基于CD107a标记流式细胞仪检测NK细胞毒性方法的建立

目的建立基于CD107a标记、利用流式细胞仪检测NK细胞毒性的方法。方法首先将外周血单个核细胞（PBMCs）与K562细胞以3：1比例混合,2h后加入莫能菌素,1．5h后加入CD107a和CD56标记抗体,流式细胞仪分析CD107a阳性细胞的频率。其次观察CD107a抗体孵育时间、不同效靶比例对CD107a阳性细胞检测的影响。最后观察该方法与传统LDH释放法检测NK细胞毒活性的一致性。结果NK细胞活化后可在其表面检测到高水平表达的CD107a分子,效靶细胞孵育结束后加入CD107a抗体可降低检测背景,低效靶比例同样具有检测敏感性。该方法与LDH释放法的检测结果一致。结论利用CD107a抗体标记检测NK细胞毒活性的方法具有快速、敏感、所需效应细胞少的优点。     

可溶性IL-2受体及NK细胞活性在噬血细胞性淋巴组织细胞增多症中的意义

本研究通过检测噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)患者外周血中可溶性IL-2受体(sCD25)及NK细胞活性,探讨它们在HLH中的意义。应用酶联免疫吸附法检测20例HLH患者、15例正常对照者、20例急性髓系白血病(AML)患者及20例系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血血清sCD25水平;用流式细胞术CD107a标记法及传统的LDH释放法检测HLH组及正常对照组外周血NK细胞活性。结果显示:HLH组血清sCD25水平较正常对照组、AML组及SLE组均明显升高(P<0.001);HLH组NK细胞活性明显低于正常对照组(P<0.05);将流式细胞术CD107a标记法与传统的LDH释放法检测NK细胞活性进行相关分析,该两种检测方法之间具有显著相关性(r=0.73,P<0.05)。结论:血清sCD25及外周血NK细胞活性检测是HLH重要的辅助诊断指标,流式细胞术CD107a标记法检测NK细胞活性简单、稳定、重复性高,有助于HLH的临床诊断。     

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪(FACS)技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆化,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的比例混合,分别孵育0.5、1、2、4 h后用碘化丙啶(PI)标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0.5、1、2、4 h均能得到明显的杀伤效果,而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法(LDH)具有显著相关性(γ=0.997,P=0.003),而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统51Cr释放法、LDH法的一个补充,而且具有经济、快速和敏感的特点。     

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪（FAcs）技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562，经过G418筛选后进一步单克隆化，得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5：1、10：1、20：1、40：1的比例混合，分别孵育0．5、1、2、4h后用碘化丙啶（PI）标记，用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数，最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0．5、1、2、4h均能得到明显的杀伤效果，而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法（LDH）具有显著相关性（7=0．997，P=0．003），而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统^51Cr释放法、LDH法的一个补充，而且具有经济、快速和敏感的特点。     

流式细胞术检测NK细胞活性在获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断中的应用

本研究目的旨在建立一种准确、稳定的NK细胞杀伤活性检测方法,应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。21例疑似患者及20例健康对照者纳入本研究。根据HLH-2004标准将疑似患者分为确诊组和排除组,将pEGFP—N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞,将EGFP—K562细胞与人外周血单个核细胞按10：1的比例混合孵育2小时后,用碘化丙啶（PI）标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率;同时采用LDH释放法测定外周血NK细胞对单纯K562细胞的杀伤活性,并进行比较。结果表明：获得了稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞;流式细胞仪检测表明健康人NK细胞杀伤率与病人组之间存在明显差异,流式细胞仪技术检测NK细胞杀伤活性与传统LDH释放法检测NK细胞杀伤活性具有显著相关性。结论：EGFP—K562细胞株作为靶细胞用于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性,无需预先染色和标记靶细胞,操作简便、省时、稳定、重复性高,可应广泛应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。     

流式细胞术三种染色方法检测体外纯化扩增的NK细胞的细胞毒作用比较

目的:比较流式细胞术3种不同染色方法检测体外诱导扩增后NK细胞的细胞毒活性效果。方法:收集健康志愿者外周血,体外诱导扩增NK细胞,在培养第17天后分为3组,每组按10∶1、20∶1、40∶1 3个效靶比混合,共同培养4 h,并分组用3种不同方法染色后经流式细胞术检测。A组:CFSE/Annectin-V/7-AAD三色荧光染色法;B组:Annectin-V/PI双色荧光染色法;C组:CFSE/PI双色荧光染色法。结果:培养17 d后,NK细胞(CD3-CD56+)由培养第0天(16.34±10.51)%增加到(83.63±10.63)%(P0.05)。3种染色方法检测结果均显示,扩增后NK细胞对K562细胞具有显著细胞毒活性:A组NK细胞对K562细胞的细胞毒活性均明显高于B和C组(P0.05),当效靶比为10∶1时,A、B和C 3个组细胞毒活性分别为(36.56±3.69)%、(22.35±2.71)%和(10.85±2.09)%;当效靶比为20∶1时细胞毒活性分别为(47.83±5.52)%、(39.07±5.55)%和(29.61±4.81)%;当效靶比为40∶1时细胞毒活性则分别为(67.7±4.77)%、(51.51±4.43)%和(44.12±5.62)%,差异均有显著统计学意义(P0.05)。结论:健康者外周血经体外分离培养,可得到高纯度NK细胞;流式细胞检测技术CFSE/Annectin-V/7-AAD三色荧光染色法能特异性地和灵敏地检测NK细胞的细胞毒活性。     

羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记肿瘤细胞及其在细胞毒检测中的价值

目的探讨化学染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）标记肿瘤细胞的最佳条件及其在细胞毒检测中的价值。方法用不同浓度的CFDA-SE标记K562（人红白血病细胞）、YAC-1（小鼠淋巴瘤细胞）、A375（人乳腺癌细胞）、MCF-7（人黑色素瘤细胞）不同肿瘤细胞系，并检测其0—24h的荧光强度，观察荧光强度变化的时间动力学，选择CFDA-SE标记细胞的最佳浓度；CFDA-SE标记细胞后孵育时间为1—6h，再用DNA染料碘化丙啶（PI）标记，流式细胞仪分析CFDA-SE和PI双标记细胞，并计算细胞死亡率，研究CFDA-SE对细胞的毒性。CFDA-SE标记时间分别为5、6、7、8、10、15min，测定标记不同时间的荧光强度和细胞的死亡率，选择最佳标记时间；用CFSE在最佳条件下标记靶细胞进行细胞毒检测实验。结果对于不同肿瘤细胞系，CFDA-SE标记的最佳浓度不同；CFDA-SE对细胞没有毒性，死亡率低于5％；最佳标记时间为8min。人外周血单个核细胞和BALB／c鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞K562、YAC-1均表现出杀伤活性，杀伤百分率随效靶比和共孵育时间的增加而增加。最佳效靶比为50：1—25：1，共孵育时间为2—4h。结论CFDA-SE具有标记细胞稳定，能用于细胞培养时间较长的研究，不影响细胞功能，适用于流式细胞仪检测细胞毒实验的优点，是一种很好的标记细胞的荧光素染料。     

IL-2/IL-15刺激后脐血NK细胞穿孔蛋白表达及其与细胞毒活性的关系

本研究旨在探讨脐血NK细胞的穿孔蛋白表达水平以及IL-2、IL-15作用下穿孔蛋白表达与NK细胞细胞毒活性的关系。采用CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法纯化脐血NK细胞,流式细胞术测定NK细胞纯度,通过IL-2、IL-2+IL-15两种细胞因子培养体系培养3天,流式细胞术测定培养前后穿孔蛋白表达水平;LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562的细胞毒活性(效靶比10∶1)。结果表明,纯化后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%。,以K562为靶细胞,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2+IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,新鲜纯化CB-NK穿孔蛋白表达率为(67.21±6.14)%,IL-2组CB-NK细胞穿孔蛋白表达率(84.55±3.8)%,IL2-+IL-15组CB-NK细胞穿孔蛋白表达率(87.22±2.2)%。穿孔蛋白表达率与NK细胞毒活性呈正相关(r=88.6,p<0.05)。IL-2组穿孔蛋白表达率与新鲜组差别有统计学意义,IL-2组与IL-2+IL-15组穿孔蛋白表达率差别无统计学意义。结论:促进穿孔蛋白表达是IL-2提高脐血NK细胞细胞毒活性的途径之一。     

再改良MTT法检测NK细胞活性

目的对MTT还原法检测NK细胞活性的方法进行改良.方法通过对NK细胞、K562细胞浓度的选择、效靶细胞共同孵育时间的选择,探讨MTT还原法检测NK细胞活性的最佳条件.结果通过实验确定NK细胞活性测定的最佳条件为NK细胞浓度为2×106/ml,效靶细胞比例为101,效靶细胞在37℃5%CO2饱和湿度的温箱内孵育5h后再加入MTT孵育5h,然后离心、比色、计算.应用本方法检测了25例正常献血员的NK细胞活性为32.5±5.6(%),与3H-TdR掺入抑制法结果相关性良好(r=0.912,P＜0.001).结论本改良法操作快速、简便,结果稳定、可靠,是一种有应用价值的测定NK细胞活性的方法.     

以肝素和抗CD16抗体为基础的扩增人脐血NK细胞无血清培养体系的建立

目的:建立一种新方法以用于体外培养扩增人脐血来源的NK细胞,从而为NK细胞的治疗奠定基础。方法:收集人脐血单个核细胞,将细胞按1.5×10~6/ml悬浮于含5%自体血浆、重组人IL-15(50 ng/ml)和氢化考的松琥珀酸钠(5×10~(-8)mol/L)组成的无血清培养液中,接种于含肝素钠或/和重组抗人CD16单克隆抗体铺板(预先铺板)的培养瓶中,其剂量分别为100 U/cm~2和1μg/cm~2底面积。培养2周后收集细胞,计细胞总数,应用流式细胞术检测细胞中CD3~-/CD56~+比例。以K562细胞为靶细胞,应用MTT实验观察不同效靶比条件下的NK的细胞毒作用。结果:与未铺板培养体系比较,抗CD16抗体及肝素钠铺板体系培养的细胞,在培养1周内易见贴壁的集落。培养2周后,预先铺板组细胞扩增倍数明显高于未铺板组,且CD3~-/CD56~+比例显著升高,尤以抗体和肝素混合铺板组为显著(P0.01)。MTT实验显示,预先铺板培养组所获得细胞对K562细胞的杀伤活性更强。结论:利用肝素和抗CD16抗体铺板,在培养体系中加入IL-15和氢化考的松,可使NK细胞优势扩增,从而获得纯度较高、细胞毒活性较强的NK细胞。     

Flow cytometric measurement of NK cell cytotoxicity.

A simple and fast method to measure the natural killer (NK) cell cytotoxicity has been established. In our novel assay, following the incubation of K562 target and effector cells, the cells were stained with FITC-conjugated anti-transferrin receptor (CD71) mAb. The K562 targets alone were labeled with anti-CD71 mAb, since CD71 is highly expressed on K562 cells but not on mononuclear cells. The fluorescence intensity of CD71 on K562 cells were analyzed using flow cytometry, and the cytotoxicity was evaluated. In our assay, designated as a "CD71 assay", no spontaneous release of anti-CD71 mAb was observed from labeled K562 cells and living K562 cells were able to be divided from dead K562 cells. The data obtained by this assay was well correlated with that by the standard 51Cr-release assay as well as the C-FDA assay. In addition, the CD71 assay is a safe and simple analytic procedure since no isotope is required.     

NKG2D在细胞因子诱导的杀伤性细胞（CIK）抗血液肿瘤细胞的作用

本研究探讨细胞因子诱导的杀伤性细胞（CIK）通过NKG2D受体和配体相互作用杀伤血液肿瘤细胞的机制。用含有rhIL-2,抗CD3抗体,IFN-1的培养液培养健康人的外周血单个核细胞（PBMNC）2周后,用流式细胞仪分析CIK细胞的细胞亚群以及细胞表面NK细胞受体,同时检测血液肿瘤细胞株表面NKG2D配体的表达水平。CAM标记靶细胞,用流式细胞仪检测CIK细胞对血液肿瘤细胞的杀伤作用。结果表明,大部分CIK细胞为CD3＋细胞（97．85±1．95％）,CD3＋CD8＋细胞和CD3＋CD56＋细胞的比率较培养前明显升高（P〈0．001;P=0．033）;约86％的CIK细胞表达NKG2D受体,几乎不表达CDl58a,CDl58b和NCR受体;血液肿瘤细胞株U266、K562和Daudi均表达-定水平的NKG2D配体,CIK细胞对这3种血液肿瘤细胞株均具有较高的杀伤作用,这种杀伤作用可以被抗NKG2D抗体部分抑制（U26652．67±4．63％VS32．67±4．81％。P=0．008;K56271．67±4．91％VS50．33±4．91％,P=0．007;Daudi68．67±5．04I）S52．67±2．60％,P=0．024）。结论：大多数的cIK细胞表达NKG2D受体,NKG2D受体和配体的相互作用可能是CIK细胞杀伤血液肿瘤细胞的作用机制之-。     

K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GMCSF、IL4培养5d后,获得未成熟的DC(imatureDC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA进行RTPCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果。结果RTPCR检测表明DC经K562总RNA转染后,细胞内出现BcrAbl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot试验表明转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性。1%自体血浆体积分数RPMI1640培养的DC的CD1a表达量最高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组。结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景。     

猪苓多糖联合白细胞介素15增强人外周血单个核细胞对K562细胞杀伤活性的影响

目的研究猪苓多糖联合白细胞介素（interleukin,IL）15对人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）增殖的影响,探讨该效应细胞对人慢性髓细胞白血病K562细胞株增殖的抑制作用及可能的机制。方法密度梯度法分离PBMC,分别应用IL 2、IL 15、猪苓多糖、猪苓多糖+IL 2及猪苓多糖+IL 15刺激PBMC增殖,获得效应细胞,流式细胞仪（FCM）检测PBMC中T细胞、NK细胞活化的免疫表型;双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测效应细胞培养上清中干扰素γ（IFN γ）和肿瘤坏死因子α（TNF α）的水平;四甲基偶氮唑蓝（ MTT）比色法检测效应细胞对靶细胞的细胞毒作用。结果猪苓多糖联合IL 15能刺激PBMC中T细胞及NK细胞增殖,在促进NK细胞增殖作用上具有协同作用;能上调效应细胞培养上清中IFN γ和TNF α的水平,且具有协同作用;并能增强效应细胞对靶细胞的杀伤活性,大致呈时间 效应趋势。结论猪苓多糖+IL 15能够增强PBMC对K562细胞株的细胞毒作用,表现为肿瘤细胞增殖抑制率（IR）提高,杀伤机制可能与其刺激T细胞及NK细胞增殖,同时细胞培养上清中细胞因子IFN γ和TNF α的水平提高有关。     

K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞在荷瘤NOD/SCID小鼠体内的杀瘤活性

目的 探讨经K562细胞-树突细胞(DC)融合瘤苗刺激的脐血源性细胞因子诱导的杀伤(CIK)/自然杀伤(NK)细胞在荷瘤NOD/SCID小鼠体内的杀伤效能及其安全性.方法 通过不同细胞因子的组合分别诱导脐血单个核细胞(MNC)成为DC和CIK/NK细胞,通过聚乙二醇(PEG)将灭活K562细胞与DC融合形成K562-DC融合瘤苗.以10:1比例在CIK/NK细胞培养体系中加入K562-DC融合瘤苗,制备K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞.小鼠均经尾静脉接种K562细胞1×106诱导荷瘤鼠;于接种肿瘤细胞后24 h按不同分组分别经尾静脉输注K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞1×107、CIK/NK细胞1×107,同时设相应的非荷瘤鼠对照.比较各组小鼠的生存率、存活时间;用流式细胞术检测小鼠外周血、肝、肺组织中人CD13+细胞和外周血人CD56+细胞.结果 在接种1×106K562细胞后未经处理的小鼠39 d内全部死亡,8只鼠中肉眼可见瘤块的小鼠5只,其中位于肝脏的4只、脾脏的1只.接种K562细胞后接受K562-DC瘤苗刺激的CIK/NK细胞治疗的8只小鼠第65天时死亡1只,抗瘤有效率为87.5%;接受CIK/NK细胞治疗小鼠死亡2只,时间分别为接种K562细胞后第56天及第62天,抗瘤有效率为75.0%,均未发现肉眼可见瘤块.该两组小鼠存活时间分别为(69.4±1.8)d、(67.2±5.3)d,两组间差异无统计学意义(P＞0.05),均高于未予治疗的荷瘤对照组[(30.4±4.6)d](P＜0.01),荷瘤后接受K562-DC瘤苗刺激的和未经瘤苗刺激的CIK/NK细胞治疗的两组其余小鼠存活均超过70 d.经CIK/NK细胞治疗的两组存活小鼠外周血,肝、肺组织中人CD13+细胞率差异无统计学意义,均显著低于荷瘤未治疗组(P＜0.01),而治疗的两组存活小鼠外周血人CD56+细胞率与输注不同CIK/NK细胞的非荷瘤对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 经过灭活肿瘤细胞预孵育的脐血源性CIK/NK细胞接种在动物体内具有抗瘤活性,无致瘤性.     

姜黄素提高白血病KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性及其分子机制探讨

目的：研究姜黄素作用前后白血病KG1a细胞对同种异体自然杀伤（NK）细胞杀伤的敏感性变化,并初步探讨其分子机制。方法：以对同种异体NK细胞杀伤高度敏感的白血病K562细胞为对照,乳酸脱氢酶释放法检测KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,流式细胞仪检测细胞表面NKG2D配体（MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3）和HLA-Ⅰ类分子蛋白表达,逆转录PCR法检测细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ基因mRNA的表达水平。CCK-8法检测姜黄素对KG1a细胞半数抑制量（IC50）,以此含量作用KG1a细胞,再次乳酸脱氢酶释放法检测姜黄素作用后的KG1a对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,流式细胞仪检测姜黄素作用后的KG1a细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子蛋白表达水平。结果：与K562细胞比较,KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤呈低度敏感,KG1a细胞表面NKG2D各配体蛋白表达阳性率均明显低于K562细胞（P〈0.01）,HLA-Ⅰ蛋白表达阳性率则明显高于K562细胞（P〈0.01）;在mRNA水平两种白血病细胞表面均有NKG2D配体和HLA-Ⅰ基因表达。当效靶比为5∶1、10∶1、20∶1时,姜黄素作用后NK细胞对KG1a细胞杀伤率明显高于作用前（P〈0.01）;作用后KG1a细胞各NKG2D配体表达率均明显升高（P〈0.05或0.01）,HLA-Ⅰ类分子无明显变化（P〉0.05）。结论：姜黄素能提高KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,其机制可能与姜黄素提高KG1a细胞表面NKG2D配体的表达有关。     

高纯度CD3~-CD56~+CD16~+NK细胞体外扩增技术的研究

本研究探索高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞体外扩增技术。应用免疫磁珠分选法(MACS)分离出高纯度的CD3-CD56+CD16+NK细胞,置于含10%人AB血清的造血干细胞培养基(SCGM)中,加入细胞因子IL-2、IL-15、SCF组成不同培养体系进行体外扩增。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析和CCK-8试剂盒检测对K562细胞的杀伤率等方法比较不同培养体系对NK细胞增殖前后的数量、纯度及杀伤活性的影响;并采取相同方法对IL-2的浓度与NK细胞增殖效率及杀伤活性之间的关系进行探讨。结果发现,经免疫磁珠分选法所得的高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞扩增18天后,IL-2/IL-15/SCF组扩增倍数显著高于其他组(p0.05);含细胞因子组的NK细胞对K562细胞的杀伤活性显著提高,尤其是IL-2/IL-15组和IL-2/IL-15/SCF组在效靶比10∶1时杀伤活性均高达90%以上。低、中、高浓度IL-2组扩增倍数之间比较差异无显著性(p0.05),而在对K562细胞杀伤率的比较上,高浓度组明显高于低、中浓度组(p0.05)。结论:在10%人AB血清的SCGM中加入IL-2/SCF/IL-15细胞因子组合,可使经MACS纯化的NK细胞在体外高效地活化及增殖;本培养体系中IL-2浓度较低(1 000U/ml)时,NK细胞的扩增效率及对K562细胞的杀伤率与IL-2的浓度高低无相关性;而高浓度的IL-2(≥1 000U/ml)可进一步激活纯化后NK细胞的体外杀伤活性。