骨形态发生蛋白的提取,纯化及诱导成骨的实验报告

目的 提取，纯化牛骨形态发生蛋白（ＢＭＰ）并验证其异位诱导成骨的活性。方法采用生物化学方法提取并纯化出ＢＭＰ，植入家兔肌肉和豚鼠颅骨进行动物实验研究，结果植入ＢＭＰ组１４ｄ即有成纤维细胞转化为软骨细胞；第２１，２８天形成软骨和骨组织，成年豚鼠颅骨缺损修复过程中，植入ＢＭＰ后第２８天即有骨痂生成，８４ｄ时颅骨缺损修复完整，结论ＢＭＰ有明显的异位诱导骨形成作用。     

骨形态发生蛋白的提取、纯化及诱导成骨的实验报告

①目的提取、纯化牛骨形态发生蛋白（ＢＭＰ）并验证其异位诱导成骨的活性。②方法采用生物化学方法提取并纯化出ＢＭＰ，植入家兔肌肉和豚鼠颅骨中进行动物实验研究。③结果植入ＢＭＰ组，１４ｄ即有成纤维细胞转化为成软骨细胞；第２１，２８天形成软骨和骨组织。成年豚鼠颅骨缺损修复实验中，植入ＢＭＰ后第２８天即有骨痂生成，８４ｄ时颅骨缺损修复完整。④结论ＢＭＰ有明显的异位诱导骨形成作用     

骨形态发生蛋白对人骨髓基质细胞的体外成骨分化影响

目的 提取牛骨形态发生蛋白，并观察其对人骨髓基质细胞的体外成骨分化作用，为将骨形态发生蛋白与骨髓基质细胞用于进一步的缺损修复研究提供实验依据。方法 从小牛骨中的提取骨形态发生蛋白，配制条件培养液，并作用于培养状态的人骨髓基质细胞，染色检测细胞碱性磷酸酶，I型胶原表达情况，放免法测定培养液中骨钙素含量。结果 人骨髓基质细胞经衣导培养后，碱性磷酸酶，I型胶原，骨钙素表达明显增加。结论 体外培养时，天然骨形态发生蛋白可促进人骨髓基质细胞的成骨分化。     

骨形态发生蛋白-2在骨修复中的作用研究进展

骨修复是一个十分复杂的过程，受到多种因素的控制，其中骨生长因子对于局部成骨的重要作用已经实验证实，而骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是诸多因子中唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。在BMPs众多亚型中最重要的并且近年来研究较多的是骨形态发生蛋白-2（BMP-2），本文仅对BMP-2在骨修复过程中的作用研究进展综述如下。     

骨不连原因的实验研究

本实验用免疫组化的方法，对兔尺骨人为骨折断端不同时间的取材标本和骨不连病人手术凿下的骨折处理硬化组织标本，进行了骨形态形成蛋白单克隆抗体染色观察。结果提示，在骨折愈合过程中，除手术，复位，内外固定等因素外，骨折愈合早期阶段，局部骨形态蛋白的存在与否可能与骨连有一定的关系。     

犬甲状软骨缺损应用骨形态发生蛋白材料修复的实验研究（摘要）

目的 :通过比较骨形态发生蛋白 -纤维蛋白复合物、骨基质明胶、羟基磷灰石作为甲状软骨缺损移植的修复效果 ,为临床应用探索一种理想的喉软骨修复材料 .方法 :骨基质明胶是通过化学方法从牛皮质骨中制备 .骨形态发生蛋白 -纤维蛋白复合物是将纯化的骨形态发生蛋白与人血浆提取的纤维蛋白凝块复合而成 .我们将 2 0只实验用犬分为 4组 ,每只犬的甲状软骨上均手术作出 4块4mm× 4mm大小的全厚缺损 .A组的不放移植物 ;B组填充羟基磷灰石颗粒修复 ;C组填充骨基质明胶块修复 ;D组填充骨形态发生蛋白 -纤维蛋白复合物修复 .标本采用光镜和电镜检…     

重组人骨形态发生蛋白—2／7融合基因的构建及其在大肠杆菌 …

构建重组人骨形态发生蛋白－２／７融合体,研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用ＤＮＡ重组技术,将编码人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的０．３６ｋｂ基因片段与编码人骨形态发生蛋白－７（ＢＭＰ－７）成熟肽的０．４４ｋｂ基因片段连接,得到重组人骨形态发生蛋白－２／７融合基因;经测序鉴定后,将其克隆到表达载体ｐＢＶ２２２中,转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,温度诱导表达,表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小     

重组人骨形态发生蛋白-2/7融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和初步活性测定

构建重组人骨形态发生蛋白－２／７融合体, 研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用ＤＮＡ 重组技术,将编码人骨形态发生蛋白－２ （ＢＭＰ－２） 成熟肽的０．３６ ｋｂ 基因片段与编码人骨形态发生蛋白－７ （ＢＭＰ－７） 成熟肽的０．４４ｋｂ 基因片段连接,得到重组人骨形态发生蛋白－２／７ 融合基因; 经测序鉴定后,将其克隆到表达载体ｐＢＶ２２２中,转化大肠杆菌ＤＨ５α, 温度诱导表达。表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小鼠成骨样细胞增殖、分化及碱性磷酸酶活性的影响。克隆质粒转化的工程菌,经４２℃诱导４～６ ｈ 后,高效表达重组人骨形态发生蛋白－２／７, 在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一新的蛋白带, 分子量约２９ ｋｕ,约占菌体总蛋白的２０％ ,表达蛋白以包涵体的形式存在,经初步纯化、裂解、复性后的ＢＭＰ－２／７ 蛋白具有促进成骨样细胞分化、增殖及增加碱性磷酸酶活性的作用。ＢＭＰ－２／７ 融合基因的构建和表达,可能提供一种全新的具有诱导成骨作用的蛋白     

骨形成蛋白诱导成骨性分化的实验研究

通过动物实验和细胞培养，观察到骨形成蛋白在体现人诱导异位成骨，在体外诱导人胚骨间质细胞、动脉瘤样骨囊是质主其转化成软骨分化的效应，本实验为解释临床上动脉瘤样骨囊蹲点 骨肉瘤的伴发提供了一定的实验依据。     

重组人骨形成蛋白—2成熟肽在大肠杆菌中的高效表达

利用大肠杆菌系统高效表达人骨形成蛋白－２成熟肽。方法；将编码人骨形成蛋白２成熟肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体ｐＤＨ上，使其受控于ＰＲＰＬ启动子，构建成表达质粒ｐＤＨＢ２ｍ，以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌。对工程菌进行温度诱导表达，表达产物初步纯化后进行复性处理，用小鼠肌袋模型检测产物诱骨活性。     

人重组骨形态发生蛋白Ⅲ在大肠杆菌中的表达及活性测定

本文报道了利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组骨形态发生蛋白Ⅲ。运用ＰＣＲ技术，从质粒ｐＳＰ６４／ｈＢＭＰ３中扩增出约０．３３ｋｂ的ｈＢＭＰ３ｃＤＮＡ片断，然后亚克隆到表达质粒ｐＭＳ３１ｂ申，在大肠杆菌一成功地高效表达出人ＢＭＰ３融合蛋白，表达产物具有体内诱导异位化骨的趋势。     

Osteogenic potential of the human bone morphogenetic protein 2 gene activated nanobone putty

Background Nanobone putty is an injectable and bioresorbable bone substitute. The neutral-pH putty resembles hard bone tissue, does not contain polymers or plasticizers, and is self-setting and nearly isothermic, properties which are helpful for the adhesion, proliferation, and function of bone cells. The aim of this study was to investigate the osteogenic potential of human bone morphogenetic protein 2 （hBMP2） gene activated nanobone putty in inducing ectopic bone formation, and the effects of the hBMP2 gene activated nanobone putty on repairing bone defects.
Methods Twenty four Kunming mice were randomly divided into two groups. The nanobone putty ＋ hBMP2 plasmid was injected into the right thigh muscle pouches of the mice （experiment side）. The nanobone putty ＋ blank plasmid or nanobone putty was injected into the left thigh muscle pouches of the group 1 （control side 1） or group 2 （control side 2）, respectively. The effects of ectopic bone formation were evaluated by radiography, histology, and molecular biology analysis at 2 and 4 weeks after operation. Bilateral 15 mm radial defects were made in forty-eight rabbits. These rabbits were randomly divided into three groups： Group A, nanobone putty ＋ hBMP2 plasmid; Group B, putty ＋ blank plasmid; Group C, nanobone putty only. Six rabbits with left radial defects served as blank controls. The effect of bone repairing was evaluated by radiography, histology, molecular biology, and biomechanical analysis at 4, 8, and 12 weeks after operation.
Results The tissue from the experimental side of the mice expressed hBMP2. Obvious cartilage and island-distributed immature bone formation in implants of the experiment side were observed at 2 weeks after operation, and massive mature bone observed at 4 weeks. No bone formation was observed in the control side of the mice. The ALP activity in the experiment side of the mice was higher than that in the control side. The tissue of Group A rabbits expressed hBMP2 protein and higher ALP level. The ne     

人骨形态发生蛋白12前体蛋白cDNA的克隆及序列分析

目的克隆人骨形态发生蛋白12前体蛋白的基因。方法根据Genbank人骨形态发生蛋白12的基因序列合成两条引物,从人胎盘组织中提取总RNA,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出长920 bp编码人骨形态发生蛋白12(BMP12)前体蛋白的基因序列。将所得的基因片段插入载体pTARGETTM质粒中并转化大肠杆菌JM109,提取重组质粒进行鉴定并测序。结果RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示一长约920 bp的条带,阳性克隆质粒经PCR扩增出约920 bp的片段,全自动DNA测序结果表明和Genbank中的序列完全相符。结论通过RT-PCR可从人胎盘组织中成功地克隆出人BMP12前体蛋白基因,基因序列完全正确。     

hBMP-7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSc)增殖和向成骨细胞分化的影响。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染BMSc,免疫组织化学方法检测hBMP-7蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况。结果经BMP-7基因转染的兔BMSc有hBMP-7的阳性表达,增殖能力无明显改变(P>0.05),但其合成碱性磷酸酶的能力得到显著提高,与空载体病毒液转染、未经转染的BMSc相比差异有显著性(P<0.01)。结论经BMP-7基因转染的BMSc能够表达外源BMP-7,hBMP-7基因转染能够促进体外培养的BMSc向成骨细胞转化,可用于以BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。     

昆虫杆状病毒表达系统中人骨形成蛋白3的表达及鉴定

探索人骨形成蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达规律。方法将ｈＢＭＰ３全长ｃＤＮＡ克隆入转移载体ＢａｃＰＫ８中,酶切鉴定后,将此载体与病毒ＤＮＡ经脂质体包裹转染昆虫细胞,重组病毒经蓝白选后,提取其ＤＮＡ进行ＰＣＲ反应,鉴定目的基因。收集重组病毒感染５ｄ的细胞进行免疫荧光及电子显微镜观察。结果克隆了目的基因的重组载体经内切酶消化后,琼脂糖电泳示有相应大小的目的基因片段切下,ＰＣＲ电泳结果见有目的基因片段的     

hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达

目的:研究人骨形态发生蛋白(Human bone morphogenetie protein,hBMP)9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达,为下一步研究hBMP9对骨肉瘤的体内外作用奠定实验基础.方法:利用免疫细胞化学法和Western blot法检测hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达.结果:在MG63、U2OS和143B中,hBMP9均呈不同程度的阳性表达,并且两种检测方法所得结果一致.结论:hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中均有内源性表达.     

人骨形态发生蛋白12前体蛋白cDNA的克隆及序列分析

目的 克隆人骨形态发生蛋白12前体蛋白的基因。方法 根据Genbank人骨形态发生蛋白12的基因序列合成两条引物，从人胎盘组织中提取总RNA，用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出长920bp编码人骨形态发生蛋白12(BMP12)前体蛋白的基因序列。将所得的基因片段插人载体pTARCET^TM质粒中并转化大肠杆菌JM109，提取重组质粒进行鉴定并测序。结果 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示一长约920bp的条带．阳性克隆质粒经PCR扩增出约920bp的片段，全自动DNA测序结果表明和Genbank中的序列完全相符。结论 通过RT-PCR可从人胎盘组织中成功地克隆出人pMP12前体蛋白基因，基因序列完全正确。     

CO-TRANSFECTION OF RAT BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS WITH HUMAN BMP2 AND VEGF165 GENES

Objective To explore the feasibility and efficacy of lentivirus-mediated co-transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) gene and human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2) gene. Methods The hVEGF165 and hBMP2 cDNAs were obtained from human osteosarcoma cell line MG63 and cloned into lentiviral expression vectors designed to co-express the copepod green fluorescent protein (copGFP). The expression lentivector and packaging Plasmid Mix were co-transferred to 293TN cells, which produced the lentivirus carrying hVEGF165 (Lv-VEGF) or hBMP2 (Lv-BMP), respectively. MSCs of Wistar rats were co-transfected with Lv-BMP and Lv-VEGF (BMP+VEGF group), or each alone (BMP group and VEGF group), or with no virus (Control group). The mRNA and protein expressions of hVEGF165 and hBMP2 genes in each group were detected by real-time PCR and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Lentiviral expression vectors carrying hVEGF165 or hBMP2 were correctly constructed and confirmed by restriction endonucleses analysis and DNA sequencing analysis. A transfer efficiency up to 90% was archieved in all the transfected groups detected by the fraction of fluorescent cells using fluorescent microscopy. From the results generated by real-time PCR and ELISA, VEGF165 and BMP2 genes were co-expressed in BMP+VEGF group. No significant difference of BMP2 expression was detected between BMP+VEGF and BMP groups (P>0.05). Similarly, there was no significant difference of VEGF165 expression between BMP+VEGF and VEGF groups (P>0.05). Conclusion VEGF165 and BMP2 genes were successfully co-expressed in MSCs by lentivirus-mediated co-transfection, which provided a further foundation for the combined gene therapy of bone regeneration.     

人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞及对其增殖的影响

目的 :用人骨形态发生蛋白 - 2腺病毒表达载体 ( Ad- BMP- 2 )转染人骨髓基质干细胞( h BMSC) ,以探讨基因转染对 h BMSC增殖的影响。方法 :将 Ad- BMP- 2转染体外培养的成人骨髓基质干细胞 ,利用免疫组化、原位杂交染色方法检测细胞内骨形态发生蛋白 - 2 ( BMP- 2 )的表达 ,蛋白印迹法检测转染后细胞培养液中 BMP- 2分泌蛋白表达。然后通过流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。结果 :转染后 ,h BMP- 2基因在 m RNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有 BMP- 2蛋白阳性表达。转染 h BMP- 2基因后 ,细胞经流式细胞仪分析 ,S期细胞比例增多 ,说明细胞 DNA的合成增加。结论 :Ad- BMP- 2可高效转染 h BMSC,且促进细胞增殖     

重组hBMP7基因转染成纤维细胞及其表达

目的 探讨重组骨形态发生蛋白-7腺病毒载体(AdCMV-BMP7)在人真皮成纤维细胞获得稳定表达的可行性。方法 重组腺病毒载体AdcMV-BMP7经293细胞包装、扩增后，转染人真皮成纤维细胞。转染48h后以免疫组织化学、RT-PCR等方法检测hBMP7基因在人真皮成纤维细胞内的表达情况。结果 在合适的滴度下，重组腺病毒载体AdCMV-BMP7对成纤维细胞的增殖能力无明显影响。转染48h后免疫细胞化学显示已转染AdCMV-BMP7的成纤维细胞内有大量的hBMP7表达，RT-PCR也检测到特异的hBMP7基因片段的表达。结论 重组腺病毒载体AdcMV-BMP7能够被转导入成纤维细胞内。并稳定表达hBMP7。