能力.方法 以包含PspA抗原Fam1的Clade1亚类和Fam2的Clade3亚类DNA序列的T载体为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增具有高保护性抗体效价和强交叉反应的PspA优势...     

肺炎链球菌感染可通过疫苗预防

印度儿科学会主席Nitin Shah曾介绍过传染病的预防与疫苗应用的意义。他强调，对于那些可以用疫苗预防的传染病，例如肺炎链球菌感染，疫苗的正确应用对预防和控制这些疾病有重要意义。Shah介绍，有很多小儿易患的疾病都可引起严重后果，例如天花、脊髓灰质炎、肺炎等。以肺炎链球菌感染为例，其可在小儿中引起肺炎、菌血症、脑膜炎等，甚至可造成死亡。[第一段]     

肺炎链球菌抗原试验快速检测阳性血培养瓶肺炎链球菌

目的 探讨肺炎链球菌抗原用于辅助诊断阳性血培养瓶肺炎链球菌的临床意义.方法 采用双盲法检测人工模拟血培养链球菌阳性标本34例人工模拟血培养链球菌阴性标本180例,血培养仪报警后,移出培养瓶用注射器抽取部分血培养液,部分用于革兰染色,部分用于肺炎链球菌抗原试验和标准培养鉴定法试验.结果 34例链球菌阳性标本中,肺炎链球菌24例,肺炎链球菌抗原试验均为阳性,缓症链球菌2例和血链球菌1例,肺炎链球菌抗原试验亦为阳性,7例其它链球菌肺炎链球菌抗原试验阴性.结论 肺炎链球菌抗原试验可应用于阳性血培养瓶肺炎链球菌的快速鉴定.     

肺炎支原体肺炎的免疫学发病机制

肺炎支原体(Mycoplasma Pneumoniae，MP)是儿童呼吸道感染较常见的病原体，其发病率在婴幼儿中有逐年升高的趋势，表现为发病年龄提前，肺外并发症多样等特点。迄今为止，肺炎支原体肺炎(Mycoplasma Pneumonise Pneumonia，MPP)的发病机制仍不十分清楚，目前主要有呼吸道上皮吸附作用、MP直接侵入和免疫学发病机制等学说，其中免疫     

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达（英文）

目的 克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因，构建真核表达重组质粒，转染真核细胞，观察其表达情况。方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBCSK＋／Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段，重组入克隆载体pUCm-T。再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后，运用电穿孔技术将重组体pcDNA3．1（＋）／Sjcb2转染HeLa细胞，间接免疫荧光技术观察目的基因的表达。结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗；重组质粒在HeIJa细胞中获得表达。结论Sicb2基因能够在体外真核细胞中表达。     

特异性靶向的戊肝嵌合DNA疫苗的构建及免疫效果研究

目的制备特异性靶向的嵌合DNA疫苗,并探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。方法用基因重组技术构建细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)与戊肝病毒抗原HEVE2嵌合基因的真核表达质粒,同时构建不带CTLA4的pHEVE2作为平行对照质粒,体外转染COS-7细胞,Westernblotting法检测细胞培养上清表达产物;于BALB/c小鼠皮内注射,每隔2周1次,共免疫3次,100μg/次;于免疫的第3、5和10周ELISA检测抗体效价。结果获得pHEVE2和pCTLA4-HEVE2嵌合基因真核表达质粒,测序证实各连接点阅读框序列正确;体外转染COS-7细胞,证明真核质粒以分泌形式表达;接种pCTLA4-HEVE2小鼠产生高滴度的特异性抗HEVE2抗体,比接种pHEVE2的对照组高50~100倍;pCTLA4-HEVE2诱导高水平的IgG2a、IgG2bTh1型抗体和IgG1Th2型抗体应答,pHEVE2则以IgG1Th2型抗体应答为主。结论CTLA4-HEVE2嵌合DNA疫苗有效地增强动物对HEVE2抗原的免疫应答,为进一步研究抗原靶向性的嵌合DNA疫苗奠定基础。     

特异性靶向的戊肝嵌合DNA疫苗的构建及免疫效果研究

目的 制备特异性靶向的嵌合DNA疫苗，并探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。方法 用基因重组技术构建细胞毒T淋巴细胞抗原4（CTLA4）与戊肝病毒抗原HEVE2嵌合基因的真核表达质粒。同时构建不带CTLA4的pHEVE2作为平行对照质粒，体外转染COS-7细胞，Western blotting法检测细胞培养上清表达并且 物；于BALB/c小鼠皮内注射，每隔2周1次，共免疫3次，100μg/次，于免疫的第3、5和10周ELISA检测抗体效价。结果 获得pHEVE2和pCTLA4-HEVE2嵌合基因真核表达质粒，测序证实各连接点阅读框序列正确；体外转染COS-7细胞，证明真核质粒以分泌形式表达；接种pCTLA4-HEVE2小鼠产生高滴度的特异性抗HEVE2抗体，比接种pHEVE2的对照组高50-100倍；pCTLA4-HEVE2诱导高水平的IgG2a,IgG2bTh1型抗体和IgG1Th2型抗体应答，pHEVE2则以IgG1Th2型抗体应答为主。结论 CTLA4-HEVE2嵌合DNA疫苗有效地增强动物对HEVE2抗原的免疫应答，为进一步研究抗原靶向性的嵌合DNA疫苗奠定基础。     

变异链球菌、表兄链球菌复合防龋DNA疫苗的研制

目的 构建包含变异链球菌和表兄链球菌两种致龋菌的主要抗原片段的复合防龋DNA疫苗,以期增强DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用.方法 PCR获得表兄链球菌OMZ176GTF-1的CAT区,克隆至靶向防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX中,构建编码变异链球菌PAc、GLU基因序列和表兄链球菌CAT基因序列的复合防龋DNA疫苗pGJGAC/VAX,转染CHO细胞系检测其表达.重组质粒及对照质粒分别经股四头肌注射和鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清和唾液中的特异性抗PAc,抗GLU和抗CAT抗体水平.重组质粒及对照质粒经鼻腔滴注免疫分别定植了变异链球菌和表兄链球菌的Wistar大鼠,龋齿记分评价防龋疫苗的龋齿保护效能.结果重组质粒pGJGAC/VAX构建成功.免疫小鼠后实验组小鼠血清和唾液抗PAc、抗GLU和抗CAT抗体水平均显著高于空载体对照组(P<0.01).血清特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现,分别为62.13μg/ml和11.43 μg/ml;唾液特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现,分别为0.67%和0.80%.大鼠龋齿保护实验结果显示在变异链球菌和表兄链球菌定菌鼠中实验组釉质龋(E),牙本质浅龋(Ds)和牙本质中龋(Dm)均显著低于pVAX1免疫组(P<0.05),实验组Ds和Dm均低于pGJA-P/VAX免疫组,但两组间E差异没有统计学意义(P>0.05).结论 复合防龋DNA疫苗构建成功,可在真核细胞中正确表达,动物实验证实能有效地诱导黏膜和系统体液免疫反应,并增强了DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用.     

肺炎链球菌绿色荧光蛋白报告质粒的构建及评价

目的：构建一个可高效报告基因表达的绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）报告质粒,为采用差异荧光诱导（Differential fluorescence induetion,DFI）技术筛选肺炎链球菌（Streptoccus pneumoniae,S．pn）体内诱导的毒力基因奠定基础。方法：酶切质粒pGreenTIR的SD-ENH-GFP片段,将其插入含氯霉素抗性基因的自杀质粒pEVP3中,构建以绿色荧光蛋白为报告基因的自杀质粒pEVP3-SDGFP。再将肺炎链球菌的溶血素基因（Pneumolysin,ply）上游约500bp片段插入到该质粒报告基因上游的多克隆位点中,得到质粒pEVP3-SDGFP-Ply,将其转化入肺炎链球菌TIGR4中,比较新建质粒pEVP3-SDGFP与同样处理质粒pEGFP-1（报告基因gfp前无SD及ENH序列）报告上游基因表达的情况。结果：通过体内、外实验证实新建质粒pEVP3-SDGFP不但可以报告肺炎链球菌溶血素基因的表达,并且其报告上游基因表达的能力明显强于质粒pEGFP-1。结论：所构建的质粒pEVP3-sDGFP可用于DFI筛选肺炎链球菌体内诱导基因所需启动子诱捕文库的构建。