聚羟基烷酸酯与绵羊骨髓基质干细胞相容性的研究

目的评价聚羟基烷酸酯(PHBV)作为组织工程支架与绵羊骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性。方法原代培养绵羊BMSCs,传至2～3代后,接种至PHBV膜和泡沫样三维支架上,光镜和扫描电镜观察细胞形态,计数1、2、6 h时的细胞黏附率;并以接种至培养板上细胞为对照组,每日细胞计数,绘制生长曲线;按培养液量与支架体积10 mL／cm3为标准浓度制备浸提液,并制备标准浓度1／16～16倍的浸提液,以MTT法检测细胞毒性;流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期,计算增殖指数;BMSCs接种于PHBV三维支架上4、8、12 d,以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量, BCA法测定蛋白质含量。结果第3代BMSCs接种至PHBV膜上2 h后即大部黏附,黏附率75．6％,与对照组相比差异无统计学意义,绘制生长曲线见细胞生长与对照组无差异;MTT法检测见9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级;光镜和扫描电镜观察见细胞接种于PHBV膜上2 h后大部分黏附,3 d后伸展良好,呈纺锤形或梭形,在三维支架的孔隙内立体生长,1周开始细胞间连接,3周广泛连接,分泌大量基质;流式细胞分析见接种于材料上的细胞周期无变化;接种至PHBV三维支架上的细胞内DNA、蛋白质浓度与对照组比较无差异。结论PHBV作为BMSCs的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性。     

新型生物可降解材料与骨髓间充质干细胞生物相容性研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)与第3代聚羟基烷酸酯(PHA)类聚酯:3-羟基丁酸、3-羟基己酸无规嵌段共聚物[p(3HB-co-3HH)]的生物相容性,以及材料植入体内的组织相容性. 方法将培养的人MSCs分别接种于细胞载体p(3HB-co-3HH)上,通过相差显微镜和电镜,以及HE、Von Kossa染色和Ⅰ型胶原表达等分析,了解细胞载体复合物体外立体培养2周、或裸鼠体内植入后经过培养的MSCs在支架材料上生长、扩增和分泌基质等与材料的相容性. 结果 p(3HB-co-3HH)具有良好的亲水性及细胞亲和力,材料表面不需特殊处理(如卵磷脂、多聚赖氨酸包埋等),可以作为种子细胞的载体,接种的MSCs能够在材料中均匀分布,贴壁生长良好,维持骨髓干细胞表型.在培养体系中加入成骨诱导分化试剂后,贴壁生长的MSCs可向成骨细胞分化并分泌基质,表达Ⅰ型胶原. 结论 p(3HB-co-3HH)具有良好的生物相容性和细胞亲和性,是较好的可降解的高分子生物材料.     

纳米组织工程骨与兔骨髓基质干细胞体外生物相容性的实验研究

目的探讨纳米组织工程骨(NHAC)与兔骨髓基质干细胞(RMSCs)体外生物相容性,为应用组织工程方法修复骨缺损提供依据。方法将RMSCs与NHAC体外复合培养,进行形态学和功能测定。结果骨髓基质干细胞能在纳米组织工程骨上良好地粘附、增殖、生长。细胞的活性和碱性磷酸酶活性未受到纳米组织工程骨的影响。结论NHAC具有良好的生物相容性,可作为骨组织工程理想的生物材料。     

脐带Wharton胶干细胞外基质的制备及其细胞相容性观察

[目的]建立制备脐带Wharton胶干细胞细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的方法并对其生物相容性进行观察。[方法]无菌条件下收集人脐带组织,采用酶消化法分离培养脐带干细胞,使用普通培养基培养7 d后,在原培养基中添加抗坏血酸,再连续培养8 d;加入含有0.5%Triton X-100和20 mM NH 4OH的PBS溶液进行脱细胞处理后,用Hoechst 33258染色观察其DNA残留,采用扫描电镜对其微结构进行观察,通过天狼星红、甲苯胺蓝、番红花O组织学染色和I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白及层粘连蛋白免疫荧光染色观察微载体的主要成分;将异体脐带干细胞种植在无细胞核DNA残留的ECM上,通过MTT法观察脐带干细胞的增殖生长情况。[结果]通过本实验方法得到的天然脱细胞脐带干细胞ECM,表面无细胞及DNA残留,整体表面有细胞陷窝形成,基质紧密连接。Hoechst 33258荧光染色阴性;天狼星红、甲苯胺蓝和番红花O组织学染色阳性;I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白免疫荧光染色阳性;在MTT检测细胞增殖中,种植于该ECM上的异体脐带干细胞组的OD值高于单纯平面培养组(P<0.05)。[结论]此次实验所得的脱细胞脐带干细胞外基质具有良好的生物相容性,能够为组织工程提供高质量的种子细胞,有望成为组织工程种子细胞的新型培养载体。     

生物可降解人工胸壁的生物相容性与体内降解研究

目的对制备的人工胸壁材料的生物相容性及体内降解情况进行研究,为其应用于临床提供实验依据。方法参照医疗器械生物学评价标准和要求,对人工胸壁组分材料聚对二氧环己酮(A)、壳聚糖(B)、羟基磷灰石/胶原海绵(C)进行评价。溶血实验另设生理盐水为阴性对照组,蒸馏水为阳性对照组,各组取样本5个加抗凝兔血0.2ml,取上清测吸光度(A)值并计算溶血率。取20只小鼠行急性全身毒性实验,每组5只,分为A、B、C和阴性对照组;阴性对照注入生理盐水,A、B、C组由尾静脉注入A、B、C材料浸提液,50ml/kg,于24、48、72h时观察。热源实验取12只大白兔,每组3只,分为A、B、C组和阴性对照组(注入生理盐水),自耳静脉分别注射A、B、C材料浸提液,10ml/kg后,每隔1h测肛温1次,共3次,观察动物的体温变化,并计算各兔体温的升高度数和升高总数。体内植入及降解实验取12只大白兔,将A、B、C材料(制成10mm×10mm大小)分别植入背部肌肉内,于2、4、8、12、16、24周各时间点处死2只,行大体观察,组织学、材料降解及组织相容性观察。结果人工胸壁各组分材料的溶血率均小于国家规定的5%标准,在体外不引起溶血反应;与阴性对照组比较无统计学意义(P>0.05);不引起全身毒性反应,各材料注入后,A、B、C组动物均无死亡,活动进食正常。热源实验各组动物体温升高值均在0.6℃以下,且每组3只兔体温升高值的总数<1.4℃,无致热作用;各材料植入体内初期有轻度炎性反应,随植入时间延长逐步减轻;组分材料分期降解吸收,降解过程中未见组织变性、坏死和异常增生。结论人工胸壁各组分材料具有良好的生物相容性和适宜的降解性能,具有临床开发应用前景。     

尿道种子细胞与生物可降解材料的生物相容性研究

目的 观察生物可降解材料聚β-羟基丁酸酯(PHB)与种子细胞即兔膀胱移行上皮细胞及平滑肌细胞间的生物相容性,探讨其作为种子细胞载体构建组织工程化尿道的可行性.方法 经过传代培养,分别在PHB与上皮细胞共同培养2、7 d,与平滑肌细胞共同培养1、5 d,每组各取6个样本,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况,并利用扫描电镜检测细胞在材料上的空间生长情况,评估移行上皮细胞和平滑肌细胞与聚β-羟基丁酸酯的生物相容性.结果 平滑肌细胞能够在该材料上正常生长,各组间A值差异无统计学意义(P>0.05);而移行上皮细胞在该材料上只有少量生长,且实验组与对照组间A值差异有统计学意义(P<0.05),而A、B两实验组间A值差异无统计学意义(P>0.05).结论 聚β-羟基丁酸酯与平滑肌细胞具有良好的生物相容性,但其对移行上皮细胞的生长具有一定的抑制作用,生物相容性不甚理想.     

人脂肪来源干细胞与左旋聚乳酸/聚己内酯支架的体内外生物相容性研究

目的观察人脂肪来源干细胞(Human adipose-derived stem cells,hADSCs)在左旋聚乳酸/聚己内酯(Poly-Llactide/Polycaprolactone,PLLA/PCL)复合支架材料中的生长情况及其生物相容性。方法体外分离、培养和扩增hADSCs,制备PLLA/PCL复合支架。取PLLA/PCL浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架的细胞毒性。hADSCs传代扩增后,接种到PLLA/PCL支架材料上。体外培养1周,裸鼠皮下分别培养1周、2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况。免疫荧光检测裸鼠体内复合支架材料内细胞平滑肌肌动蛋白(Smooth muscle actin,SMA)表达情况。结果hADSCs在PLLA/PCL浸提液中可保持较高的增殖率,表明PLLA/PCL浸提液无细胞毒性。hADSCs接种于PLLA/PCL支架上,经体外、体内培养后,均能长入PLLA/PCL支架的孔隙内,且体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架内部。经体内培养后,复合细胞的支架比单纯支架有更多的细胞渗入支架内部。细胞材料复合物体内培养2周后,免疫荧光检测发现,支架材料内部分细胞SMA表达阳性。结论 PLLA/PCL复合支架材料,安全无毒,与hADSCs生物相容性好,可作为种子细胞的载体用于组织工程膀胱缺损修复的研究。     

纳米P(LLA-b-CL)与犬关节软骨细胞体外生物相容性实验研究

[目的] 研究具有纳米结构二嵌段共聚物左旋聚乳酸/聚已内酯(PLLA-b-PCL)与犬关节软骨细胞的体外生物相容性,探讨其作为软骨组织工程支架的可行性.[方法] 开环聚合制备PLLA-b-PCL,液-液相分离制备PLLA-b-PCL纳米支架,扫描电镜观察材料结构:分离培养犬膝关节软骨细胞,取第3代软骨细胞接种于PLLA-b-PCL膜进行复合二维培养,MTT法检测细胞毒性;通过倒置显微镜、Hoechst33342荧光法观察细胞的形态与粘附状况;另取第3代软骨细胞与纳米PLLA-b-PCL(实验组)、PLLA-b-PCL(对照组)支架材料上进行三维培养3周,扫描电镜观察软骨细胞的形态、粘附、生长状况,Hoechst33258荧光法检测复合物中细胞DNA含量、BCA法测定蛋白质含量.[结果] PLLA-b-PCL无细胞毒性,软骨细胞在纳米PLLA-b-PCL支架上粘附、增殖良好,随时间延长软骨细胞在支架材料上DNA和蛋白质含量逐渐增加,DNA和蛋白质含量均明显高于对照组(P<0.05).[结论] PLLA-b-PCL纳米支架能为软骨细胞的生长分化提供较好的环境,具有良好的生物相容性,有望成为一种较好的软骨组织工程支架材料.     

聚(丙交酯-co-乙交酯)仿生基质材料的制备

目的　将能与细胞表面整合素受体特异性结合的多肽共价结合于改性聚 (丙交酯 co 乙交酯 ) (PLGA)材料上 ,以提高材料对骨组织工程种子细胞的黏附能力。方法　用固相合成法合成 [K] 16 GRGDSPC多肽并鉴定 ;取 1g/L多肽溶液与已用交联剂预处理的改性PLGA材料室温下反应 ,用X射线光电子光谱法 (XPS)表征。结果　PLGA改性后引入了含活性基团的氨基酸序列 ,所合成的多肽序列为 [K] 16 GRGDSPC ,纯度达 95 %以上 ;XPS检测表明多肽成功地固定于PLGA多孔基质材料上。结论　在PLGA基质材料上固定 [K] 16 GRGDSPC多肽 ,为实现对骨组织工程种子细胞的高效黏附奠定了基础。     

人脂肪来源干细胞与聚己内酯/壳聚糖支架的生物相容性研究

目的观察人脂肪来源干细胞（Human adipose derived stem cells,hADSCs）在聚己内酯/壳聚糖[Poly（ε-capro-lactone）/chitosan,PCL/CS]支架中的生长情况。方法取PCL/CS浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架细胞毒性。hADSCs传代扩增后,接种到PCL/CS支架上,体外培养1周、2周,裸鼠体内培养2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况,免疫组化HLA-Ⅰ监测经裸鼠体内培养后复合支架上细胞的种属来源。结果 hADSCs在PCL/CS浸提液中可保持较高的增殖率,PCL/CS浸提液无细胞毒性。hADSCs终止于PCL/CS支架后,经过体外、内培养,hADSCs均能长入支架的空隙内,且体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架。体外培养1周,已有细胞黏附生长在PCL/CS支架的边缘,体外培养2周后,部分细胞渗透到材料内部。体内培养2周后,大量细胞能渗透到材料内部,同时HLA-Ⅰ抗体检测发现,支架材料内部分细胞HLA-Ⅰ阳性表达,说明PCL/CS支架内该部分的细胞来源于hADSCs。结论 PCL/CS支架安全无毒,hADSCs能在PCL/CS支架上较好生长,该支架可用于组织工程膀胱的研究。     

Transplanted skin-derived precursor stem cells generate enteric ganglion-like structures in vivo

Introduction

Hirschsprung’s disease is characterized by a developmental arrest of neural crest cell migration, causing distal aganglionosis. Transplanted cells derived from the neural crest may regenerate enteric ganglia in this condition. We investigated the potential of skin-derived precursor cells (SKPs) to engraft and to differentiate into enteric ganglia in aganglionic rat intestine in vivo.

Methods

Adult Lewis rat jejunal segments were separated from intestinal continuity and treated with benzalkonium chloride to induce aganglionosis. Ganglia were identified via immunohistochemical stains for S100 and β-III tubulin (TUJ1). SKPs were procured from neonatal Lewis rats expressing enhanced green fluorescent protein (GFP) and cultured in neuroglial-selective media. SKP cell line expansion was quantified, and immunophenotypes were assessed by immunocytochemistry. Aganglionic segments underwent SKP transplantation 21–79 days after benzalkonium chloride treatment. The presence of GFP + cells, mature neurons, and mature glia was evaluated at posttransplant days 1, 6, and 9.

Results

Benzalkonium chloride-induced aganglionosis persisted for at least 85 days. Prior to differentiation, SKPs expressed S100, denoting neural crest lineage, and nestin, a marker of neuronal precursors. Differentiated SKPs in vitro expressed GFAP, a marker of glial differentiation, as well as TUJ1 and several enteric neurotransmitters. After transplantation, GFP + structures resembling ganglia were identified between longitudinal and circular smooth muscle layers.

Conclusion

SKPs are capable of engraftment, migration, and differentiation within aganglionic rodent intestine in vivo. Differentiated SKPs generate structures that resemble enteric ganglia. Our observations suggest that SKPs represent a potential gangliogenic therapeutic agent for Hirschsprung’s disease.     

血管细胞外基质和膀胱平滑肌细胞的生物相容性研究

目的探讨血管细胞外基质(VECM)和膀胱平滑肌细胞的细胞相容性和组织相容性,为临床应用提供依据。方法制备兔VECM,分离培养兔膀胱平滑肌细胞,并以1×10~6个细胞/ml种植于VECM上,相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附及生长。制备VECM和乳胶的提取液,分别作为实验组和阳性对照组,以培养基为阴性对照组,以无细胞的单纯培养基作为空白对照组。取2～4代对数生长期的膀胱平滑肌细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定VECM浸提液对培养平滑肌细胞的细胞毒性；将VECM植入异体兔皮下,观察其组织相容性。结果兔膀胱平滑肌细胞能在体外培养扩增；接种1h后已有部分细胞黏附于VECM上,随时间推移,细胞逐渐增多,并伸展成梭形；培养第1、3、5天,实验组细胞增殖率分别为95．61%、98．34%、102．91%；阴性对照组为100．00%；阳性对照组分别为35．14%、38,95%、32．66%；实验组细胞增殖率明显高于阳性对照组,差异有统计学意义(P＜0．01),与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0．05)。动物皮下埋植实验无排斥反应发生。结论VECM具有良好的生物相容性,是一种较好的泌尿道修复支架材料。     

可注射性纳米组织工程骨的生物相容性

目的 以可注射性纳米材料与共培养的成骨细胞和血管内皮细胞复合,构建可注射性组织工程骨,并观察其体外实验的生物相容性.方法 将共培养的成骨细胞和血管内皮细胞与可注射性纳米材料体外复合培养,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,并行激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察,进行形态学和功能测定.结果 细胞复合材料后保持正常的分裂增殖速度,细胞的ALP活性与单纯细胞培养的对照组差异无统计学意义(P>0.05).激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察可见,细胞能在可注射性纳米材料上良好地增殖、生长,细胞的活性未受到材料的影响.结论 可注射性纳米材料具有良好的细胞相容性,可作为骨组织工程可注射性载体材料.     

骨髓基质细胞与两种不同载体材料生物相容性的实验研究

目的 :采用体外细胞培养法对 2种不同生物材料 (胶原海绵和PLGA )的生物相容性进行研究 ,探讨它们作为软骨组织工程载体材料的可行性。方法 :取 2个月龄新西兰兔 ,麻醉后在无菌条件下自双侧股骨粗隆处用 16号穿刺针抽取骨髓 4～ 6ml,用D -Hanks液洗涤离心 2遍 ( 10 0 0rpm× 10min) ,悬浮于含 10 %FBS的DMEM培养液中 ,行原代及传代培养 ,将传代细胞以 1 5× 10 4/孔定量接种于 2 4孔培养板 ,每孔加DMEM培养液 1ml。实验分为 3组 ,即PLGA组、胶原海绵组和对照组 ,其中PLGA组、胶原海绵组分别加入直径 5mm ,厚度 2mm大小的材料 ,对照组单纯接种细胞 ,于不同时间进行处理 ,用于相差显微镜及扫描电镜观察 ,绘制生长曲线 ,流式细胞仪检测。结果 :骨髓基质细胞可以在胶原海绵和PLGA周围生长 ,逐渐粘附 ,并在其表面连接成片 ,分泌细胞外基质 ;对照组与实验组、各实验组之间生长曲线相近 ,统计学分析无显著性差异 ;流式细胞仪 (FCM )检测发现 2种材料对细胞周期无影响 ,未发现异倍体细胞。结论 :胶原海绵和PLGA对兔MSC的形态学、细胞生长增殖、细胞周期、DNA含量及倍体水平均无影响 ,2种生物材料具有良好的生物相容性 ,可作为软骨组织工程的载体材料安全应用。     

淋巴管内皮细胞与PGA的相容性研究

目的研究人淋巴管内皮细胞(Lymphatic endothelial cells,LEC)与可吸收生物材料聚羟基乙酸(Polyglycolic acids,PGA)的相容性,为组织工程化淋巴管的构建奠定基础。方法采用免疫磁珠分离法,从幼儿包皮组织中分离出LEC,扩增至第3代,与PGA混合培养,形成细胞-生物材料复合物。每两天换液1次,观察细胞形态和黏附生长状况。体外培养1周后,行电镜观察和RT-PCR检测。结果复合物体外培养1周后,LEC黏附在PGA支架上,细胞分泌大量基质。RT-PCR提示Podoplanin、LYVE-1、VEGFR-3和Prox-1均呈阳性表达,LEC表型未发生改变。结论 LEC与PGA有良好的细胞相容性,PGA可作为组织工程化淋巴管构建的支架材料。     

小肠粘膜下层组织工程支架材料的生物相容性研究

目的 观察小肠粘膜下层(SIS)的生物相容性和作为组织工程支架材料的可行性.方法 参照国际标准ISO10993-1制定的医疗器械生物学评价的相关方法和标准,通过细胞毒性试验、热原试验、溶血试验、致敏试验、肌肉刺激试验等体内外生物学实验相结合的方法评价SIS的生物相容性及免疫原性.结果 实验证明小肠粘膜下层细胞相容性良好,不溶血,无致热、致敏反应,肌肉刺激试验的组织学检查见SIS周围无明显炎症及排斥反应,材料部分降解并见大量结缔组织生长.结论 SIS具有良好的生物相容性和免疫原性,可作为组织工程的支架材料.     

Cytocompatibility of porous biphasic calcium phosphate granules with human mesenchymal cells by a multiparametric assay

This work aims to evaluate the cytocompatibility of injectable and moldable restorative biomaterials based on granules of dense or porous biphasic calcium phosphates (BCPs) with human primary mesenchymal cells, in order to validate them as tools for stem cell‐induced bone regeneration. Porous hydroxyapatite (HA) and HA/beta‐tricalcium phosphate (β‐TCP) (60:40) granules were obtained by the addition of wax spheres and pressing at 20 MPa, while dense materials were compacted by pressing at 100 MPa, followed by thermal treatment (1100°C), grinding, and sieving. Extracts were prepared by 24‐h incubation of granules on culture media, with subsequent exposition of human primary mesenchymal cells. Three different cell viability parameters were evaluated on the same samples. Scanning electron microscopy analysis of the granules revealed distinct dense and porous surfaces. After cell exposition to extracts, no significant differences on mitochondrial activity (2,3‐bis(2‐methoxy‐4‐nitro‐5‐sulfophenly)‐5‐[(phenylamino) carbonyl]‐2H‐tetrazolium hydroxide) or cell density (Crystal Violet Dye Elution) were observed among groups. However, Neutral Red assay revealed that dense materials extracts induced lower levels of total viable cells to porous HA/β‐TCP (P < 0.01). Calcium ion content was also significantly lower on the extracts of dense samples. Porogenic treatments on BCP composites do not affect cytocompatibility, as measured by three different parameters, indicating that these ceramics are well suited for further studies on future bioengineering applications.     

自制脱蛋白骨与骨髓基质细胞的生物相容性研究

目的 探讨表面脱钙的脱蛋白异体骨与骨髓基质细胞的生物柑容性，为骨组织工程提供合适的支架材料。方法 用经物理与化学方法处理而制得的脱蛋白骨与骨髓基质细胞（MSCs)复合培养，进行形态学观察、细胞增殖、ALP的活性、骨钙素的分泌与蛋白质含量检测；扫描电镜观察细胞在脱蛋白骨材料上的情况。结果 骨髓基质细胞能在脱蛋白骨上贴附、增殖，其生长及功能不受影响。结论 本方法所制的脱蛋白骨与MSCs具有良好的生物相容性，可作为MSCs的载体应用于骨组织工程。