一种新基因型SHV-28 β-内酰胺酶的发现及其特性的初步研究

浙江大学医学院附属第一医院传染科俞云松等,为鉴定产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的肺炎克雷伯菌SHV型β-内酰胺酶(BLA)的编码基因、BLA亚型并初步研究其特性,采用聚合酶链反应扩增BLA编码基因片段,克隆人pGEM-Teasy载体,用双脱氧链终止法测定了核苷酸序列、确定亚型,并     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶基因型研究

目的：分析临床大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中超广谱β-内酰胺酶的基因型分布以及产ESBLs细菌中头孢菌素酶的存在情况。方法：质粒接合实验分析耐药性转移，根据超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶各种已知基因序列设计引物，进行聚合酶链反应分析，确定超广谱β-内酰胺酶的基因型分布以及头孢菌素酶基因。结果：80.4％的菌株质粒接合实验成功，66％的菌株为TEM基因型，14％的菌株为SHV基因型，10％的菌株为CTX-M型。2株菌同时存在AmpC酶。TEM阳性的大肠埃希菌RAPD带型呈多样性。结论：临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性可以发生转移，ESBLs以TEM基因型为主，部分菌株为SHV、CTX-M型。同一菌株内可以产生2种不同基因型的超广谱β-内酰胺酶。产ESBL菌株不是以细菌克隆播散为主。     

肺炎克雷伯菌TEM-1编码基因的克隆测序及基因定位

目的 以我院临床分离的一株肺炎克雷伯菌99—799株为研究对象，对其所产β-内酰胺酶编码基因的序列、亚型及基因定位进行研究。方法 采用聚合酶链反应(PCR)，用β-内酰胺酶通用引物、blaTEM扩增获得β-内酰胺酶编码基因的片段，克隆入pUCm—T载体，以双脱氧链终止法测定核苷酸序列，再通过GenBank进行同源性检测确定其亚型和基因所在位置。结果 肺炎克雷伯菌99—799株所含β-内酰胺酶基因型为TEM型，与TEM-1编码基因序列完全相同，且同时位于细菌150 bp和80bp的大、小质粒上。结论 重庆地区临床分离肺炎克雷伯菌有TEM—1-β内酰胺酶基因亚型的存在.     

下呼吸道产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌的耐药性基因型分析

目的:观察下呼吸道产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases,ESBLs)肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌耐药菌株耐药基因分型,并探讨耐药菌株的流行状况及发生耐药的机制。方法:按常规方法进行细菌分离、培养和菌种鉴定。采用微量液体稀释与K-B法,分别对常用抗生素和头孢哌酮/舒巴坦的耐药性进行检测。采用纸片法确证产超广谱β-内酰胺酶菌株,并应用PCR技术进一步扩增TEM型、SHV型β-内酰胺酶的基因型。结果:产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对AMP、AMP/SB、PIP、CF、CFZ、CRM、CPD、CAX、CAZ、CTX、CPE和AZT的耐药率高达90%以上。产ESBLs肺炎克雷伯菌中产TEM型、SHV型、TEM和SHV型β-内酰胺酶基因的百分率分别为26.92%、30.76%、7.69%,大肠埃希菌百分率分别为46.15%、5.12%、10.25%。结论:产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对多种不同种类抗生素耐药,且具有多重耐药的特点。产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌携带TEM或SHV型β-内酰胺酶基因,其中肺炎克雷伯菌以产SHV型β-内酰胺酶为主,大肠埃希菌则以产TEM型β-内酰胺酶为主。     

肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶基因型分布

目的阐明广州地区肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶基因型分布。方法用药敏纸片法对67株耐三代头孢菌素类抗生素的肺炎克雷伯菌进行超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)表型筛选,采用PCR检测β-内酰胺酶耐药基因,对部分ESBLs菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)。结果 67株菌中有58株菌ESBLs表型阳性,β-内酰胺酶基因检测显示,44株产CTX-M、43株产SHV(其中10株产超广谱的SHV)、14株产OXA-1群、38株产TEM,7株菌产AmpC。产CTX-M的菌株有20株产CTX-M-1群(包括15株产CTX-M-15)和24株产CTX-M-9群(包括14株产CTXM-14)。PFGE结果显示产ESBLs菌株同源性低。结论广州地区耐三代头孢肺炎克雷伯菌以产CTX-M-1群和CTX-M-9群ESBLs为主。     

多重耐药肺炎克雷伯菌Kp1503的ESBLs基因型分析

目的:了解广东汕头临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌Kp1503株的耐药表型与基因亚型。方法:以琼脂稀释法测定Kp1503株对12种抗菌药物的MIC;设计TEM、SHV和CTX-M型全编码基因特异性引物,用聚合酶链反应(PCR)扩增获得其β-内酰胺酶编码基因,分别克隆入pMD18-T载体后测定其核苷酸序列,分析其基因亚型。结果:Kp1503株为多重耐药株,除对亚胺培南和环丙沙星敏感外,对庆大霉素、阿米卡星、四环素、头孢唑林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、哌拉西林/三唑巴坦均耐药;其所携带的三种β-内酰胺酶基因序列分别与GenBank中TEM-1、SHV-12及CTX-M-3型编码基因序列的同源性为100%。结论:汕头地区存在同时产SHV-12、CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶及TEM-1型广谱β-内酰胺酶的多重耐药肺炎克雷伯菌。     

124株肺炎克雷伯菌耐药性分析和产ESBLs株耐药基因分型研究

目的 探讨肺炎克雷伯菌耐药性以及超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因型的流行状况.方法 用K-B法检测肺炎克雷伯菌对24种常用抗生素的耐药情况;用PCR扩增所有产酶株的TEM、SHV及CTX-M基因片段,分析ESBLs各基因型的流行状况.结果 肺炎克雷伯菌除对碳青霉烯类药物敏感外,对其他抗生素耐药严重;产ESBLs肺炎克雷伯菌检出50株,检出率40.32％.ESBLs基因分型结果显示,多株同时携带2种或2种以上基因型,且多为CTX-M型与TEM型或SHV型基因共同存在.结论 常用抗菌药物耐药严重、呈多重耐药.ESBLs检出率较高,产ESBLs肺炎克雷伯菌的基因型以CTX-M为主.     

革兰阴性杆菌β-内酰胺酶表型和基因型研究

目的了解铜陵地区临床分离的革兰阴性杆菌产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、头孢菌素酶(AmpC酶)和金属β-内酰胺酶(MBL)的分布情况,并检测产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的ESBLs基因型鉴定。方法采用三维试验检测革兰阴性杆菌产ESBLs和AmpC酶,纸片协同法检测MBL,用聚合酶链反应(PCR)对ESBLs表型阳性的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行TEM型、SHV型、CTX-M型三种耐药基因检测并克隆测序。结果356株革兰阴性杆菌检出产酶株90株,检出率25.3%。单产ESBLs革兰阴性杆菌57株,检出率16.0%,以肺炎克雷伯(31.6%)、大肠埃希菌(31.0%)检出率高;单产AmpC酶4株,检出率1.1%,其中阴沟肠杆菌3株;同时产ESBLs和AmpC酶16株,检出率4.5%,以鲍曼不动杆菌(12.5%)检出率最高;产MBL细菌13株,均为非发酵菌,以嗜麦芽窄食单胞菌检出率最高,为71.4%。17株ESBLs表型阳性的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌有16株检出ESBLs耐药基因,其中CTX-M型15株(88.2%),TME型13株(76.1%),SHV型2株(11.8%),有11株细菌同时带有两种ESBLs基因,1株带有3种ESBLs基因。结论革兰阴性杆菌产生ESBLs、AmpC酶和MBL多种β内酰胺酶,铜陵地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs基因型以CTX-M型为主。     

新生儿科病房产ESBLs分离株耐药基因初步分型

目的:了解新生儿科病房产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)分离株基因型分布情况.方法:用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的表型确证方法,对我院新生儿科病房分离的非重复的34株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行ESBLs确证.分别用TEM、SHV和CTX-M通用引物对ESBLs阳性株进行聚合酶链反应(PCR),PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,用凝胶成像系统观察结果进行初步分型.结果:34株细菌中,检出ESBLs阳性菌17株,检出率为50 %.17株ESBLs菌中TEM基因阳性2株,SHV基因阳性15株,CTX-M基因阳性9株;其中,8株单SHV基因阳性,2株TEM、CTX-M基因同时阳性,7株SHV、CTX-M基因同时阳性.结论:SHV型ESBLs是新生儿科病房最常见的ESBLs,其中产ESBLs肺炎克雷伯菌SHV基因的携带率为100 %,CTX-M型也较为常见.     

鲍曼不动杆菌SHV-12型超广谱β内酰胺酶基因研究

目的：分析自临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)鲍曼不动杆菌SHV型β-内酰胺酶耐药基因序列，并确定其所产ESBLs亚型。方法：从住院病人的送检标本中分离的60株鲍曼不动杆菌中，经药敏试验、ESBLs表型确证试验和SHV型β内酰胺酶耐药基因的聚合酶链反应(PCR)检测，筛选出1株具有多重耐药特性、ESBLs表型和SHV基因型均阳性的分离株(HZ02株)，对其耐药基因进行序列分析。结果：HZ02株基因片段长825个核苷酸，与Nuesch-Inderbinen等从肠杆菌中发现的SHV—12型ESBLs编码基因序列(GenBank注册号：X98105)完全相同。结论：HZ02株鲍曼不动杆菌可产生SHV—12型ESBLs，从而证实了我国临床分离的鲍曼不动杆菌中存在产SHV—12亚型ESBLs菌株。其序列已在美国核酸数据库(GenBank)登录(注册号：AY29163)。     

产ESBLs分离株耐药基因初步分型

目的了解产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌和克雷伯菌的主要基因型分布特点。方法用表型确证试验筛选出临床标本中产ESBLs的大肠埃希菌和克雷伯菌114株。应用PCR方法扩增产酶株的TEM、SHV和CTX-M基因。结果PCR结果显示TEM、SHV和CTX-M基因的总阳性率分别为40.4%、20.7%和83.3%,其中大肠埃希菌分别为48.1%、1.3%和93.5%,肺炎克雷伯菌分别为24.3%、81.1%和62.2%。46.8%的大肠埃希菌和51.4%的肺炎克雷伯菌同时携带多个基因。结论产ESBLs大肠埃希菌的主要基因型为CTX-M,肺炎克雷伯菌主要基因型为SHV。大多数菌株同时携带多个基因。     

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药基因序列分析

目的研究沈阳地区产超广谱β-内酰胺酶（extended—spectrumβ-lactamases,ESBLs）肺炎克雷伯菌的基因型分布。方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增分离31株产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌株的TEM型、SHV型及CTX—M-1型ESBLS基因,1％琼脂糖凝胶电泳,回收DNA片段,测序分析各基因型在耐药的产超光谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌株中的分布。结果TEM-1、SHV-1、CTX—M-1基因扩增阳性率分别为58．0％、90．3％、16．1％。结论分离的ESBLs阳性的肺炎克雷伯菌存在多个耐药基因。     

产超广谱β内酰胺酶肺炎克雷伯菌基因型研究

目的：了解泸州地区临床分离产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌的ESBLs基因型的流行特征。方法：用聚合酶链反应法（PCR）对ESBLs菌株进行扩增,产物行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果,明确ESBLs基因型。结果：97株产ESBLs菌株中基因分布数据为TEM基因型15株（15.5%）,SHV基因型17株（17.5%）,非TEM、非SHV基因型占67.0%。结论：本地区产ESBLs肺炎克雷伯菌基因型部分为TEM型和SHV型,较大部分为其他型ESBLs。     

广州地区肺炎克雷伯菌产TEM型及SHV型β-内酰胺酶基因表型的研究

目的对广州地区产β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌TEM型和SHV型基因型及其分子流行病学进行研究。方法对57株产β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌进行blaTEM和blaSHV基因扩增,分别采用变性高效液相色谱技术和测序法对扩增产物进行分析,以明确基因类型。结果57株肺炎克雷伯菌均扩增出blaTEM和blaSHV基因。测序结果表明,TEM-116 ESBL32株,占54．2％;SHV型以SHV-12为主,占33．3％,其次为SHV-11和SHV-2a等,还发现5种新的SHV基因亚型。54株菌株同产TEM和SHV型β-内酰胺酶,占94．7％;其中13．0％同产TEM-116和SHV-12ESBL。结论TEM-116和SHV-12分别是广州地区产β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌TEM型及SHV型耐药质粒主要的基因亚型,blawTEM和blaSHV在肺炎克雷伯菌中同产的比例很高,这提示本地区即将或已经面临肺炎克雷伯菌新耐药机制的抵抗和流行,必须加强对产ESBL肺炎克雷伯菌的分子流行病学监测。     

儿童临床产ESBLs菌基因型分布及其耐药特征的研究

目的:对本地区2002～2004年儿童临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)细菌的流行特点和基因型别进行分析,了解产ESBLs细菌的耐药基因的型别分布和耐药特征变化情况.方法:用microscan walkaway-4.0细菌鉴定仪对4022株革兰氏阴性菌鉴定到种并做药敏分析,K-B法确认产ESBLs菌株,并用PCR法扩增,筛选其中108株ESBLs阳性菌株进行初步基因分型.结果:产ESBLs菌1468株,大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌的分别为52.5%和65.8%;总产酶率为58.0%;2002～2004年产酶率分别为:68.2%、56.9%、50.8%.PCR初步分型结果表明:108株ESBLs菌检测到TEM、SHV及CTX三种基因型;大肠埃希氏菌59株,主要为TEM型(56/59);肺炎克雷伯菌29株,主要为SHV型(28/29);阴沟肠杆菌13株,以TEM型为主(12/13);铜绿假单孢菌7株,以TEM型为主(6/7).2002年以TEM型为主(75%),2003年主要为TEM型(40%)和SHV型(57.1%),2004年主要为TEM型(90.9%),CTX为少见基因型(3.7%).产ESBLs菌对青霉素类、氨曲南及头孢菌素类抗生素耐药率为56.2%～100%,具有多重耐药特点.结论:产ESBLs菌发生率在逐年下降,产ESBLs菌主要携带TEM和SHV型β-内酰胺酶基因,其中绝大部分产TEM型β-内酰胺酶;但耐药情况不容乐观;提示临床应加强细菌耐药性与基因型变化的了解,合理用药,减少耐药菌的产生,更好的控制院内感染.     

产ESBLs与AmpC大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型分析

目的 了解产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)与AmoC酶大肠埃希菌(escherichia coli,ECO)和肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae,KPN)的基因型特征.方法 用表型确证试验从临床分离的74株ECO和KPN中筛选出16株产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)、4株产AmpC酶及25株产ESBLs AmpC菌株.应用多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),扩增菌株的TEM,SHV和CTX-M-G1型超广谱β-内酰胺酶基因和DHA-1,ACT-1型AmpC酶基因,并对PCR产物经凝胶电泳后进行初步的分析.结果 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌携带TEM,SHV,CTX-M-G1,DHA-1和ACT-1基因的检出率分别为54.2%,50.0%,62.5%,57.1%,35.7%;29.4%,52.9%,41.2%,66.7%,46.7%.相当一部分菌株同时携带2种或2种以上的基因型.结论 产ESBLs与AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为多重耐药菌株,存在多种耐药基因.应采取积极的措施防止产酶菌株的流行.     

产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药型与基因分型

目的 分析肺炎克雷伯菌的耐药现状,探讨其耐药型与基因组型间的关系,检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)各基因型的流行状况.方法 用纸片扩散法检测117株肺炎克雷伯菌对20种抗生素的耐药情况.用PFGE实验探讨耐药表型与基因组型间的关系.用PCR扩增所有产酶株的TEM、SHV及CTX-M基因片段,分析ESBL各基因型的流行状况.结果 肺炎克雷伯菌耐药情况严重,产ESBL肺炎克雷伯菌检出率达到43.59%.PFGE将117株肺炎克雷伯菌分为3群,群间相似度为37.30%,没有发现特异的ESBL条带.PCR扩增检出SHV型15株,占29.40%;TEM型39株,占76.50%;CTX-M型9株,占17.60%.同时携带SHV、CTX-M基因者有19株,占37.30%.结论 该院肺炎克雷伯菌的耐药现象严重、多重耐药现象突出,ESBL检出率高.该次实验未发现由同一菌株所致的医院感染,肺炎克雷伯菌的耐药表型与PFGE基因分型结果 可以表现一致,也可以表现为不同.产ESBL肺炎克雷伯菌的基因型以TEM和SHV为主,同一菌株携带多个基因的现象较为普遍.     

肺炎克雷伯杆菌40株超广谱β内酰胺酶基因的分型

目的：分析肺炎克雷伯杆菌临床分离株中超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的主要基因型。方法：用表型确证试验检出产ESBL。的肺炎克雷伯杆菌40株，分别用TEM、SHV和CTX-M通用引物对这些耐药株进行聚合酶链反应(PCR)扩增。结果：PCR扩增结果显示，TEM、SHV和CTX-M的阳性率分别为30％、60％和45％。结论：SHV和CTX．M型是南京医科大学第一附属医院产ESBLs菌株的主要基因型。     

产ESBLs大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的基因分型研究

目的了解广东省中医院产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的流行、耐药基因型分布。方法对广东省中医院2001年7月至2003年8月间临床分离保存的208株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,用Vitek-32细菌鉴定仪进行细菌鉴定,用双纸片法进行ESBLs初筛,用NCCLS 1999年推荐的确证方法进行ESBLs确证。并采用PCR扩增和PCR产物测序方法对产ESBLs菌株进行基因分型。结果分离到产ESBLs细菌76株,总检出率为36．5％,其中肺炎克雷伯菌阳性率为41．9％（39／93）、大肠埃希菌阳性率为32．2％（37／115）,PCR初步分型结果表明：TEM型42株（55．3％）,均为TEM-1型、CTX-M型27株（35．5％）,SHV型33株（43．4％）。结论CTX-M型和SHV型是我院产ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中流行的基因型。     

儿童产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药性及基因型研究

目的 了解笔者医院儿童产β内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌的耐药性及基因分型,为临床合理使用抗生素提供依据。方法 收集2017年7月~2018年7月从笔者医院常规分离的临床痰液、尿液、血液等各标本进行培养,对肺炎克雷伯菌进行ESBLs筛选及确证。对确证110株产超广谱β-内酰胺酶临床菌株进行19种抗生素的药敏试验,观察产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药性。分析了产生肺炎克雷伯菌的ESBL质粒谱,并对产生肺炎克雷伯菌的ESBL携带的ESBL抗性基因进行了扩增和PCR分型。结果 产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌表现为多重耐药性,对头孢唑啉、头孢唑啉、头孢噻嗪、头孢噻嗪等头孢菌素具有较高的耐药性,耐药率为77.2%～86.0%。酶抑制复合制剂的耐药率为31.8%～80.0%,对亚胺培南耐药率为0。耐药基因型检出率中,SHV型占4.5%,CTX-M-9型占32.7%,TEM型占41.8%,CTX-M-1型占42.7%。另有41株(37.3%)检测到两种或两种以上耐药基因型,其中以CTX-M-1型与TEM型或CTX-M9型为主。结论 超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的产生引起对多种抗生素具有多重耐药性,临床应重视其检测和药敏试验。亚胺培南等碳青霉烯类抗生素目前仍是治疗产广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌感染最有效的药物。