固定化青霉素酰化酶反应器研究进展

介绍固定化青霉素酰化酶反应器的研究现状，将这类反应器分为搅拌釜反应器、柱式填充床反应器、中空纤维膜反应器以及电渗析耦合反应器，从工程角度分析了各类反应器的优缺点，并展望其今后的发展趋势。     

青霉素酰化酶研究进展

青霉素酰化酶除了在医药工业上用于大规模生产β－内酰胺类抗生素中间体和半合成β－内酰胺类抗生素之外,还有其它的一些潜在应用;对青霉素酰化酶的研究一直吸引着各国科研人员的兴趣,近年来,用一些经典的和现代的技术手段,对青霉素酰化酶产生菌进行改良,通过理化诱变,使酶活力提高;通过定点突和化学修饰,将酶活性中心的丝氨酸变成半胱氨酸或含硒原子的半胱氨酸,使酶的合成活力相对于水解活力大幅提高,通过基因工程技术提高酶的表达水平,促进分泌或改进生产菌的缺陷,出现了介孔分子筛,二甘醇二甲基酯丙烯酸酯接枝尼龙共聚物等新的;固定化材料及酶膜反应器,多室固定化酶反应器,有望用于工业化生产。ββ     

利用无机载体固定化青霉素酰化酶的研究

以无机材料６２０１型担体作载体,进行青霉素酰化酶固定化的研究。考察了ＡＰＴＳ和戊二醛浓度、给酶量以ｐＨ等因素对固定化酶酶活的影响。结果表明,以６２０１型担体为载体制备得到的固定化酶具有较高的酶活回收,达４２．８％;操作稳定性良好;用其连续水解３０批青霉素Ｇ的钾盐溶液,酶活未见明显下降;该固定化酶与游离酶相比,可在较宽的ｐＨ范围保持高酶活。     

青霉素酰化酶提取及其与固定化酶的动力学参数测定和比较

采用冻融-溶媒法从大肠杆菌中提取青霉素酰化酶(经硫酸铵沉淀、透析、冷冻干燥),制得酶粉,活力为1100.37u/g,经六批提取试验,平均提取收率47.93％。分别测定游离酶及其固定化酶米氏常数Km值。游离酶的Km值为2.39mM,固定化酶按其颗粒大小不同,Km值分别为5.62、8.46、8.42mM。 在对pH稳定性测定中,游离酶最适pH为7～8,而固定化后在pH5～9之间都较稳定。对温度的稳定性测定中,游离酶与固定化酶在40℃以下都较稳定,但在45℃保温一小时后,游离酶只存留活力39.51％,而固定化酶却存留活力86.92％,二者有显著差异、温度再高相差更大。因此酶经固定化后,对pH和温度的稳定性都有明显提高。金属离子对青霉素酰化酶的活力有所影响。特别是铁离子和铜离子影响较大,故酶反应容器不能采用铁和铜的材料。     

青霉素酰化酶:固定化及其应用

青霉素酰化酶广泛应用于β-内酰胺类抗生素中间体和半合成β-内酰胺类抗生素的合成。虽然游离酶具有极高的催化活性,但其对温度、pH值、溶剂极性等的耐受范围极窄,极易失活,而且在有机溶剂中发生的失活是不可逆的。为了提高其各方面稳定性,不断有新的固定化方法提出。本文综述了青霉素酰化酶的固定化方法及其应用。     

固定化青霉素G酰化酶的初步研究

本文研究固定化青霉素G酰化酶的不同制备方法,比较了各种固定化青霉素G酰化酶的载体。实验表明:聚丙烯腈纤维和无机载体制成的固定化酶具有较高的酶比活力,而且表面积大,易于装柱,抗污染能力大,又能裂解高浓度青霉素 G 溶液生成6-APA。     

用脱乙酰几丁质制备固定化青霉素酰化酶

以青霉素酰化酶基因工程菌为酶源,选用脱乙酰几丁质为载体,试用了4种固定化方法,从4个方面(pH、温度、盐浓度和结合酶量)摸索了固定化条件。结果在适宜条件下获得比活900U/g(干)(NIPAB法)的固定化青霉素酰化酶,回收率可达56%。并测定其酶学性质。     

固定化青霉素酰化酶反应器的研制和应用(英文)

目的研制一个全新的 2 0 0L不锈钢固定化青霉素酰化酶反应器并在中试中应用。方法在罐内壁上安装三个盛酶柱 ,每根酶柱装入湿纤维状固定化酶 1 5kg,酶活力 76 2IU·g-1(以湿品为基础计算 )。以HBO3 作缓冲液 ,底物青霉素G钾的质量浓度为 80 g·L-1。每批投料 12kg,每批裂解反应 90min。结果 15批之后 ,剩余酶活力 6 85IU·g-1(以湿品为基础计算 ) ,6 APA收率平均达 89 8%。结论 6 APA生产中使用新的固定化青霉素酰化酶反应器将提高 6 APA的收率 ,减少固定化青霉素酰化酶的损耗。     

青霉素G酰化酶在γ—氧化铝上的吸附交联固定化

以γ-氧化铝为载体,利用戊二醛对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)Bp931胞外青霉素G酰化酶进行吸附交联固定化.酶活力回收为31%,在37 C、pH8.0的条件下,固定化酶对青霉素G的活力为304IU/g;作用于青霉素G的表观米氏常数Km值为3.23×10-2M.该固定化酶可耐高离子强度洗涤,连续合成头孢拉定(cephradine)10批次,酶活力剩余82%.     

固定化酰化酶在青霉素裂解反应中的影响因素分析

在酶促脱酰法裂解青霉素工业钾盐生产药用中间体6-氨基青霉烷酸(即6-APA)的反应杌理中,在不同反应物浓度、pH及温度下将直接影响酰化酶的活性及其使用寿命。本文通过多组实验进行比较分析摸索出酰化酶的最适宜的工艺条件以达到延长酰化酶的使用寿命,降低6-APA的生产成本的目的。     

用双水相体系萃取青霉素酰化酶的研究

本文首先研究了大肠杆菌青霉素酰化酶生产菌AS1.76的细胞破碎过程,用冻融法通过四次处理,青霉素酰化酶的释放率可达77％,通过实验重新确定了NIPAB法中Na_2CO_3的用量。 本文研究了用PEG4000/磷酸盐体系提取细胞破碎液中的青霉素酰化酶,通过实验确定了最佳体系:PEG4000浓度16％(w/w),磷酸盐浓度14％(w/w),一步萃取收率在90％以上,纯化因子311,为工业上采用双水相萃取青霉素酰化酶提供了一条新途径。     

青霉素酰化酶电极

用海藻酸钠-氯化钙包埋法制备青霉素酰化酶电极,电极涂液中海藻酸钠浓度为1％,酶量大于15U/100mg较好。经聚乙烯亚胺处理的电极的抗磷酸盐性能良好,测试在pH 7.05缓冲液中进行,加样搅拌平衡后,取停止搅拌5min后的pH读数,△pH-青霉素G浓度的线性范围为0～1.88mg/ml。温度和pH对pH响应值均有影响。     

头孢G酸酶裂解制备7-ADCA的研究

目的：用头孢Ｇ酸在固定化青霉素经酶催化下裂解制备７－ＡＤＣＡ。方法：在硼酸缓冲溶液中,以固定化青霉素酰化酶催化裂解头孢Ｇ酸制备７－ＡＤＣＡ。结果：最优反应条件为温度２８－３０℃,ｐＨ７．８－８．０;ＩＰＡ－７５０用量每１０ｇ头孢Ｇ酸１１．６－１２ｇ。结论：ＩＰＡ－７５０虽裂解时间较长,但价格低,用以替代ＰＧＡ－４５０在经济上是合算的。产品怍率达９３％。     

青霉素酰化酶基因工程菌大肠杆菌A56（pPA22）的发酵工艺研究

对青霉素酰化酶基因工程菌大肠杆茵Ａ５６（ｐＰＡ２２）作发酵工艺研究。确定了合适的培养条件。找到了替代进口酵母浸出粉的原材料，国产酵母浸出粉完全替代时以３％的用量为好；用价格低廉、货源充沛的玉米浆替代时以５％用量为佳。发酵过程中采用了补料工艺。在４００公升罐中进行试验，培养液的酶活性达到每１００ｍｌ为２２０．４单位，最高罐批为３２０单位。通过不断地茵种选育和发酵工艺改进，在生产罐上４０批平均酶活住达到每１００ｍｌ为４０５．４单位，最高罐批为５４６单位。４０批菌体酶活性每克湿菌体２０４单位，最高罐批达到２７０单位。将这些菌体用于６－ＡＰＡ生产上，酶解了２００余批，６－ＡＰＡ克分子重量收率在８７％左右，效价２６００ｕ／ｍｇ以上，透光度＞４０％。     

基因工程菌A56（pPA22）生物合成青霉素酰化酶的发酵工艺研究

青霉素酰化酶基因工程菌E.coli A_(56)(pPA_(22))中试研究,在500升发酵罐考察该菌株生物合成青霉素酰化酶的工艺条件,发酵温度22.5℃,通气比1∶0.4,搅拌转速70转/分。同时还考察了不同浓度苯乙酸和苯乙酸加入时间。试验证明低浓度的溶解氧对酰化酶合成有利。发酵过程pH控制范围:生长期7.2～7.5,酶合成期7.5～8.0,发酵末期8.2～8.5。500升发酵罐最高酶产量达215.9u/100ml。     

游离态和固定态青霉素酰化酶对环境的敏感性

在优化的固定化条件下，通过戊二醛交联直接将青霉素酰化酶固定化。比较了环境因素对游离酶和两种化酶活性的影响，结果表明青霉固定化后，抗环境变化的能力明显提高。现任中固定化酶活化的比较说明由游离酶直接交联得到的固定化酶更适合工业应用。     

青霉素酰化酶基因重组大肠杆菌在两水相体系中的转化反应

以青霉素酰化酶基因重组大肠杆菌Ａ５６（ｐＰＡ２２），经戊二醛交联（防止细胞自溶）后，在ＰＥＧ２０００－ＤｅｘｔｒａｎＴ７０两水相体系中进行转化反应，生产６－氨基青霉烷酸（６－ＡＰＡ）。实现含酶菌体在两水相体系中的单侧分配。考察了菌体加量对青霉素转化率的影响。在两水相体系中进行５批半连续转化反应，底物浓度为７％，转化率在９０％以上，反应时间为４０分钟，比生产速率为３·６～４·６μｍｏｌ／ｍｌ·ｍｉｎ，下相酶活为５２ｕ／ｍｌ，并从上相中直接结晶６－ＡＰＡ，６－ＡＰＡ的纯度为９６·２％。实现了高底物浓度，高转化率，缩短反应时间和产物不需浓缩直接结晶之目的。在两水相体系中生产６－ＡＰＡ成为又一新的青霉素酰化酶应用形式。     

工程菌Ec108（pPAHD1）青霉素酰化酶表达水平的研究

用2 L 全自动发酵罐观察 Ec 108(pPAHD 1)青霉素酰化酶基因的表达,发现对数前期生物量扩增时,溶解氧以相对饱和度≥80%为宜,而产酶阶段则要求相对饱和度约为5%。应根据溶氧曲线变化特征指导诱导剂苯乙酸的补加时机和剂量,以每次补加0.03～0.05%为佳。在罐压29 kPa、通气比1:0.5的恒温条件下,借助上述手段,可使最高酶活水平达342u/100 ml(NIPAB 法),比摇瓶发酵提高1.8倍。