慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖?迁移和凋亡的影响?【方法】 构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株?实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)?CLU-RNAi-LV2(KD2)?CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)?应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化?用细胞划痕实验?MST-1?流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖?迁移?凋亡等生物学行为的改变?【结果】 成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒?Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1?KD2?KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%~96.5%和0?Western blot结果显示KD1?KD2?KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%?46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达?划痕实验显示24 h时 KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43 ± 25.92)小于NC组(101.35 ± 6.05)和CON组(68.13 ± 6.64,P < 0.05)?WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P < 0.05),各组间差异(P < 0.05),均有统计学意义?流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组?CON组细胞凋亡率分别为(6.23 ± 2.51)%?(1.05 ± 0.30)%和(1.17 ± 0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组?CON组相比凋亡率增加(P < 0.05),差异有统计学意义?肾癌786-O细胞的增殖?迁移受到抑制,而凋亡率增加?【结论】 筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株?CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖?迁移并促进细胞凋亡?     

人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用

 【目的】 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22 细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】 PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体;通过酶切电泳,菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH-CMV-MCS-EF-GFP1-hVEGF165重组载体;采用磷酸钙共转染法转染293T细胞包装制备慢病毒液,并感染HT22细胞,采用实时RT-PCR及Western Blot检测hVEGF165基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF165转染组HT22细胞进行0、5、10 Gy的X线照射,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 hVEGF165基因片段重组到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与GenBank序列完全一致,转染HT22后hVEGF mRNA及蛋白表达水平明显增高。而且同各对照组相比,hVEGF165可以降低细胞放疗后的凋亡率。【结论】 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165 慢病毒表达载体构建成功,其转染HT22细胞后可获得高水平hVEGF165 mRNA和蛋白的表达,hVEGF165具有抗放射所致细胞凋亡的作用。     

PTEN 基因影响K562细胞周期的分子机制探讨

  【目的】 探讨抑癌基因PTEN对人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞周期的影响&#65377; 【方法】 将携带有野生型PTEN和绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及对照载体腺病毒(Ad-GFP)转染人慢性粒细胞白血病细胞系K562&#65377;MTT检测细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测转染效率&#65380;细胞凋亡率和细胞周期的变化;荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN&#65380;Cyclin D1&#65380;Cyclin D2&#65380;CDK4&#65380;P27Kip1 mRNA水平变化,Western blot检测上述蛋白表达水平的变化&#65377; 【结果】 与Ad-GFP组比较,Ad-PTEN-GFP 转染K562细胞后,细胞凋亡率最高为30%,细胞周期显示:G0/G1期细胞比例由54.9%增加至78.5%,G2/M期比例由30.2%降至13.6%,Cyclin D1&#65380;Cyclin D2&#65380;CDK4 mRNA及CyclinD1蛋白表达降低,P27Kip1 mRNA及蛋白表达增加&#65377; 【结论】 PTEN基因高表达可以促进K562细胞凋亡,并通过抑制Cyclin D1&#65380;Cyclin D2&#65380;CDK4及增加P27Kip1表达使细胞周期阻滞在G0/G1期&#65377;     

慢病毒介导靶向PRL-3 基因的siRNA 抑制肝癌细胞的侵袭性

 【目的】 探讨肝再生磷酸酶-3(PRL-3)的表达对肝癌细胞侵袭能力的影响&#65377;【方法】 设计&#65380;合成4对针对PRL-3 基因siRNA 的寡核苷酸序列,分别构建质粒,转染293T 细胞,据其对PRL-3 的抑制率,筛选最有效的PRL-3 基因RNAi 靶序列,设计并合成其siRNA 的双链DNA Oligo,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGCL-GFP 线性化载体连接产生重组慢病毒质粒LV-PRL3-SiRNA,并行PCR 和测序鉴定&#65377;将LV-PRL3-SiRNA,pHelper 1.0 和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平经孔稀释法测定病毒滴度&#65377;重组慢病毒感染肝癌SMCC7721 细胞,行real time-PCR和western-blot验证PRL-3基因的沉默效果&#65377;用Transwell侵袭试验检测SMCC7721细胞体外侵袭力的改变&#65377;【结果】 成功构建PRL-3 基因RNA干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为6 × 108 Tu/mL&#65377;和对照组相比,RNA 干扰组SMMC7721 细胞PRL-3 基因的mRNA 水平和蛋白水平的抑制率分别为75%和63%;其穿过人工基底膜的平均数(14.2 ± 0.8)明显少于空白对照组(33.0 ± 1.6)及非特异性siRNA感染组(31.2 ± 0.8),侵袭抑制率为58% (P < 0.01)&#65377;【结论】 降低PRL-3 的表达可抑制肝癌细胞的侵袭能力&#65377;     

慢病毒携带shRNA抑制CR-1基因表达对 CNE-2细胞特性的影响

 【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术,有效沉默鼻咽癌细胞CNE-2的CR-1基因表达,研究CR-1对鼻咽癌细胞生物学行为的影响&;#65377; 【方法】 构建针对CR-1的siRNA慢病毒表达载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]&;#65377;利用包装细胞293FT生产慢病毒,感染鼻咽癌细胞CNE-2, 流式筛选GFP阳性细胞&;#65377;应用荧光定量PCR&;#65380;Western blot检测病毒感染后CNE-2细胞中CR-1基因的mRNA和蛋白表达,获得干扰CR-1基因的细胞群&;#65377;并用MTT法&;#65380;平板克隆形成实验及Boyden侵袭小室观察CR-1干扰后对CNE-2细胞生物学行为的影响&;#65377; 【结果】 PCR 和测序证实,成功构建了CR-1 shRNA的慢病毒载体pLVTHM-shCR-1&;#65377;荧光定量PCR 和Western blot结果表明,所获得的细胞中CR-1 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照组&;#65380;空白对照组均显著降低(P < 0.05)&;#65377;CR-1干扰后的细胞生长明显减慢,克隆形成能力减弱,侵袭运动能力下降&;#65377; 【结论】 通过RNAi技术阻断CR-1的表达,可抑制CNE-2细胞的生长&;#65380;增殖&;#65380;迁徙,提示CR-1在鼻咽癌的发生&;#65380;发展过程中起重要作用&;#65377;     

外源性SHIP基因表达抑制生长因子介导的 K562细胞增殖及Akt磷酸化

 【目的】 探讨SHIP基因对IL-3诱导K562细胞系增殖的抑制作用,阐明SHIP对K562细胞作用的机制&#65377;【方法】 将慢病毒质粒pReceiver-Lv31-FIV和pReceiver-Lv31-SHIP转染K562细胞;转染细胞与IL-3共培养,Western blot法检测K562细胞Akt磷酸化;观察转染野生型SHIP基因对K562细胞增殖的影响;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺失末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡&#65377;【结果】 重组慢病毒载体pReceiver-Lv31-FIV和pReceiver-Lv31-SHIP转染K562细胞,GFP阳性率为74.6%&#65377;野生型SHIP基因阻断了IL-3对K562细胞的增殖作用,对照组(K562/FIV)细胞增殖抑制率(3.26%)明显低于转染SHIP基因组细胞增殖抑制率(26.42%,P < 0.05);集落形成实验显示SHIP能显著抑制K562细胞集落形成能力[IL-3作用组K562/SHIP细胞形成集落为60.3 ± 6.6,明显低于IL-3诱导的K562/FIV组(91.7 ± 4.2)](P < 0.01)&#65377;细胞形态观察发现凋亡增加,Western blot检测发现转染SHIP基因组前凋亡酶pro-caspase-3降解增加,TUNEL法证实SHIP蛋白促进细胞凋亡&#65377;IL-3作用不同时间段(3 h, 6 h, 12 h),转染野生型SHIP组细胞增殖明显减弱,且Akt磷酸化水平均低于对照组(P < 0.05)&#65377;【结论】 SHIP基因负调控生长因子(IL-3)介导的K562细胞增殖及其蛋白激酶活化&#65377;     

携带EGFP基因的逆转录病毒载体的构建及初步应用

 【目的】 构建携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响&#65377; 【方法】 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点(MCS)的EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后获得具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)观察EGFP做为报告基因在体外的表达情况&#65380;以及对靶细胞生物特性的影响&#65377; 【结果】 成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并稳定表达,对靶细胞的生长无抑制&#65377;高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30%细胞表达GFP&#65377; 【结论】 使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低,所构建的pLXSN-EGFP载体可在体外稳定表达,为再插入治疗用基因进行后续研究奠定基础&#65377;     

Livin siRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌HeLa细胞的作用

 【目的】 构建和鉴定针对人抑凋亡基因livin的siRNA质粒载体,并研究其对宫颈癌HeLa细胞的作用&#65377;【方法】 设计和合成针对人livin基因的siRNA寡核苷酸,定向克隆入质粒载体pmU6,脂质体瞬时转染入HeLa细胞中,用RT*9鄄PCR技术检测livin基因的mRNA表达水平,Western Blot技术检测Livin蛋白表达水平&#65377;用MTT法分析HeLa细胞增殖改变,流式细胞仪检测HeLa细胞周期变化&#65377;【结果】 livin siRNA表达质粒能高效而特异地剔除HeLa细胞中livin的表达,抑制肿瘤细胞增殖(P < 0.05),将HeLa 细胞阻止在G1期&#65377;【结论】 livin基因的siRNA对HeLa细胞增殖和细胞周期调控有重要影响,细胞凋亡可能是导致其细胞死亡的主要原因&#65377;     

斑蝥素抑制舌癌细胞生长及转移能力

摘 要:【目的】 观察斑蝥素(Cantharidin)对舌癌细胞株Tca8113?CAL-27生长及转移能力的抑制作用?【方法】 舌癌细胞株Tca8113?CAL-27处理组采用斑蝥素处理,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长能力;通过流式细胞术检测细胞的细胞周期分布;通过实时定量PCR和Western-blot检测p21?细胞周期蛋白依赖激酶1(CDK1)?基质金属蛋白酶-2?9(MMP-2,9)基因表达的变化;通过Transwell小室及划痕实验检测斑蝥素对细胞侵袭和迁移能力的影响?【结果】 斑蝥素抑制舌癌细胞生长,呈剂量和时间依赖性(P﹤0.01)?斑蝥素处理后G2/M期细胞比例上升(P﹤0.01),呈G2/M期阻滞?斑蝥素处理后,抑制G2/M周期转换的p21表达上调(P﹤0.01),而促进G2/M周期转换的CDK1表达下调(P﹤0.01)?斑蝥素可显著抑制舌癌细胞的侵袭能力,处理24 h使Tca8113?CAL-27细胞侵袭力分别下降(93.50 ± 3.32)%(P﹤0.01),(61.33 ± 4.11)%(P﹤0.01)?斑蝥素处理后MMP-2?9 mRNA表达量显著降低?划痕实验显示斑蝥素可显著抑制舌癌细胞的迁移能力(P﹤0.01),处理12 h使Tca8113?CAL-27细胞迁移能力分别下降(57.60 ± 8.98)%(P﹤0.01),(49.94 ± 5.63)%(P﹤0.01)?【结论】 斑蝥素通过阻滞细胞周期抑制舌癌细胞的生长,并通过抑制舌癌细胞迁移和对基质的降解,抑制舌癌细胞转移?     

转基因溶瘤性单纯疱疹病毒对人类乳腺癌细胞及其干细胞的溶瘤作用

 【目的】 通过体外实验观察溶瘤性单纯疱疹病毒(HSV)载体G47Δ对人类原代乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞毒效应,探讨其对人乳腺癌的治疗作用。【方法】 选取6例浸润性导管癌组织,体外培养人原代乳腺癌细胞及人原代乳腺癌干细胞,将G47Δ按不同感染复数(MOI),即MOI=0.01和MOI=0.1加入各实验组中,观察每天细胞的生长情况。G47Δ含有LacZ基因,其表达产物可被X-gal染色检测。 【结果】 G47Δ病毒在乳腺癌细胞中可复制和传播通过X-gal染色法得以证实。 G47Δ对人原代乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞都具有杀伤作用,对乳腺癌细胞更加敏感。在MOI=0.01组及0.1组中,感染病毒后第4 d,人原代乳腺癌细胞被杀灭的比例分别是91%及96%,乳腺癌干细胞被杀灭的比例分别是43%及78%;感染病毒后第6天,两组中人原代乳腺癌细胞接近全部被杀灭,乳腺癌干细胞被杀灭的比例分别是92%、98%。 【结论】 G47Δ可有效杀灭人乳腺癌细胞及其干细胞;乳腺癌细胞比乳腺癌干细胞对G47Δ更具有敏感性。     

IRAK-4基因沉默对人成骨样细胞凋亡的影响

【目的】研究siRNA沉默白细胞介素-1受体相关激酶-4(IRAK-4)基因对人成骨样细胞株MG63凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响。【方法】 以Lipofectamine 2000为载体将IRAK-4-siRNA转染入MG63细胞(CON组:不加入任何转染试剂;SC组:以scrambled siRNA序列进行转染;KD组:以特异性IRAK-4-siRNA序列进行转染),应用流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡水平,western blotting检测Bcl-2、Bax基因的表达。【结果】 与对照组相比,靶基因沉默组(KD组)细胞的IRAK-4 mRNA及蛋白表达水平显著降低;转染48h后,KD组细胞增殖变缓,凋亡增加,Bcl-2蛋白的表达明显下调且Bcl-2/BaxSC>Bcl-2/BaxKD; Spearman等级相关分析显示MG63细胞凋亡比例与Bcl-2/Bax的比值间有显著的相关性。 【结论】 siRNA沉默IRAK-4基因能够诱导人成骨样细胞株MG63凋亡,且靶细胞凋亡水平与Bcl-2、Bax基因表达水平的比值相关.     

巨噬细胞炎症蛋白-1β对人舌鳞癌细胞CAL-27增殖和凋亡的影响

目的 探讨β亚族趋化因子受体5(CCR5)在不同人舌鳞癌细胞株的表达情况以及其配体巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)对人舌鳞癌细胞株CAL-27增殖和凋亡的影响.方法 采用蛋白印迹法和免疫荧光染色对3种人舌鳞癌细胞株(CAL-27、UM-1、Tca-8113)MIP-1β的相应受体CCR5的表达进行检测;根据MIP-1β刺激浓度的不同,细胞被随机分为4组:0 ng/mL组(对照组)、10 ng/mL组、20 ng/mL组、40 ng/mL组.用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测MIP-1β在刺激12、24、48 h时,对CAL-27细胞增殖的影响;实验分组同前,分别用0、10、20、40 ng/mL IP-10处理24 h后收集细胞,用Annexin V/PI双染流式细胞仪检测CAL-27细胞的凋亡情况.结果 CCR5在3种人舌鳞癌细胞株均有表达,并且CCR5在3株细胞的胞膜及胞质内均有染色;和对照组相比,MIP-1β对CAL-27细胞有促进增殖的作用.在12 h、24 h时,3种浓度的MIP-1β均能够促进CAL-27细胞增殖(P<0.05);48 h时,10 ng/mL、20 ng/mL的MIP-1β均能够促进CAL-27细胞增殖(P<0.05),但40 ng/mL的MIP-1β对CAL-27细胞的增殖无影响(P>0.05);在24 h时,40 ng/mL MIP-1β组的细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05),而10 ng/mL、20 ng/mL MIP-1β组细胞凋亡率和对照组之间均无显著差异(P>0.05).结论 CCR5在3种人舌鳞癌细胞株的胞膜及胞质内均有表达;MIP-1β对CAL-27细胞有促进增殖的作用,但相对较高浓度的MIP-1β对CAL-27细胞的凋亡也有促进作用.随着较高浓度MIP-1β作用时间的延长,促增殖作用减弱,而这种减弱可能是由MIP-1β的促凋亡作用的逐步发挥所引起的.     

人舌鳞状细胞癌顺铂耐药细胞株CAL-27/DDP的建立及其生物学评价

目的: 建立人舌鳞状细胞癌(舌鳞癌)顺铂耐药细胞株CAL-27/DDP,探讨其顺铂耐药机制。方法: 采用顺铂浓度梯度法对人舌鳞癌CAL-27细胞株进行诱导,将细胞分为CAL-27组和CAL-27/DDP组。CAL-27组细胞株用普通培养液培养,CAL-27/DDP组细胞株用含有不同浓度顺铂的培养液培养,经过12个月的诱导形成生长良好的耐药细胞系株CAL-27/DDP。采用倒置显微镜观察细胞株形态表现;MTT法检测细胞株的半数抑制浓度(IC₅₀)和耐药指数(RI);流式细胞术检测细胞株的细胞周期;RT-PCR法检测细胞株中多药耐药基因(MDR1)mRNA的相对表达水平;Western blotting法检测细胞株P糖蛋白(P-gp)的相对表达水平。结果: CAL-27/DDP组细胞株在一段时间内能在普通培养液中稳定生长,并维持其形态和耐药性状。与CAL-27组细胞株比较,CAL-27/DDP细胞略增大,细胞中出现颗粒和"空泡"样变,胞浆丰富,倍增时间延长(P<0.01),RI为18.09±0.30。与CAL-27组比较,CAL-27/DDP组G₁期和G₂期细胞比例减少,S期细胞比例升高,CAL-27/DDP组细胞株中MDR1mRNA和P-gp相对表达水平升高(P<0.01)。结论: 本研究建立了人舌鳞癌顺铂耐药细胞株CAL-27/DDP,其耐药机制与CAL-27/DDP细胞株中MDR1和P-gp的表达水平上调有关联。     

和厚朴酚对人舌癌CAL-27细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的 探讨和厚朴酚（HNK）对人舌鳞癌CAL-27细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法 采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养CAL-27细胞。并将其分为对照组和3个实验组,实验组分别加入20、40、60 μmol/L的HNK进行处理。用MTT法检测 不同浓度和厚朴酚对CAL-27细胞增殖的影响;划痕实验观察CAL-27细胞迁移能力;Hoechst33342荧光染色法和Annexin VFITC/PI法检测CAL-27细胞凋亡数及凋亡率;Western blot检测CAL-27细胞内p-Pi3k、p-Fak、Fak、MMP2、MMP9、p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2和Cleaved-Caspase-3的蛋白表达量。结果 HNK（0、20、40、60 μmol/L）处理24 h后CAL-27细胞增殖、迁移能力减弱;且随HNK浓度增大细胞凋亡数升高,凋亡率分别为（6.53±1.80）%、（15.24±2.06）%、（35.03±2.42）%、（48.13±4.61）%,细胞内p-Pi3k、p-Fak、p-Akt、MMP2、MMP9和Bcl-2蛋白表达量减少而Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表达量增加（P<0.01）。结论 HNK能抑制CAL-27细胞体外增殖及迁移,同时还能诱导其凋亡,作用机制可能与调控细胞内p-Pi3k、p-Fak、p-Akt、MMP2、MMP9、Bax、Bcl-2和Cleaved-Caspase-3的蛋白表达量有关。     

RNAi干扰WT1和Pax2表达对逆转肾小管上皮间充质转化的作用

 【目的】 探讨抑制肾小管上皮间充质转化(EMT)过程中胚胎发育关键基因WT1和Pax2的表达对EMT的逆转作用。【方法】 采用RNAi技术分别抑制WT1和Pax2。分别构建pshRNA-WT1和pshRNA-Pax2表达载体,采用脂质体转染技术,使质粒瞬时转染NEK52E细胞后用10 ng/mL IL-1α刺激细胞,分别提取不同时间点细胞的RNA和蛋白质,采用RT-PCR和Western blot检测细胞WT1、Pax2、Snail、上皮细胞标志E-cadherin和间充质标志α-SMA的mRNA和蛋白质的表达,并观察NRK52E细胞的形态。【结果】构建的pshRNA-WT1和pshRNA-Pax2表达载体可在转染细胞内发挥RNAi作用抑制WT1和Pax2基因的表达,抑制率分别为80.4 %和82.7 %。分别抑制WT1和Pax2基因后EMT过程受阻,α-SMA和Snail的表达显著减少,E-cadherin的表达无显著性变化,细胞形态未发生明显的成纤维化样改变。【结论】 WT1和Pax2基因是EMT中的关键基因,分别抑制胚胎发育关键基因WT1和Pax2均可使EMT受阻。阻断WT1和Pax2的表达有望中止EMT及肾纤维化的发生。     

LncRNA PCBP1-AS1对口腔鳞癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA PCBP1-AS1（LncRNA PCBP1-AS1）对口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞增殖、侵袭及凋亡的影响及其可能机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应检测OSCC细胞中PCBP1-AS1的表达水平;采用Lipofectamine 2000将pcDNA-PCBP1-AS1及pcDNA-control转染入口腔鳞癌CAL-27细胞;甲基噻唑基四唑实验检测CAL-27细胞的增殖能力;Transwell实验检测细胞的侵袭能力;流式细胞术检测细胞的凋亡率;蛋白免疫印迹法检测细胞周期依赖蛋白激酶1（CDK1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）、Janus激酶2（JAK2）/信号转导与转录激活因子3（STAT3）信号通路相关蛋白表达。结果与正常口腔上皮细胞比较,OSCC细胞CAL-27、Tca8113、KB中PCBP1-AS1的表达水平显著降低（P < 0.01）;PCBP1-AS1过表达可显著抑制CAL-27细胞的增殖、侵袭（P < 0.01）,促进细胞凋亡（P < 0.01）;PCBP1-AS1过表达可显著抑制CDK1、MMP-2、Bcl2、p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达（P < 0.01）,而促进Bax的蛋白表达（P < 0.01）。结论PCBP1-AS1过表达可抑制OSCC细胞增殖、侵袭,诱导细胞凋亡,其作用可能与抑制JAK2/STAT3信号通路激活有关。     

PKB/CDC25B信号通路对甲状腺鳞癌SW579细胞生长增殖的调控作用

目的探讨PKB/Cdc25B信号通路对甲状腺鳞癌SW579细胞生长增殖的调控作用。方法体外培养甲状腺鳞癌SW579细胞,实验分为对照组、Wortmannin组和DMSO组,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化;用western blot方法检测PKB、CDC25B蛋白表达和PKB-pS473、CDC25B-pS353及CDC2-pTyr15的磷酸化状态;用ELISA方法检测MPF活性。结果与对照组相比,DMSO组细胞形态无明显变化,各项检测指标无明显差异（P〉0.05）;Wortmannin组细胞形态回缩,PKB和CDC25B蛋白表达明显下降（P〈0.01）,PKB-pS473和CDC25B-pS353的磷酸化水平显著下调（P〈0.01）,而CDC2-pTyr15的磷酸化水平显著上调（P〈0.01）,MPF活性明显下降（P〈0.01）。结论甲状腺鳞癌SW579细胞内源性PKB可以通过调控CDC25B对MPF活性及细胞增殖产生影响。     

川崎病中IgM-AECA通过JNK、p38及NF-κB诱导内皮细胞ICAM-1的表达

目的川崎病(Kawasaki Disease,KD)大部分病人血清中存在抗内皮细胞受体抗体-IgM(IgM An-ti-endothelial cell antibodies,IgM-AECA)。该研究旨在探讨抗内皮细胞受体抗体(AECA)通过何种途径诱导内皮细胞细胞内吸附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达以激活血管内皮细胞。方法检测30名KD患儿血清IgM-AECA浓度,并从17名AECA阳性KD患儿血清中提纯IgM-AECA,用IgM-AECA直接刺激人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells,HCAEC)后,通过R T-PCR及ELISA方法检测ICAM-1 mR NA及蛋白的表达,同时应用了PD98059,SB203580,dimethylaminopurine(DMAP)和parthenolide,4种蛋白激酶阻断剂观察IgM-AECA通过何种途径激活HCAEC。结果 KD病人血清中的IgM-AECA可使HCAEC的ICAM-1 mRNA及蛋白表达明显增加,SB203580(p38阻断剂)、DMAP(JNK阻断剂)及parthenolide(NF-κB阻断剂)明显抑制ICAM-1的表达(均P<0.01),而PD98059(ERK1/2阻断剂)不能抑制ICAM-1的表达(P>0.05)。结论 KD病人血清中的IgM-AECA通过增强ICAM-1的表达来激活内皮细胞,IgM-AECA通过p38、JNK MAPK及NF-κB通路诱导ICAM-1的表达,IgM-AECA可能在KD冠状动脉病变的发生中发挥重要作用。