LRIG1相关功能片段对EGFR活性和胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨人多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（LRIG1）相关功能片段对表皮生长因子受体（EGFR）下游信号通路的影响及对人脑胶质瘤细胞增殖活性的影响。方法 构建缺失LRIG1胞内段（LRIG1-ET）的和缺失LRIG1胞外段（LRIG1-TC）的真核表达质粒,将这两个质粒及LRIG1全长（LRIG1-FL）质粒分别转染脑胶质瘤U251细胞系和原代星形胶质细胞瘤细胞,用蛋白质印迹技术检测EGFR下游信号蛋白有丝分裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK/MEK）的磷酸化水平,用MTT法检测转染细胞的增殖活性。结果 全长LRIG1、LRIG1胞外段、LRIG1胞内段对人脑U251细胞和原代胶质瘤细胞的增殖活性均有抑制作用;全长LRIG1蛋白的抑制作用最强,其次为胞内段,再次为胞外段。全长LRIG1、LRIG1胞外段、LRIG1胞内段均使原代星形胶质细胞瘤细胞的MEK蛋白磷酸化水平下降。结论 LRIG1全长、胞外段、胞内段均能通过抑制EGFR下游信号抑制U251细胞和原代星形胶质瘤细胞的细胞增殖;LRIG1胞外段和胞内段具有独立的功能,均有可能对人脑胶质瘤的治疗发挥重要作用。     

LRIG1抑制人脑胶质瘤细胞增殖的研究

目的探讨多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（LRIG1）对人脑胶质瘤细胞增殖的影响。方法分别构建携带LRIG1、LRIG1小干扰RNA、Bcl2和胶质细胞源性生长因子（BDMF）的质粒,将它们分别转染到人脑胶质瘤细胞系U251细胞内,应用细胞计数试剂盒8法检测细胞活性的变化,蛋白印迹法检测LRIG1、Bcl2、拓扑异构酶Ⅱ（topoⅡ）、GDNF的表达变化。结果成功构建携带LRIG1、LRIG1小干扰RNA、Bcl2、GDNF的质粒,并成功转入U251细胞株。过表达LRIG1显著抑制U251细胞增殖。蛋白印迹法结果显示LRIG1的表达和Bcl2、topoⅡ和GDNF的表达呈显著负相关。结论LRIG1通过负性调节Bcl2、topoⅡ和GDNF的表达抑制人脑胶质瘤细胞系U251细胞的增殖。     

LRIG2基因全长及胞外段抑制胶质瘤细胞系U87凋亡的机制

目的研究富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因全长及胞外段抑制胶质瘤细胞系U87凋亡的机制。方法将LRIG2全长(LRIG2),LRIG2胞外段(LRIG2ecto)及空白对照(Con)慢病毒表达载体分别感染U87,筛选获得稳定细胞株;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞线粒体膜电位;Western blotting检测凋亡相关蛋白及信号通路蛋白表达。结果 LRIG2及LRIG2ecto过表达组细胞凋亡率分别为2.86%±0.30%和4.04%±0.59%,明显低于对照组5.90%±0.45%(P0.05);其线粒体膜电位分别是对照组的(2.77±0.25)倍和(2.33±0.17)倍,较对照组明显升高(P0.01);其凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值分别是对照组的(1.45±0.09)倍和(1.35±0.08)倍,较对照组明显升高(P0.01);其表皮生长因子受体(EGFR),磷酸化EGFR(P-EGFR)及其下游的磷酸化蛋白激酶B(p Akt)均较对照组明显增加。结论 LRIG2基因全长及胞外段均可激活EGFR信号通路,抑制胶质瘤细胞凋亡。     

LRIG3基因对脑胶质瘤细胞系U87和U251的细胞周期、侵袭性和凋亡的影响

目的探讨过表达的富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3(LRIG3)基因对脑胶质瘤细胞系U251和U87的细胞周期、侵袭能力和凋亡的影响。方法将过表达的LRIG3质粒(实验组)和空白质粒(对照组)经慢病毒法感染胶质瘤细胞系U251和U87,筛选稳定细胞株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot检测LRIG3表达的变化,碘化丙啶染色后用流式细胞仪测定细胞周期的变化,TransWell小室法检测细胞的侵袭能力,用免疫组化原位末端标记法(TUNEL)检测各组凋亡细胞。结果与对照组相比,实验组U251与U87细胞中LRIG3mRNA水平分别上升67.6%和79.9%,蛋白表达水平分别升高62.3%和91.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组U251细胞中S期与G2/M期细胞数之和低于对照组,有统计学意义(P<0.05);但U87细胞与对照组比无明显差异。实验组U251细胞中穿出细胞数量均明显少于对照组(P<0.05),TUNEL染色结果显示对照组U251细胞凋亡率为23.4%,实验组为35.7%;对照组U87细胞凋亡率为20.2%,实验组为39.5%;对照组与实验组间凋亡率均有明显差异(P<0.05)。结论 LRIG3基因过表达能阻断细胞周期于S期和G2/M期,降低胶质瘤细胞的侵袭能力,加速细胞凋亡。     

LRIG3基因过表达对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞生物学行为的影响

目的 探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3（LRIG3）基因过表达对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞生物学行为的影响。方法 体外培养人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞,分成空白对照组（A组,不转染任何载体或质粒）、载体组（B组,转染载体）和LRIG3过表达组（C组,转染含LRIG3基因过表达质粒）。 荧光定量PCR和免疫印迹法检测LRIG3、Caspase-3和Caspase-9的mRNA和蛋白表达水平。Transwell试剂盒检测细胞侵袭能力,AV-PI试剂盒检测细胞凋亡水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力。结果 C组Caspase-3和Caspase-9的mRNA和蛋白表达水平以及细胞凋亡率明显高于A组和B组（P<0.05）,细胞增殖率和细胞侵袭能力明显低于A组和B组（P<0.05）,而A组和B组之间均无统计学差异（P>0.05）。结论 LRIG3过表达可以抑制人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞增殖和侵袭,促进其凋亡,其机制可能与促进Caspase-3和Caspase-9表达有关     

shRNA干扰Survivin基因后胶质瘤细胞中Survinvin及mcm2的表达及意义

目的观察小发夹状RNA(shRNA)干扰生存素(Survivin)对脑胶质瘤细胞株U251中Survivin及微小染色体维持蛋白2(MCM2)表达的影响。方法通过脂质体介导对脑胶质瘤细胞株U251、转染Survivin shRNA质粒PG-sur(p Genesil-Suvrivin)及无意义shRNA质粒PG,采用RT-PCR、Western-blot分别对未转染组(U251)、转染无意义序列组(U251-PG)及转染干扰序列组(U251-sur)检测Survivin的mRNA及蛋白表达情况,流式细胞术(FCM)定量测定各组细胞的细胞周期和细胞凋亡,MTT检测细胞增殖能力。采用RT-PCR、Western-blot分别检测转染前后细胞MCM2的mRNA和蛋白的表达情况。结果与其他两组比较,转染干扰序列组细胞Survivin基因的mRNA及蛋白表达抑制效果显著,细胞增殖能力降低,细胞周期G2/M期阻滞显著,细胞凋亡率升高(p<0.05)。MCM2的mRNA和蛋白表达显著降低。结论靶向Survivin基因的特异性shRNA能够在体外明显抑制U251细胞的生长并诱导其发生凋亡及细胞周期阻滞。且本试验结果表明MCM2是一可靠的细胞增殖标记物,且与Survivin之间不是各自孤的,两者间可能起协同作用共同参与胶质瘤的发生。     

miRNA-145在脑胶质瘤中的作用

目的探讨微小RNA(miRNA)-145在脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中表达变化及对胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测检测10例胶质瘤组织和瘤周组织以及4种细胞系(人脑胶质细胞株HEB以及胶质瘤细胞系U251、T98和U87)miRNA-145的表达水平。将miRNA-145模拟物、阴性对照序列转染胶质瘤细胞系U251细胞,采用PCR检测U251细胞miRNA-145表达水平,采用MTT法检测U251细胞增殖能力,采用流式细胞仪检测U251细胞凋亡。结果与瘤周组织相比,胶质瘤组织miRNA-145表达水平明显降低(P0.05)。与正常胶质细胞HEB相比,胶质瘤细胞系U251、U87、T98细胞miRNA-145表达水平均明显降低(P0.05)。与阴性对照组相比,miRNA模拟物组U251细胞miRNA-145表达水平明显增高(P0.01),U251细胞增殖能力明显降低(P0.05),U251细胞凋亡水平明显增高(P0.05)。结论胶质瘤组织miRNA-145呈低表达,上调miRNA-145表达能够抑制胶质瘤细胞系U251细胞增殖能力并诱导U251细胞凋亡。这提示miRNA-145有可能成为胶质瘤治疗的靶点。     

MSP58基因RNA干涉后对人脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的影响

目的观察RNA干涉法（RNA interference,RNAi）抑制人脑胶质瘤U251细胞的MSP58基因表达后,对其在裸鼠体内成瘤性及增殖、侵袭性的影响。方法将特异性的MSP58干涉表达载体pSilencer3．1．MSP58转染人脑胶质瘤细胞系U251（U251．S）,同时构建相应的阴性对照组U251-NC,以及空载体组U251-H1neo。运用逆转录酶-多聚酶链反应（RT—PCR）及蛋白质印迹法（Westernblot）检测各组细胞的MSP58mRNA和蛋白表达水平。用各组U251细胞建立人脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型。结果成功建立了具有稳定下调MSP58基因表达的U251-S细胞。U251-S细胞MSP58的表达无论在mRNA水平还是在蛋白质水平均较U251组、U251-H1neo组及U251-NC组细胞显著降低（P〈0．01）。与接种U251、U251-H1neo和U251-NC细胞的裸鼠相比,接种U251-S细胞的裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及瘤重均明显减小（P〈0．01）。结论MSP58基因RNAi后抑制了移植瘤细胞MSP58mRNA及蛋白的表达,进而明显抑制移植瘤的增殖和侵袭能力。     

胶质瘤多药耐药细胞株U251/TMZ的生物学特性

目的探讨胶质瘤U251／替莫唑胺（TMZ）多药耐药细胞株的生物学特性。方法采用TMZ间歇浓度梯度递增法诱导建立胶质瘤多药耐药细胞株U251／TMZ,光镜观察细胞形态,细胞计数计算倍增时间,四甲基偶氮唑蓝法检测耐药指数,流式细胞仪检测细胞周期,逆转录-PCR法检测多药耐药性1（MDRl）、Bcl-2、多药耐药相关蛋白5（MRP5）、肺耐药相关蛋白1（LRPl）等mRNA表达。结果胶质瘤耐药细胞株U251／TMZ对TMZ、依托泊苷、硫酸长春新碱、环磷酰胺、阿霉素的耐药指数分别为4．39、3．61、2．64、2．00、1．63;细胞周期结果显示U251／TMZ细胞系较U251亲本细胞系G0/G1期和s期明显减少（P〈0．05）,GfM期明显增多（P〈0．05）;U251／TMZ倍增时间[（14．64＋1．98）h1较亲本细胞系u251[（10．26＋1．03）h1明显延长（P〈0．05）;U251／TMZ耐药细胞株MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl等mRNA表达均较亲本细胞系U251明显上调。结论间歇TMZ浓度递增法可成功建立人脑胶质瘤U251多药耐药系,MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl的表达明显上调可能与耐药性形成有关。     

MSP58基因小干扰RNA对胶质瘤细胞系U251增殖的影响

目的观察核微球蛋白58（MSP58）基因特异性siRNA（small interfering RNA）对神经胶质瘤U251细胞的体外增殖的影响。方法体外化学合成针对MSP58基因的siRNA,脂质体法转染神经胶质瘤细胞系U251,荧光显微镜观察转染效率,逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测MSP58基因的mRNA和蛋白表达水平,甲基噻唑基四唑法（MTT法）绘制细胞生长曲线,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期。结果MSP58基因的特异性siRNA转染U251细胞后,MSP58的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖受到明显抑制;流式细胞仪检测显示转染后的U251细胞G2/M期细胞明显减少（P〈0.01）,S期细胞略有减少,G1期细胞明显增加（P〈0.01）,G1期发生明显阻滞。结论MSP58基因的特异性siRNA可明显抑制神经胶质瘤细胞U251的增殖,并引起G1期细胞阻滞。     

Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞凋亡的影响

目的探讨Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞体外增殖的抑制作用及细胞周期的影响。方法将U251细胞与不同浓度的Survivin拮抗肽进行体外培养,采用四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度的Survivin拮抗肽对U251细胞的生长抑制率;采用流式细胞仪分析细胞周期与细胞凋亡。结果浓度为5、10、20ug／ml的Survivin拮抗肽均能抑制U251细胞的生长,且抑制率与Survivin拮抗肽浓度及作用时间成正比（P〈0．01）。20ug/ml Survivin拮抗肽作用U251细胞72h,抑制率达63．33％。流式细胞仪结果显示,终浓度为5、10、20ug／ml Survivin拮抗肽亦能促进U251细胞凋亡,且随作用浓度增大及作用时间延长凋亡率明显上升（P〈0．01）;20ug／ml Survivin拈抗肽作用U251细胞72h,凋亡率为31．29％。不同浓度的Survivin拮抗肽作用U251细胞72h,随作用浓度增大,G2/M期细胞构成比明显上升（P〈0．01）。结论Survivin拮抗肽对U251细胞增殖具有抑制作用和促进凋亡,其抗胶质瘤细胞增殖作用机制可能为诱导肿瘤细胞凋亡,调控肿瘤细胞周期。     

硝普钠诱导胶质瘤细胞株U251细胞凋亡的研究

目的探讨一氧化氮（NO）供体药物硝普钠（SNP）对胶质瘤细胞株U251细胞凋亡诱导效应及其机制。方法以0．2、0．5、1．5和2．0mmol／L浓度SNP作用于U251细胞24h,甲基噻唑基四唑法检测U251细胞生长抑制率,Griess法检测其NO含量,流式细胞术检测其凋亡率,免疫印迹法检测SNP作用24h前后B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）在U251细胞的表达。结果不同浓度SNP对U251细胞生长均有抑制作用（P〈0．01）,且随SNP浓度升高而增强（P〈0．01）。U251细胞内NO含量随SNP浓度升高递增（P〈0．01）,并与细胞生长抑制率的呈正相关（P〈0．01）。不同浓度的SNP均能诱导U251细胞凋亡,且随浓度升高而增强（P〈0．01）。随SNP浓度升高U251细胞Bcl-2表达减少,caspase-3表达增加（P〈0．05）。结论SNP可抑制U251细胞生长并诱导其凋亡,其生长抑制效应可能与NO浓度有关,凋亡诱导作用与U251细胞Bcl-2下调和caspase-3上调有关。     

全反式维甲酸增强替莫唑胺对U251细胞化疗效果的研究

目的观察全反式维甲酸（ATRA）对替莫唑胺（TMZ）治疗人脑胶质瘤是否有协同作用。方法用ATRA、TMZ或两药联合分别作用于人脑胶质瘤细胞株U251细胞,细胞划痕法检测各组的细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光检测CD133细胞阳性率。结果ATRA、TMZ均能抑制U251细胞的迁移,联合用药时迁移抑制更明显。对照组、ATRA组、TMZ组及联合用药组U251细胞凋亡率分别为（6．24±0．81）％、（24．93±4．58）％、（21．36±3．76）％和（54．27±4．83）％,CD133阳性细胞率分别为（7．05±0．27）％、（0．66±0．30）％、（36．32±3．22）％和（4．70±0．52）％。各组间细胞凋亡率和CD133阳性细胞率均有明显差异（P〈0．01）。结论ATRA和TMZ两药均可抑制U251细胞株迁移,促进细胞凋亡;两药联合应用可增强TMZ对U251细胞的化疗效果;其机制可能与ATRA减少CD133阳性细胞率有关。     

miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响

目的 探讨miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响及可能机制.方法 体外培养胶质瘤U251细胞,实验组将miR-29c mimics转染至细胞,miR mimcs转染作为对照组.应用实时荧光定量PCR检测转染后miR-29c表达量的改变,MTT实验测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况,体外侵袭实验分析miR-29c转染后细胞的体外侵袭能力,Western blot检测转染后转录因子YY1蛋白的表达.结果 荧光定量PCR结果显示:实验组miR-29c表达量为(106.65±15.51),较对照组显著上调(P＜0.01).与对照组比较,实验组U251细胞的增殖能力明显降低(P＜0.01),凋亡率增加(P＜0.05),体外侵袭能力明显减弱(P＜0.01),YY1蛋白表达下调(P＜0.01).结论 miR-29c可能通过调控YY1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的生物活性.     

靶向PTTG1基因的微小RNA转染后诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的研究

目的 构建表达靶向抑制垂体瘤转化基因1 (PTTG1)基因表达的RNA干扰载体microRNA,导入人脑胶质瘤细胞株U251中,研究靶向抑制PTTG1基因对U251细胞的凋亡诱导作用.方法 以PTG1为靶基因,根据pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体要求,设计针对PTIG1的microRNA序列,脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,采用荧光定量多聚酶链反应(PCR)以及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;膜联蛋白Ⅴ与碘化丙啶(annexinⅤ/PI)双色标记的流式细胞仪法检测microRNA诱导的细胞凋亡,碘化丙锭(PI)染色检测细胞周期阻滞.结果 实时荧光定量PCR以及Western blot检测显示,PTTG1基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;转染后,流式细胞仪检测分析显示,PTTG1基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞.结论 靶向PTTG1基因的重组microRNA干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-PTTG1介导的RNAi显著靶向抑制了PTTG1基因在人脑胶质瘤细胞中的表达,并明显地诱导了脑胶质瘤细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.