小鼠IL-10重组慢病毒载体的构建和病毒包装

目的:构建小鼠IL-10重组慢病毒表达载体并进行包装,为进一步研究IL-10基因修饰树突细胞在哮喘免疫耐受中的作用提供实验基础。方法:小鼠IL-10基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得PGC-LV-IL-10重组慢病毒并转化细菌感受态细胞。克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序并转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定。将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装,Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:DNA测序结果及Western blot鉴定证实成功构建小鼠IL-10重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装小鼠IL-10重组慢病毒表达载体。     

白介素-10、树突状细胞及免疫耐受

肝脏因其固有的移植耐受性而在免疫耐受研究中受到关注。最近有人提出肝移植耐受中 ,DC可能起关键作用。DC是一类专职抗原呈递细胞 ,在诱发免疫反应及诱导免疫耐受中均起重要作用。IL 10作为强有力的免疫抑制因子 ,在肝内由多种细胞分泌。尽管IL 10能直接抑制T细胞的功能 ,但其免疫抑制效应也可能通过影响DC的发育分化而起作用。抑制因子作用于DC发育成熟的早期阶段 ,引起DC的特殊分化 ,从而诱导对特定抗原的免疫耐受 ,这可能是肝移植耐受的主要原因。     

FasL基因重组慢病毒载体感染SD大鼠树突状细胞的研究

目的 探讨FasL基因重组慢病毒载体感染SD大鼠树突状细胞的效率和FasI 蛋白的表达情况,为进一步研究转FasL基因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受和保护移植物打下基础.方法 将培养一周的细胞重铺于六孔板中,每孔细胞数量为5×105,24 h后观察,细胞适合感染,按照MOI=10感染细胞,使用GFP阳性对照质粒作对照实验,感染24 h后,培养皿中添加1 ml新鲜培养基,每隔1 d加细胞因子继续培养,荧光显微镜观察荧光强度和数量,添加病毒液后10 d收集细胞进行实时定量检测和WB检测.结果 FasL基困重组慢病毒载体感染DC 8 d后,细胞开始出现荧光,10 d感染效率为100%;实时定量PCR检测瞬时转染后目的 基因的表达显示以细胞的1.00%为参照,Cell+FasL质粒为167.03%;免疫印迹检测转染后FasL蛋白的表达显示以细胞的1.00%为参照,细胞+FasL质粒为34.15%.结论 FasL基因重组慢病毒载体成功感染DC,实时定量PCR及Western印迹证实感染的Dc表达FasL明显提高.为进一步研究转FasL摹因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受和保护移植物打下基础.     

052 白介素-10、树突状细胞及免疫耐受

肝脏因其固有的移植耐受性而在免疫耐受研究中受到关注.最近有人提出肝移植耐受中,DC可能起关键作用.DC是一类专职抗原呈递细胞,在诱发免疫反应及诱导免疫耐受中均起重要作用.IL-10作为强有力的免疫抑制因子,在肝内由多种细胞分泌.尽管IL-10能直接抑制T细胞的功能,但其免疫抑制效应也可能通过影响DC的发育分化而起作用.抑制因子作用于DC发育成熟的早期阶段,引起DC的特殊分化,从而诱导对特定抗原的免疫耐受,这可能是肝移植耐受的主要原因.     

慢病毒载体介导的小鼠骨髓树突状细胞RelB基因沉默

目的: 利用慢病毒载体沉默小鼠骨髓树突状细胞(DC)的RelB基因, 建立RelB基因低表达的骨髓致耐受DC, 为自身免疫病的防治提供新方法.方法: 设计小鼠RelB基因干扰的靶序列R5, 合成并克隆到慢病毒载体上, 与慢病毒的包装材料在293FT细胞中包装成病毒颗粒, 收集病毒上清, 测定病毒滴度, 然后包装慢病毒感染DC, RT-PCR和免疫荧光方法检测, 灰度扫描并用软件分析RelB基因的表达水平, 未成熟DC作对照组, 选择T6包装病毒为RNAi的阴性对照.结果: RT-PCR和免疫荧光方法发现R5病毒感染的DC RelB基因表达水平与未成熟DC基因表达水平接近, 低于成熟DC的表达水平(P<0.05), 而实验对照T6组病毒感染的DC其RelB基因表达水平高于未成熟DC(P<0.05)和R5病毒转染DC组(P<0.05).结论: 小鼠骨髓DC表达的RelB基因被慢病毒载体有效沉默, 有望成为DC免疫治疗的新载体.     

IL-10上调PD-1配体的表达诱导耐受性树突状细胞形成

目的 探讨IL-10诱导耐受性树突状细胞（DCs）形成的机制。方法 用30ng／mL的IL-10处理Balb／c小鼠骨髓DCs，分别用RT-PCR和流式细胞术分析DCs的PD-1配体分子的表达，用MTF法测定DCs激活T细胞的能力，并用IL-10-DCs免疫荷瘤小鼠，观察H22肝癌细胞的生长情况。结果 IL-10-DCs对T细胞的激活能力降低；在注射了IL-10-DCs的小鼠体内，H22肝癌细胞的生长速度快于对照组；免疫抑制性受体PD-1的配体分子在IL-10-DCs上的表达上调。结果提示，在H22肝癌模型上，IL-10上调PD-1的配体分子表达可能是免疫耐受的一个机制。结论 减少IL-10的产生或封闭PD-1／PD-L路径可能是一个很有前景的肝癌生物学治疗策略。     

姜黄素诱导的免疫耐受性人树突状细胞的研究

目的:探讨姜黄素(Curcumin)诱导免疫耐受性人树突状细胞(Dendritic cell,DC)的效果。方法:聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque,F-H)密度梯度离心法获得健康人外周血单个核细胞(PBMC),在含有重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素4(rhIL-4)的培养基中培养6天。实验共分四组:①未成熟DC组(imDC组)、②姜黄素组(Curcumin,Cur组)、③姜黄素+脂多糖组(Cur+LPS组)、④脂多糖组(LPS组)。流式细胞术检测DC表型CD80、CD86、CD83及HLA-DR的表达情况和DC吞噬葡聚糖的能力,酶联免疫吸附法(ELISA)检测DC分泌白介素-12(IL-12)的能力,混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果:Cur能够显著抑制DC共刺激分子CD80、CD86、CD83及HLA-DR的表达,并呈剂量依赖性,与imDC组比较差异无统计学意义;与LPS组比较,Cur+LPS组DC吞噬葡聚糖的阳性细胞百分率显著提高(P<0.05),而刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力则显著下降(P<0.05),IL-12的分泌量也显著下降(P<0.05)。结论:姜黄素能够抑制人树突状细胞的成熟,从而获得免疫耐受性的人树突状细胞。     

IL-10与树突状细胞的免疫调控作用

IL-10是一种重要的抗炎性细胞因子，近年发现在树突状细胞的免疫调控中具有重要作用。IL-10可抑制树突状细胞的成熟及产生IL-12，有助手树突状细胞诱导Th2反应。内源性或外源性IL-10在树突状细胞诱导无能／调节T细胞中具有重要作用。许多因素影响树突状细胞分泌IL-10，从而对疾病的发生发展产生影响。     

白介素—10、树突状细胞及免疫耐受

肝脏因其固有的移植耐受性而在免疫耐受研究中受到关注。最近有人提出肝移植受中,DC可能起关键作用。DC是一类专职抗原呈递细胞,在诱发免疫反应及诱导免疫耐受中均起重要作用。IL－10作为强有力的 制因子,在肝内由多种细胞分泌,尽管IL－10能直接抑制T细胞的功能,但其免疫抑制效应也可能通过影响DC的发育分化而起作用。抑制因子作用于DC发育成熟的早期阶段,引起DC的特殊分化,从而诱导对特定抗原地免疫耐受,这可能是肝移植耐受的主要原因。     

携带AFP基因慢病毒载体制备并感染树突状细胞的实验研究

目的:制备携带AFP基因的慢病毒, 并体外感染树突状细胞(DC) , 制备AFP-DC疫苗.方法:以人HepG2肝癌细胞cDNA为模板PCR 扩增出AFP基因片段, 将该片段克隆入慢病毒载体, 构建成Lenti-AFP慢病毒载体.其后, 用慢病毒载体转染293T细胞, 包装慢病毒表达载体.通过酶切、 PCR对Lenti-AFP慢病毒载体进行鉴定.包装好的慢病毒体外感染DC, 制备AFP-DC疫苗, 流式细胞仪检测感染率, 免疫荧光、 RT-PCR 法及电化学发光法检测AFP表达.结果:酶切、 PCR鉴定证实, 慢病毒载体插入片段为AFP基因.包装的慢病毒具有良好的感染性, 可以在293T细胞中形成病毒颗粒, 携带AFP基因的慢病毒感染DC, 经免疫荧光、 RT-PCR法及电化学发光法证实DC能够表达转染基因AFP, 并且不会影响DC表型, 感染率高达78.91%.结论:成功构建携带AFP基因的慢病毒载体, 感染树突状细胞后表达AFP, 为DC疫苗在肝癌中的临床应用提供了实验基础.     

IL-10与树突状细胞的免疫调控作用

IL 10是一种重要的抗炎性细胞因子 ,近年发现在树突状细胞的免疫调控中具有重要作用。IL 10可抑制树突状细胞的成熟及产生IL 12 ,有助于树突状细胞诱导Th2反应。内源性或外源性IL 10在树突状细胞诱导无能 /调节T细胞中具有重要作用。许多因素影响树突状细胞分泌IL 10 ,从而对疾病的发生发展产生影响。     

转染IL-10的树突状细胞对小鼠哮喘气道表达的影响

研究小鼠重组腺病毒载体Ad-mIL-10及其转染的树突状细胞(dendritic cell,DC)对小鼠哮喘模型气道炎症的影响,探讨其相关的发病机制。用基因工程的方法构建小鼠IL-10腺病毒重组体Ad-mIL-10,并转染小鼠骨髓来源的DC。以卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏小鼠并雾化吸入激发的方法制作小鼠哮喘模型。第一次腹腔OVA致敏后静脉给予Ad-mIL-10、Ad-EGFP、Ad-EGFP转染的DC或Ad-mIL-10转染的DC,并设立哮喘模型制作对照组,观察各组小鼠血液、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的CD3+T细胞中的IL-10+IL-4-的Tr细胞及IL-10+IL-4+的Th2细胞比例变化,ELISA方法测定外周血及肺泡灌洗液中的IFN-γ、IL-4、IL-10水平,以观察Th1、Th2细胞的数量、功能变化以及IL-10的变化。结果显示Ad-mIL-10、Ad-EGFP、Ad-EGFP-DC对哮喘模型小鼠体内Tr细胞和Th2细胞的数量及肺部炎症局部的Th1及Th2细胞功能无明显影响;Ad-mIL-10转染的DC可以诱导哮喘模型小鼠体内IL-4-IL-10+的Tr细胞的增加及IL-4+IL-10+的Th2细胞的减少,并抑制哮喘模型小鼠肺部Th2细胞的功能,但对Th1细胞的功能无明显影响。提示单独应用Ad-mIL-10静脉注射产生高浓度的IL-10并不能诱导Tr细胞分化和抑制Th2细胞的激活。Ad-mIL-10转染的DC可以诱导原始T细胞向Tr细胞方向分化,并抑制Th2细胞的数量和功能。     

树突状细胞诱导外周免疫耐受的机制

树突状细胞既能启动免疫应答 ,又能诱导免疫耐受。目前对树突状细胞诱导外周耐受方面的研究进展迅速 ,本文就未成熟树突状细胞、免疫抑制因子处理的树突状细胞及转基因树突状细胞在诱导外周免疫耐受中的作用作一综述 ,这可能是治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应的新途径     

IL-10基因修饰的大鼠树突状细胞表型分析及生物学特性的研究

目的研究IL-10基因修饰后的大鼠树突状细胞(DC)的表型及其生物学特性。方法以含IL-10基因的重组腺病毒载体体外转染大鼠骨髓来源的DC,Western blot测定转染后各组DC中IL-10蛋白的表达,流式细胞仪检测各组DC表面抗原CD83、CD86分子的表达情况,混合淋巴细胞反应法测定各组DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果 IL-10基因修饰组DC可检测到IL-10高表达,表面抗原CD83、CD86低表达,其刺激T淋巴细胞增殖水平较其他各组低。结论 IL-10基因修饰的DC可有效的表达有功能的IL-10,为研究IL-10修饰的DC诱导同种异体移植免疫耐受奠定了基础。     

体外联合应用IL-10和甲基强的松龙处理树突状细胞诱导移植的免疫耐受

目的探讨体外联合应用白细胞介素10(IL-10)和甲基强的松龙(Medron)处理供体树突状细胞(DC)对小鼠皮肤移植术后免疫耐受的诱导效果,为抗移植术后免疫排斥反应治疗提供依据。方法以健康成年C57BL/6小鼠为供体。BALB/c小鼠为受体,随机分为11组。除A组外,其余各组均于皮肤移植前3d自尾静脉输入对应的供体DC。具体对应关系如下A组为空白对照,尾静脉输入生理盐水;B组为输入未修饰的DC;C1组为10μg/LIL-10处理组;C2组为30μg/LIL-10处理组;D1组为10mg/LMedron处理组;D2组为20mg/LMedron处理组;E1~E4组分别为10μg/LIL-10 10mg/LMedron处理组、10μg/LIL-10 20mg/LMedron处理组、30μg/LIL-10 10mg/LMedron处理组、30μg/LIL-10 20mg/LMedron处理组。同时设立F组,为BALB/c对BALB/c的同种同基因皮片移植。各组行皮肤移植术,观察受体移植皮片存活情况。结果相对于生理盐水组,E3组(30μg/LIL-10 10mg/LMedron处理组)的移植皮片存活时间最长,经统计学分析两种药物之间具有交互作用(P<0.05)。结论用IL-10和修饰的供体树突状细胞对受体进行预处理,可明显延长移植皮片的存活时间。     

产生白细胞介素-10的树突状细胞与免疫耐受

白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是一种重要的抗炎因子,具有免疫调节功能。目前认为树突状细胞(dendritic cells,DCs)可以调控免疫反应,既促进免疫反应,又诱导免疫耐受。研究发现DCs是IL-10的重要细胞来源,且将产生IL-10的DCs定义为IL-10 +DCs。这群...     

耐受性树突状细胞抑制炎症性疾病的机制及进展

树突状细胞(DCs)是调节免疫反应的关键细胞,通过呈递抗原参与机体的固有免疫和适应性免疫。耐受型DC(tolDC)主要通过抑制效应T细胞反应及诱导调节性T细胞(Tregs)发挥免疫耐受作用。tolDC以致免疫耐受这一特点被广泛应用于自身免疫病和器官移植的治疗,其是否可用于炎症、过敏性疾病的治疗已成为近年的一大研究热点。本文对tolDC的细胞分型、表面标志物,其参与抑制炎症反应可能的免疫细胞、酶、细胞因子、信号转导通路等机制进行总结,并对其在炎症相关疾病的基础和临床研究应用作一综述。     

未成熟树突状细胞诱导异基因嵌合体的形成

目的：证实供体来源的未成熟树突状细胞（imDCs）主支免疫受体小鼠后可诱导形成基因嵌合体。方法：应用供体（C57BL／6）来源的骨细胞在体外培养出imDCs，灭活后静脉输注受体小鼠（BALB／c），并于输注后不同时间输注供体来源的骨髓细胞，检测异基因嵌合体的形成。同时比较imDCs一次免疫与多次免疫对诱导嵌合体形成的影响。结果：在imDCs免疫后3d输注骨髓细胞可诱导基因嵌体合体的形成，并持续100d以上；在免疫后5d注射骨髓细胞只能形成短暂的（＜21d）、低水平（＜1％）的嵌合状态；7d后则完全不能形成嵌合。应用一次和多次imDCs免疫均能诱导形成异基因嵌合体，且维持时间均大于100d，但其嵌合程度有显著性统计学差异（P＜0．05）。结论：应用供体来源的imDCs主动脉免疫受体可诱导形成异基因嵌合体。     

抑制性树突状细胞诱导移植免疫耐受的研究进展

树突状细胞（DC）是功能强大的专职抗原呈递细胞。在器官或细胞移植中，DC通过直接或间接识别途径呈递抗原活化T细胞，引起移植免疫排斥反应，但某些特殊类型的DC也可以产生抑制免疫应答，促进免疫耐受的作用。基于DC这种生物学特性的异质性，目前有多种生物学策略诱生抑制性DC诱导移植免疫耐受。     

核转录因子RelB抑制途径对骨髓树突状细胞表面分子表达的影响研究

目的探讨核转录因子RelB抑制途径对小鼠骨髓树突状细胞（bone marrow dendritic cells）的表面分子表达的影响,为致耐受树突状细胞的研究提供新方法。方法 rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导培养体系培养小鼠骨髓树突状细胞,免疫磁珠方法纯化;用慢病毒载体制备RelB shRNA慢病毒,与小鼠骨髓树突状细胞共培养,流式细胞术观察树突状细胞表面分子MHC-II、CD86和CD40的表达,设LPS-DC对照组、未处理组和LPSRNAi RelB DC组。结果核转录因子RelB抑制的树突状细胞表面分子MHC-II、CD86和CD40均低水平表达,显著低于成熟DC表面分子的表达（P〈0.05）,且经LPS刺激后（LPS RNAi RelB DC）DC表面上述三类分子的表达水平仍显著低于LPS-DC组（P〈0.05）,与未处理组（immature DC）表面分子表达水平相当。结论核转录因子RelB抑制的骨髓树突状细胞表面分子表达水平低,呈现出致耐受的树突状细胞的特点,是致耐受树突状细胞研究的一种新方法。