乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人恶性黑素瘤裸鼠皮下移植瘤抑制作用的研究

目的探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法分空白组、无关序列(N-ODN)组、10μmol/LASODN组、20μmol/LASODN组和30μmol/LASODN组5组,以脂质体包埋分别转染人恶性黑素瘤细胞株A375,后接种于裸鼠皮下,观察裸鼠移植瘤体积变化,并采用原位杂交、免疫组化法检测移植瘤中乙酰肝素酶mRNA及其蛋白表达的变化。结果接种6周后,各ASODN组的裸鼠移植瘤体积均显著小于N-ODN组和对照组(P均<0.05);各ASODN组裸鼠移植瘤中乙酰肝素酶mRNA和蛋白水平均较对照组、N-ODN组显著下调(P均=0.000)。结论乙酰肝素酶ASODN对人恶性黑素瘤裸鼠皮下移植瘤具有抑制作用。     

黑素瘤细胞生长因子表达及微血管密度研究

目的:探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在人黑素瘤中的表达和微血管密度(MVD)的关系。方法:采用免疫组化方法检测42例黑素瘤组织中的VEGF、bFGF的表达;利用第Ⅷ因子相关抗原(FⅧ-RAg)血管内皮细胞特异性染色,对肿瘤MVD进行计数和分析。结果:42例黑素瘤组织中,表达VEGF32例,bFGF29例,两指标均表达25例,VEGF与bFGF的表达呈正相关,VEGF、bFGF表达与淋巴结转移有关;色素痣组织不表达VEGF、bFGF;黑素瘤MVD明显高于色素痣。结论:MVD随着VEGF、bFGF表达的增强而增加,VEGF和bFGF在促进黑素瘤血管形成和促进肿瘤转移方面起协同作用。     

骨桥蛋白在黑素瘤中的表达

目的研究骨桥蛋白(OPN)的表达与黑素瘤浸润、转移的关系。方法采用免疫组化SP法检测OPN在黑素瘤(30例)、黑素细胞痣(30例)、正常皮肤组织(15例)以及在黑素瘤A375细胞株和不同浓度乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染的裸鼠黑素瘤移植瘤中的表达。结果 OPN在黑素瘤、黑素细胞痣及正常皮肤组织中阳性表达率分别为86.67%(26/30),13.33%(4/30)和0(0/15),黑素瘤组与黑素细胞痣组及正常皮肤组OPN的阳性表达率比较差异有统计学意义(P=0.000)。3种不同浓度的乙酰肝素酶反义寡核苷酸在转染的裸鼠体内恶性黑素瘤移植瘤中表达表现出不同程度的抑制作用,30μmol/L实验组的抑制作用最强。OPN在人黑素瘤A375细胞株中呈强阳性表达。结论 OPN在黑素瘤中的表达明显高于其在黑素细胞痣和正常皮肤中的表达;乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠体内黑素瘤移植瘤中OPN的表达有显著抑制作用;OPN在A375细胞株中呈强阳性表达。     

婴幼儿血管瘤患者尿液中bFGF的检测及意义

目的探讨尿液中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)浓度,以鉴别婴幼儿血管瘤和血管畸形并对血管瘤进行分期。方法采用ELISA法检测29例增生期血管瘤、24例消退期血管瘤、12例血管畸形患儿和10例对照婴幼儿尿液中bFGF浓度。结果增生期血管瘤患儿尿液中bFGF浓度高于消退期血管瘤、血管畸形和对照组,差别有显著性意义(P<0.05),消退期血管瘤、血管畸形与对照组之间尿液中bFGF浓度的差别亦有显著性意义(P<0.05)。结论用ELISA法测定尿液中bFGF简便、易行、可靠,可为临床鉴别血管瘤和血管畸形,并为划分血管瘤分期及监测治疗效果提供客观的依据。     

c-myc反义寡核苷酸对人恶性黑素瘤细胞c-myc mRNA表达及其蛋白水平的影响

目的研究c-myc反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤细胞c-myc mRNA表达及c-myc蛋白水平的影响。方法设空白和混杂链(SODN)对照,人工合成c-myc ASODN,以30μmol/L ASODN转染人恶性黑素瘤细胞株A375,分别用原位杂交、免疫组化SABC法检测c-myc mRNA的表达及其蛋白水平。结果转染24 h后,ASODN组细胞c-myc mRNA较空白对照组、SODN组均显著下调(P均<0.01);转染48 h后,与空白对照组、SODN组相比,ASODN组细胞的c-myc蛋白水平均显著下降(P均<0.01)。结论c-myc ASODN可下调A375细胞c-myc mRNA的表达和c-myc蛋白水平。     

银屑病皮损中VEGF、bFGF的表达及与微血管密度的相关性研究

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在银屑病患者皮损血管生成机制中的作用。方法采用免疫组化法检测寻常型银屑病患者皮损处VEGF、bFGF及微血管密度(MVD)的表达情况,并与正常皮肤进行比较分析。结果寻常型银屑病患者皮损处VEGF、bFGF的表达及MVD值明显高于正常对照组(P0.05),VEGF与bFGF在银屑病患者皮损中的表达差异有显著相关性(P0.05)。结论 VEGF及bFGF可能引起银屑病患者皮损处血管增生,VEGF与bFGF在银屑病微血管增生过程中发挥正性调节作用且具有协同促进性。     

乙酰肝素酶mRNA和蛋白在恶性黑素瘤皮损及A375细胞株中的表达

目的探讨乙酰肝素酶mRNA和蛋白在恶性黑素瘤皮损及A375细胞株中的表达及意义。方法选择恶性黑素瘤30例、黑素细胞痣30例、恶性黑素瘤A375细胞株及15例正常皮肤组织,分别采用原位杂交、免疫组化法检测皮损及细胞株中乙酰肝素酶mRNA及蛋白的表达。结果A375细胞株及19例(19/30,63.33%)恶性黑素瘤皮损中乙酰肝素酶mRNA呈阳性表达,2例(2/30,6.67%)黑素细胞痣皮损中乙酰肝素酶mRNA表达阳性,正常皮肤组织中无1例呈阳性表达;恶性黑素瘤皮损中乙酰肝素酶蛋白的阳性表达率与黑素细胞痣、与正常对照组相比,差异均有显著性意义(χ12=19.200,P=0.000;χ22=25.714,P=0.000)。乙酰肝素酶蛋白在恶性黑素瘤、恶性黑素瘤A375细胞株、黑素细胞痣及正常皮肤组织的表达情况与mRNA相一致。结论乙酰肝素酶mRNA和蛋白的高表达可能与恶性黑素瘤的发生发展有关,有望作为治疗黑素瘤的靶点。     

乙酰肝素酶和基质金属蛋白酶-9蛋白在皮肤黑素瘤中的表达

目的探讨乙酰肝素酶和基质金属蛋白酶-9蛋白在皮肤黑素瘤中的表达及其意义。方法应用免疫组化S-P法检测乙酰肝素酶和基质金属蛋白酶-9蛋白在皮肤黑素瘤30例、交界痣30例及15例正常皮肤组织中的表达。结果皮肤黑素瘤中乙酰肝素酶(63.3%)和基质金属蛋白酶-9蛋白(73.3%)的阳性表达率明显高于交界痣(6.6%)和正常对照组(0)(P均<0.05),交界痣与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论乙酰肝素酶和基质金属蛋白酶-9蛋白的高表达可能与皮肤黑素瘤的发生发展有关,有望作为治疗黑素瘤的靶点。     

MCL-1反义寡核苷酸转染恶性黑素瘤细胞的光镜和电镜观察

目的通过转染MCL-1反义寡核苷酸观察转染后细胞形态的变化,以研究MCL-1基因的功能。方法采用阳离子脂质体转染MCL-1反义寡核苷酸,以特异性阻断MCL-1表达。用光镜观察转染前后细胞显微结构变化及免疫细胞化学染色结果;以电镜观察转染前后细胞微观形态的变化。实验中设立正义序列寡核苷酸和无义序列寡核苷酸作为对照寡核苷酸。结果光镜下可见到转染后细胞变圆,胞内出现空泡。免疫组化结果显示细胞内阳性染色明显减少。电镜观察显示转染后细胞内出现空泡,细胞膜突起消失及出现凋亡细胞。结论MCL-1基因对恶性黑素瘤细胞形态有很大的影响。本研究为阐明MCL-1基因的功能提供了较好的形态学证据。     

bFGF及其受体FGFR2在银屑病皮损中的检测

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及其受体FGFR2蛋白在银屑病皮损中的表达状态。方法：采用组织切片免疫组化技术对22例银屑病皮损和19例正常人皮肤的bFGF及其受体FGFR2及血管内皮标记因子CD34的表达状态,并根据CD34染色计数微血管密度。结果：bFGF和FGFR2免疫组化阳性反应在寻常型进行期银屑病皮损的表皮基底层和棘层表达。显著高于正常皮肤（P〈0.01）;寻常型进行期银屑病皮损真皮浅层微血管密度显著高于正常人,该处微血管bFGF的表达也明显高于正常人（P〈0.01）,且与微血管密度（MVD）呈正相关,P〈0.01,而FGFR2在银屑病真皮浅层微血管和正常人则无显著性差异（P〉0.05）。结论：bFGF可能通过FGFR2作用在基底层和基底上层,对角质形成细胞的增殖、分化起一定作用,bFGF亦可能在银屑病真皮浅层微血管异常增殖中起一定的作用。     

强脉冲光对成纤维细胞及血管内皮细胞增殖活性及血管内皮细胞生长因子分泌水平的影响

目的:研究强脉冲光照射对皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞的生长增殖状态及两种细胞中血管内皮细胞生长因子(VEGF)分泌水平的影响。方法:分离培养原代成纤维细胞和复苏血管内皮细胞株(ECV034),分别采用波长为590～1200nm和520～1200nm的能量密度为29J/cm2强脉冲光照射上述培养细胞。在照射结束后1、12、24及48h,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖活性情况,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两种细胞培养上清液中VEGF的分泌情况。结果:成纤维细胞经强脉冲光照射24h及48h后,细胞增殖活性增强(P<0.05),而血管内皮细胞增殖活性无明显改变。强脉冲光照射对成纤维细胞及血管内皮细胞VEGF的分泌无影响。结论:强脉冲光能增强成纤维细胞增殖活性,但不影响成纤维细胞及血管内皮细胞VEGF的分泌。     

一氧化氮在血管内皮生长因子诱导恶性黑素瘤细胞增殖机制中的研究

目的　观察血管内皮生长因子 (VEGF)过度表达对恶性黑素瘤细胞株A3 75增殖的影响 ,研究一氧化氮在其中所起的作用 ,以明确VEGF的作用机制。方法　VEGF165cDNA经电穿孔转染A3 75细胞 ,经逆转录聚合酶链反应(RT PCR)、免疫酶联吸附实验 (ELISA)检测转染前后A3 75细胞VEGF的mRNA和蛋白表达 ,应用细胞计数和MTT法比较转染组和对照组A3 75细胞增殖能力和活性 ,用硝酸还原酶法检测A3 75细胞转染前后培养上清中一氧化氮含量 ,并应用一氧化氮合酶抑制剂N 硝基 L 精氨酸甲酯 (L NAME)观察A3 75细胞转染VEGF165cDNA后的增殖情况。结果　转染VEGF165cDNA后 48h、72h和 96hA3 75细胞VEGFmRNA分别为 0 .48± 0 .0 5 ,1.2 7± 0 .0 7,1.2 4± 0 .0 1,较转染前的 0 .2 4± 0 .0 5明显增加 (P <0 .0 5 ) ;VEGF蛋白表达和一氧化氮水平也呈相同的变化趋势 (P <0 .0 5 ) ;转染VEGF165cDNA后A3 75细胞增殖能力较未转染组明显增强 (P <0 .0 5 ) ;L NAME可剂量依赖性地抑制转染后的A3 75细胞增殖活性 (P <0 .0 1)。结论　内源性的一氧化氮在VEGF促进A3 75细胞增殖中起重要作用。     

Expression of angiogenic factors in neurofibromas

We studied the expression of angiogenic factors (vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, platelet-derived growth factor and hepatocyte growth factor) in cutaneous neurofibroma samples from patients with neurofibromatosis-1. Immunohistochemical staining and the reverse transcribed polymerase chain reaction (RT-PCR) method demonstrated that vascular endothelial and basic fibroblast growths factor are highly expressed in neurofibroma cells at both the protein and mRNA level. These data suggest that vascular endothelial and basic fibroblast growth factors may contribute to both the angiogenesis and hypervascularity of neurofibromas.     

组织工程皮肤分泌血管内皮细胞生长因子的初步研究

目的：研究组织工程皮肤培养液中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的分泌情况。方法：收集不同时相的单层成纤维细胞培养液、胶原凝胶真皮替代物（胶原凝胶DE）、胶原凝胶皮肤替代物（胶原凝胶SE）、复方壳多糖真皮替代物（复方壳多糖DE）、复方壳多糖皮肤替代物（复方壳多糖SE）培养液样本,双抗体夹心EUSA法测定其中VEGF分泌量。结果：成纤维细胞（FB）在三维培养时分泌的VEGF明显高于其单层培养时的分泌量。复方壳多糖组织工程皮肤VEGF的分泌量又高于胶原凝胶组织工程皮肤。大多数培养液中VEGF含量在48h内增长最快。结论：壳多糖组织工程真皮和皮肤能分泌较多的VEGF,有利于伤口的血管化,加速伤口愈合。     

A tissue-engineered endothelialized dermis to study the modulation of angiogenic and angiostatic molecules on capillary-like tube formation in vitro

BACKGROUND: Because angiogenesis is a major feature of different physiological and pathological situations, the identification of factors that stimulate or inhibit this process and the elucidation of their mechanisms of action are most certainly of clinical relevance. We have produced a new model of endothelialized reconstructed dermis that promotes the spontaneous formation of a human capillary-like network and its stabilization in vitro for a period longer than 1 month. OBJECTIVES: The aim of this work was to describe the three-dimensional structure of the capillary-like network. Thereafter we strove to study, quantitatively and qualitatively, the influence of angiogenic and angiostatic drugs on capillary-like tube (CLT) formation in vitro in the model. METHODS: The endothelialized dermis was prepared by coculturing two human cell types, dermal fibroblasts and umbilical vein endothelial cells, in a collagen sponge biomaterial. RESULTS: The visualization by confocal microscopy of the tubes present in the model showed that the endothelial structures were not cord-like but rather CLTs with well-defined lumina. Moreover, these tubes were organized in a complex network of branching structures. When angiogenic factors (vascular endothelial growth factor 10 ng mL-1 or basic fibroblast growth factor 10 ng mL-1) were added to the model, 1.8 and 1.4 times more capillaries, respectively, were observed, whereas the addition of progesterone (10 microg x mL(-1)) reduced by 2.4 times the number of tubes compared with the control. CONCLUSIONS: These results suggest that this model is a highly efficient assay for the screening of potentially angiogenic and angiostatic compounds.     

Early increase in serum levels of the angiogenesis-inhibitor endostatin and of basic fibroblast growth factor in melanoma patients during disease progression

BACKGROUND: Increased serum levels of angiogenesis-related factors such as endostatin, vascular endothelial cell growth factor (VEGF) or basic fibroblast growth factor (bFGF) have been demonstrated for a variety of solid and nonsolid tumours. Therefore, these factors have been suggested as diagnostic and in some studies as prognostic tumour markers. OBJECTIVES: The purpose of the present study was to investigate a possible correlation of endostatin, VEGF or bFGF serum levels with disease progression in melanoma. Especially, we compared these factors to the established melanoma marker S-100 B, which increases in advanced disease but often fails to indicate early metastatic spread to regional lymph nodes. PATIENTS AND METHODS: Sera from 197 melanoma patients and 35 healthy controls were measured by enzyme-linked immunosorbent assay; 72 patients had primary tumours (American Joint Committee on Cancer stages I and II), 55 had regional lymph node metastasis (stage III) and 70 patients had distant organ metastasis (stage IV). RESULTS: Endostatin, VEGF and bFGF serum levels were significantly elevated in stage IV disease, compared with the control group. In stage III, endostatin and bFGF, but not VEGF or S-100 B, were significantly increased. However, follow-up of this patient group did not show a correlation with the future clinical course including time until progression or overall survival, arguing against a role of endostatin, VEGF or bFGF as prognostic markers. CONCLUSIONS: These data indicate that endostatin or bFGF might be useful as diagnostic markers for the early detection of locoregional metastasis.     

银屑病患者血浆脑源性神经营养因子和VEGF的表达

目的:检测脑源性神经营养因子(BDNF)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)在寻常型银屑病(PV)患者血浆中的表达。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测23例进行期PV和19例稳定期PV患者血浆中BDNF及VEGF的表达,并以16名健康志愿者作对照。结果:PV患者血浆中BDNF及VEGF的表达均明显高于正常人(P0.01),进行期患者的表达高于稳定期患者(P0.01);BDNF的表达与PASI评分呈正相关(P0.01),VEGF的表达与PASI评分无明显相关性(P0.05)。结论:BDNF与VEGF可能参与了寻常型银屑病的发病机制。