临床微生物检测中荧光定量PCR技术的应用研究

目的探讨在临床微生物检测中应用荧光定量PCR技术的临床价值。方法选择2018年5月-2019年6月收治100例患者作为研究对象,观察采集标本在临床微生物检测中应用荧光定量PCR技术的检测结果。结果 60例粪便标本中,检出沙门菌20株,检出率为33.33%,副溶血性弧菌12株,检出率为20.00%,肠出血性大肠杆菌O157:H7 5株,检出率为8.33%;在40例脓液标本中,检出金黄色葡萄球菌7株,检出率为17.50%,化脓性链球菌5株,检出率为12.50%;在临床微生物检测中,荧光定量PCR技术具有较高的敏感度与特异性。结论临床微生物检测中应用荧光定量PCR技术的检测结果较好,具有精确定量、敏感度好、特异性高等优点,值得临床广泛推广应用。     

基因芯片技术直接检测常见腹泻病致病菌的应用研究

目的 探讨基因芯片技术在腹泻病粪便标本常见致病菌检测中的应用.方法 筛选7种常见腹泻病致病菌的特异基因作为检测目的 基因,分别为志贺菌ipaH基因、沙门菌hilA基因、副溶血弧菌tdh基因、空肠弯曲菌FlaA基因、肠出血性大肠埃希菌stxA2基因、肠产毒性大肠埃希菌st基因、霍乱弧菌ctxA2基因.设计相应的引物及探针,制备寡核苷酸芯片.对多重PCR扩增条件进行优化,将PCR扩增产物与带有7种特异探针的基因芯片杂交.检测标准菌株25株,模拟粪标本及临床腹泻病粪便标本64份.结果 经优化多重PCR扩增出7种腹泻病致病菌特异的致病基因片段,与基因芯片特异的探针杂交后.全部产生特异性杂交信号.标准菌株及模拟粪标本检测的阳性和阴性对照符合率均为100%.单一菌株最低检测量为10～100cfu/ml.64份腹泻病粪便标本检测出45份致病菌,其中33份志贺菌、12份副溶血弧菌,检出率为70.3%(45/64).粪培养检出 16份志贺菌,6份副溶血弧菌.检出率为34.4%(22/64),基因芯片法明显优于粪培养方法(P<0.01).结论 该基因芯片直接检测腹泻病致病菌,检出率高,达到了高效的检测目的 ,具有较好的实用性.     

甲型流感病毒两种快速检测方法的诊断效能评价

目的评价甲型流感病毒两种快速检测方法的临床诊断效能。方法分别采用化学显色法和荧光法检测流感样病例咽拭子标本377例,同时采用实时荧光定量PCR进行验证,以评价两种方法的临床诊断效能。结果化学显色法与荧光法检测的灵敏度分别为79.08%和90.2%,特异性分别为91.96%和95.09%,两种方法对甲型流感病毒的检出率相仿,其差异没有统计学意义（χ2=1.25,P〉0.05）,总符合率为78.78%。结论与PCR方法比较,两种方法均具有较好的临床应用价值,其中荧光法灵敏度更高,更适于临床快速诊断;化学显色法操作简便,不需特殊仪器,适用于较大样本量的筛查和现场检测。     

PCR技术检测结核杆菌DNA临床分析

应用聚合酶链反应(PCR)技术对我院1993年结核科住院、门诊384份痰标本和29份胸水标本予以检测,并与集菌涂片抗酸染色法进行比较.阳性率分别高出16.93%和24.14%.两种方法比较差异显著(P<0.05).充分显示了PCR技术具有迅速、敏感、特异的优点,肯定了PCR技术在结核病防治工作中的价值.     

毛细管PCR检测HBV-DNA的临床应用

目的　建立一种特异性强、敏感性高的检测HBV-DNA的毛细管PCR诊断技术。方法　用新建立的毛细血管PCR检测92例感染HBV的患者血清标本及8例非肝病患者血清标本。结果　HBsAg及HBeAg同时阳性的病人血清中HBV-DNA的检出率100％,而HBsAg阳性、HBeAg阴性病人血清中HBV-DNA的检出率为34.8％,8例非肝病患者血清中HBV-DNA的检出率为12.5％。若操作20份标本,可在2h内报告结果。结论　采用毛细管PCR检测血清HBV-DNA具有快速、敏感、准确及操作简便等优点,适用于临床检验。     

我国北方部分地区土拉弗菌感染宿主动物的分子流行病学研究

目的：了解我国北方部分地区宿主动物感染土拉弗菌状况和基因型别.方法：鼠夹诱捕鼠,从鼠脾组织提取DNA,应用巢式PCR检测土拉弗菌,计算并比较各地区及各鼠种阳性率.阳性标本用型特异性引物及短串联重复序列（SSTR9、SSTR16）引物扩增两区域并测序,用ClustalX（5.0）和DNA Club软件对序列进行比较分析.结果：共捕获鼠421只,分属14种鼠种,其中7个鼠种20份标本PCR检测阳性,总阳性率为4.75%.吉林、新疆、黑龙江、内蒙古和浙江的阳性率分别为11.65%,10.00%,6.54%,1.76%和0%.地区间阳性率差异显著（χ^2 = 20.90,P = 0.0003）;不同鼠种间阳性率未见差异（χ^2 =11.82,P = 0.066）.对20份扩增阳性标本进行型特异性扩增及SSTR9、SSTR16序列测定并对比分析,结果显示均为土拉弗菌B亚型,但型内差别较大,标本及菌株相互比较均显示基因多态性程度高且地区间有交叉.结论：我国北方部分地区可能依然存在B亚型土拉弗菌型感染（宿主动物）情况,且其基因型内差异较大.     

3TP法与ELISA法检测梅毒螺旋体抗体价值的比较

目的对3TP法与ELISA方法在梅毒螺旋体抗体检测能力及其在临床应用中的价值进行比较。方法应用3TP法与ELISA方法分别对85份确诊病例与体检正常TPHA方法确证为梅毒特异性抗体阴性的人员血清180份进行同时检测,检测结果进行χ2统计分析。结果总计265份标本检测3TP法阳性符合率100%,假阳性2例,灵敏度为100%,特异度98.9%;ELISA方法阳性符合率98.8%,假阴性1例,假阳性2例,灵敏度为98.8%,特异度为98.9%。两种方法间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 3TP法与ELISA方法均具有高灵敏度、高特异度的特点,二者之间无统计学差异(P>0.05),3TP法可以替代现行的梅毒血清学筛检的ELISA方法;3TP法适用于自动生化分析仪,具有简便、快速的优势,可实现对血清梅毒抗体的定量检测,便于疗效和预后观察。     

两种方法检测乙肝HBsAg效果对比

目的 :考察胶体金联免疫吸附与酶联免疫吸附试验的灵敏度与特异性。方法 :用乙肝表面抗原胶体金联免疫吸附试剂 (GCISA)和酶联免疫试剂 (ELISA)检测各种肝炎病人血清 90 9份 ,正常人血清 173份及乙肝表面抗原质控标准品。结果 :GCISA和ELISA分别检出 773和 770份阳性样品 ,总符合率为97 0 %。检测乙肝表面抗原质控标准品 ,GCISA的灵敏度为 1ng/ml,ELISA为 1～ 2ng/ml,且两种方法都只与HBsAg有特异反应 ,与乙肝病毒核心抗原、e抗原无交叉反应。结论 :GCISA检测血清中的HBsAg特异性强 ,灵敏度与ELISA一致 ,在检测单份样品时较ELISA简单快速 ,观察结果直观 ,不需仪器设备。     

T细胞斑点实验与结核杆菌DNA检测对肠结核的诊断价值

目的 探讨结核杆菌T细胞斑点实验（T-spot-TB）与结核杆菌DNA检测在肠结核诊断中的应用价值.方法 对2009年6月～2013年4月我科行T-spot-TB与结核杆菌DNA检测的可疑肠结核患者128例进行回顾性分析,其中确诊肠结核72例,非肠结核56例.对比分析两种方法诊断肠结核的灵敏度及特异度.结果 T-spot-TB诊断肠结核灵敏度为90.3％,特异性为91.1％;结核杆菌DNA检测灵敏度为73.6％,特异性为100.0％.T-spot-TB诊断肠结核灵敏度高于DNA检测,但其特异性低于DNA检测;两种方法检测阳性率在不同病理表现的肠结核患者中无显著差异.两种方法同时检测的阳性预测值及阴性预测值均为100％.结论 T-spot-TB与结核杆菌DNA联合检测有助于提高肠结核诊断的灵敏度和特异度.     

烧伤感染病原菌的DNA微阵列检测研究

目的观察DNA微阵列检测烧伤感染病原菌的灵敏度和特异度。方法分别采用DNA微阵列法和常规培养分离鉴定法对不同含菌量的菌液进行检测,比较二者鉴定病原菌的灵敏度;采用微阵列法检测经常规方法鉴定明确的烧伤感染病原菌62株,观察二者的阳性符合率和阴性符合率;采用上述两种方法检测103份烧伤创面分泌物标本,观察其符合率。结果与常规方法相比,DNA微阵列检测烧伤创面细菌具有快捷、高通量的优势,鉴定单一菌株的灵敏度比常规方法高10~100倍,鉴定已知菌株与常规方法的阳性符合率和阴性符合率均为100%;在检测103份烧伤创面分泌物时,DNA微阵列除鉴定出常规方法鉴定出的所有菌株外,还检出了一些常规方法未检出的菌株。结论与常规方法相比,DNA微阵列检测烧伤感染常见病原菌的符合率和灵敏度均达到较高水平,具有良好的临床应用前景。     

乳胶凝集试验检测肠道弯曲菌的临床价值研究

目的：探讨采用乳胶凝集试验检测肠道弯曲菌的临床价值。方法：对临床送检的373份粪便标本,先采用乳胶凝集试验直接检测,再将标本经48 h培养后的培养物采用传统方法进行鉴定,重点分析乳胶凝集试验直接检测的准确度、敏感度及特异性。结果：粪便标本直接检测结果与培养后鉴定结果比较,判定直接检测真阳性59例,假阳性2例,真阴性298例,假阴性14例;直接检测法准确度为95.7%,敏感度为80.8%,特异性为99.3%,阳性结果预示值为96.7%,阴性结果预示值为95.5%。结论：采用乳胶凝集试验直接检测肠道弯曲菌的临床应用价值较高。     

梅毒螺旋体抗体三种检测方法的价值比较

目的比较三种血清梅毒螺旋体抗体(TPHA)检测方法,优选一种简便、准确的TPHA检测方法。方法采用临床上常用的胶体金法、酶联免疫吸附试验法(ELISA法)、化学发光微粒子免疫分析法(CMIA法)对400例标本进行TPHA检测,分别计算ELISA法、CMIA法、胶体金法检测结果的阳性率、灵敏度和特异度。结果 CMIA法检测TPHA的阳性率、灵敏度和特异度分别为74.50%、99.67%和100%;胶体金法的阳性率、灵敏度和特异度分别为41.25%、55.18%和100%;ELISA法的阳性率、灵敏度和特异度分别为60.25%、80.60%和93.46%。CMIA法检测阳性率和敏感性明显高于ELISA法和胶体金法(P<0.05),而特异性高于ELISA法(P<0.05)。结论CMIA法检测TPHA特异性强、灵敏度高,具有很高的临床应用价值。     

霍乱弧菌O139实时荧光PCR检测方法的建立及应用

目的：建立检测霍乱弧菌O139的实时荧光PCR检测方法，为霍乱弧菌0139的检测提供快速、敏感、特异的检测手段。方法：用复合探针法荧光PCR检测技术，检测0139特异基因——编码糖基转移酶的基因。结果：本方法特异性好，检测非0139肠道菌均无响应；灵敏度高，可检测低至10CFU的细菌；重复性较好，批间批内变异系数均小于3％。对采自浙江省0139霍乱弧菌感染患者的335份标本进行检测，共有133份为阳性，而采用常规细菌培养法，仅检测出90份阳性。结论：本方法的建立为霍乱的诊断提供了又一有效手段。     

PCR-反相杂交法检测沙门氏菌invA、invE基因

目的：探讨从血液中早期检出伤寒沙门氏菌病原体的方法。方法：选择沙门氏菌属中的ｉｎｖＡ ｉｎｖＥ,采用ＰＣＲ扩增－反相杂交法及电泳法同时对血培养物中的伤寒沙门氏菌进行对比检测。结果：电泳法６ｈ检出８份,检出率８０％。８ｈ、１０ｈ可将１０份全部检出,检出率为１００％。反相杂交法４ｈ有３份阳性,阳性率为３０％,６ｈ有９份出现阳性反应,阳性率为９０％,８ｈ、１０ｈ可将１０份全部检出,阳性率为１００％。临床标本中电泳法１２／１６阳性,阳性率７５％,ＰＣＲ－反相杂交法阳性１４／１６,阳性率８７．５％。结论：反相杂交法具有敏感性高、特异性好等优点,对伤寒的早期快速诊断及治疗有重要意义。     

多重PCR和纳米孔测序结合检测消化道病原体方法及其评价

目的 建立多重PCR和纳米孔测序相结合的检测方法,为实现消化道病原体现场高灵敏度快速检测奠定基础。方法 通过设计消化道病原体特异性引物,验证引物特异性,优化多重PCR扩增条件,构建快速建库测序体系,对病原体的检测灵敏度进行评价。结果 建立的12种消化道病原体多重PCR检测体系可以对所有靶序列进行有效扩增。经测序检测,当引物池中每条引物浓度为0.1μmol/L时,12种病原体混合DNA模板和3种轮状病毒A、B、C的混合RNA样品检测灵敏度均可达到10³拷贝/ml。结论 该方法可在短时间内完成消化道病原体的鉴定,提升突发公共卫生事件中现场病原体检测效率,有望在疫情防控中发挥重要作用。     

血液微生物培养瓶进行无菌体液培养在基层医院的应用

目的：探讨血液微生物培养瓶在基层医院进行无菌体液培养的应用。方法 收集我院2021年7月～2022年6月100份无菌体液标本,通过血液微生物培养瓶法和直接平皿接种法并进行病原菌分离、鉴定,血液微生物培养瓶法使用Bact/Alert 3D 120全自动血培养仪进行检测,通过对两种方法学进行评价分析,选择更加适用于基层医疗机构的无菌体液培养方法。结果：100份无菌体液标本中,通过血液微生物培养瓶法培养阳性率为16%;直接平皿接种法阳性率为7%,差异有统计学意义（P<0.01）。血液微生物培养瓶增菌后100%细菌在1d内阳性预警,转种平皿同时可以通知临床经验用药,直接平皿接种法57.14%细菌在1d内生长并做菌株鉴定,直接平皿接种法检出病原菌所需时间更短。结论 血液微生物培养瓶法与直接平皿接种法相比更能规避送检环境影响,全自动血培养仪器能实时监控,及时进行阳性预警,灵敏度更高,能有效提高病原菌检出率,直接平皿接种法检出病原菌所需时间更短,临床实际工作中可以将两种方法结合使用。     

肺泡灌洗液联合肺组织PCR方法检测结核杆菌DNA对肺结核早期诊断的意义

目的探讨肺泡灌洗液(BALF)联合肺组织聚合酶链反应(PCR)方法检测结核杆菌DNA对肺结核早期诊断的意义。方法对104例结核杆菌痰阳性和确诊肺结核的痰菌阴性患者经纤维支气管镜采集BALF及活检肺组织进行石蜡包埋,对标本采用PCR方法检测结核杆菌DNA。结果 104例患者BALF中PCR检测结核杆菌DNA阳性92例,阳性率为88.46%;肺组织石蜡包埋检测结核杆菌DNA阳性98例,阳性率为94.23%。两组阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BALF联合肺组织PCR方法检测结核杆菌DNA有较高的敏感性及特异性,对肺结核病的早期诊断有重要临床意义。     

几种性传播疾病病原体检测芯片的制备

目的 :为了同时多样本检测和鉴别淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体和解脲脲支原体 3种重要的性传播疾病病原体 ,制备了寡核苷酸检测芯片。方法 :针对 3种病原体和荧光素酶基因设计特异的引物和寡核苷酸探针 ,采用硫代和氨基双功能探针修饰技术制备寡核苷酸芯片 ,以荧光标记多重不对称PCR技术为基础 ,通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对性传播疾病病原体的检测。结果 :对 10种与待检病原体无关的菌及定量有限稀释的荧光素酶和 3种病原体基因质粒模板进行芯片检测 ,结果表明芯片对待检病原体特异 ,其检测 4种基因的灵敏度均为 5×10 3 拷贝质粒。对 2 4份性传播疾病患者标本进行芯片检测 ,沙眼衣原体感染率为 10 0 % ,与淋病奈瑟球菌混合感染率为 83.3% (2 0 / 2 4 ) ,与传统PCR诊断结果完全一致。在 2 4份标本中 ,淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体和解脲脲支原体三重感染病例芯片诊断为 3例 ,混合感染率为 12 .5 % (3/ 2 4 ) ;而传统PCR诊断为 4例 ,混合感染率为 16 .7% (4/2 4 ) ,两种方法的符合率为 75 %。结论 :该芯片是一种可靠检测 3种病原体的方法 ,它可快速提供有关患者混合感染的情况 ,因而为指导个性化治疗提供及时可靠的诊断依据。     

成人呼吸道感染患者病毒病原学分布特征

目的 研究门诊发热伴呼吸道症候群患者呼吸道病毒病原学分布,提高呼吸道感染病原的快速诊断能力.方法 收集2015年9月至2016年8月军事医学科学院附属医院门诊277例呼吸道感染患者的咽拭子标本,采用荧光定量PCR方法对流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、偏肺病毒、腺病毒、博卡病毒和鼻病毒8种呼吸道病毒及其亚型进行核酸检测.结果 在277份标本中,138份病毒阳性,检出率为49.82%;在阳性标本中,流感病毒检出率最高,以甲型流感病毒为主,其次为乙型流感病毒,鼻病毒和副流感病毒Ⅲ型位居第3;4份标本检出两种呼吸道病毒混合感染,以乙型流感病毒混合感染为主;不同性别的呼吸道病毒检出率无差异(P>0.05);与夏秋季比较,冬春季病毒检出率有统计学意义(P<0.05).流感病毒是冬春季门诊发热伴呼吸道症候群的主要病原体,其他依次为副流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、腺病毒和偏肺病毒.荧光定量PCR可快速明确此类患者的病毒病原学诊断.     

多种食源性致病菌的基因芯片检测技术

目的探讨随机PCR结合基因芯片技术用于多种食源性致病菌筛查检测的可行性。方法利用Clustal X和Oligo 6.0软件设计探针,进行生物信息学比对验证特异性,探针末端修饰后合成并制备基因芯片。使用锚定随机引物扩增细菌基因组DNA,偶联荧光染料的扩增产物与芯片杂交后扫描检测。对随机PCR及杂交反应等一系列检测条件进行优化。选取16种病原细菌进行芯片特异性验证,使用4种食源性致病菌DNA进行芯片灵敏度检测及重复性评价,制备细菌DNA混合样本和痢疾志贺菌模拟水污染样本对芯片检测效能进行初步考核。结果 9种食源性致病菌获得阳性结果,基因组DNA检测灵敏度102～103pg/μl,芯片重复性变异系数(CV)值<15%,混合样本检测与预期结果一致,最低可检测水样本中痢疾志贺菌的最低浓度为3.54×105cfu/ml。结论初步建立的基于随机引物PCR的基因芯片技术进行多种食源性致病菌检测的方法,为病原细菌高通量筛查检测提供了一种新的思路。