霍山石斛及相似种的位点特异性PCR鉴别

目的设计出霍山石斛的位点特异性鉴别引物,仅通过PCR就能对霍山石斛的真伪进行准确鉴别。方法利用石斛属植物基因库中rDNA ITS序列数据库进行同源性比较,在与霍山石斛差异较大的区段设计1对特异性引物,然后对19份石斛属植物DNA模板进行PCR扩增,阳性者即为霍山石斛正品。结果发现在退火温度为60℃时,该引物能把霍山石斛的模板从19份石斛属植物中扩增出来,而其他的石斛属植物均为阴性。结论运用位点特异性鉴别引物成功地对霍山石斛进行PCR鉴别,该鉴别反应重现性好,能在霍山石斛鉴别时发挥重要的作用,与形态学、DNA测序等鉴别方法相比,该方法具有高效、准确、简便、省时等优点。     

金钗石斛的位点特异性PCR鉴别研究

目的建立一种简便、实用的金钗石斛的DNA分子鉴别方法。方法根据金钗石斛及其他黄草类、枫斗类石斛的rDNA ITS序列数据库,寻找金钗石斛特异性的序列位点,设计专用于金钗石斛鉴别的PCR引物,用该引物在不同条件下扩增石斛属植物的模板DNA,建立只有金钗石斛具有阳性扩增的PCR鉴别条件。结果在66℃、40 s的复性条件下进行鉴别PCR,金钗石斛的模板DNA扩增出约300 bp的阳性扩增带,而其他39种石斛的模板DNA在同样条件下无扩增产物。结论运用位点特异性PCR能有效地从其他石斛属植物中鉴别出金钗石斛,该方法具有高效、准确、简便、省时的特点,应用前景广泛。     

中药材鳖甲的位点特异性PCR鉴定研究

目的 本研究旨在建立一种简便、实用的鳖甲DNA分子鉴定方法。方法 根据中华鳖和鳖甲混淆品原动物的125rRNA基因片段的序列数据库,找出中华鳖与其它鳖科动物有明显区别的位点,设计1对能特异性鉴别中华鳖的引物,然后利用鳖甲中残存的DNA,通过PCR拉增,即可准确鉴别鳖甲。结果 用这对引物对不同来源的10块鳖甲进行鉴定结果表明,其中有3块为伪品,结果与DNA序列分析鉴定一致。还测定了斑龟和鳖甲一伪品12SrRNA基因片段序列。结论 该引物配置药材鉴定试盒可在鳖甲类药材鉴定使用。     

鹿茸、鹿角的位点特异性PCR鉴别

目的:建立一种快速、高效、简便的鹿茸、鹿角位点特异性聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法。方法:通过比较梅花鹿、马鹿及其混伪品的COI,Cytb基因序列差异,根据Cytb片段上的3个SNP (single nucleotide polymorphism)变异位点设计出一对鹿茸的特异性鉴别引物LR-238上游和LR-238下游,并对影响PCR结果的主要因素退火温度,PCR循环次数,模板DNA浓度,Taq酶用量和及影响重复性的Taq酶种类和PCR仪型号等进行方法学考察和优化。结果:进行方法学考察确定最优鉴别条件的基础上,当PCR退火温度为56℃,循环次数为35次的条件下,鹿茸、鹿角正品均能扩增出约250 bp片段,其他9种混伪品麋鹿、白唇鹿、水鹿、坡鹿、黇鹿、骡鹿、驯鹿、驼鹿、狍及阴性对照无条带。不同来源的药用的马鹿亚种东北马鹿、塔河马鹿、天山马鹿、阿拉善马鹿、阿勒泰马鹿、新西兰马鹿,梅花鹿亚种东北梅花鹿、华南梅花鹿样品使用建立的位点特异性PCR鉴别方法均产生约250 bp特异性鉴别条带。结论:该文设计的鉴别引物具有高度的专属性,所建立的位点特异性PCR鉴别方法可用于鹿茸、鹿角的准确鉴别。     

蒙成药中“地格达”类原料药材的位点特异性PCR鉴别研究

该文选择8种含有地格达类蒙药原料药材的蒙成药为对象,首先对基原植物肋柱花和苦地丁样品采用改良CTAB法提取其总DNA,使用psbA-trnH片段进行扩增、测序,与GenBank下载的8种蒙成药中其他原料药材psbA-trnH序列进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。同时对8种蒙成药进行总DNA的提取,并使用DNA纯化试剂盒进行纯化,通过PCR反应对叶绿体rbcL序列进行扩增,再分别选择肋柱花和苦地丁鉴别引物进行扩增,并将扩增后的产物进行测序。所得序列校正、比对后,进行比对分析。结果表明,地格达-4汤、地格达-8散、地格达-4散中均含有原料药材肋柱花,苦地丁特异鉴别引物扩增分析可以鉴定出利胆八味散、伊赫哈日-12和阿嘎日-35中含有苦地丁。该研究结果说明,位点特异PCR方法用于鉴定蒙成药中原料药材具有一定的可行性。     

多基原九里香药材的多重位点特异性PCR鉴别

目的 建立一种同时鉴别九里香药材两基原九里香Murraya exotica和千里香M. paniculata的DNA分子鉴别方法。方法 通过比较九里香、千里香的叶绿体基因组序列差异,根据叶绿体基因组上的单核苷酸多态性（SNP）变异位点分别设计九里香和千里香的特异性鉴别引物P03和P04,对影响聚合酶链式反应（PCR）结果的退火温度、循环次数、引物浓度比进行优化,建立了九里香和千里香的多重位点特异性PCR鉴别方法,并对影响该方法重复性的Taq酶种类、PCR仪型号进行耐受性考察和适用性考察。结果 在该多重位点特异性PCR鉴别方法中,当PCR反应循环数为31次,退火温度为60 ℃,九里香P03和千里香P04引物比为1∶2时,九里香可获得约330 bp的特异性条带,千里香可得到约230 bp的特异性条带,不同来源的九里香和千里香样品使用建立的多重位点特异性PCR鉴别方法均可获得一致结果。结论 该文建立一种快速、准确鉴别九里香药材基原的多重位点特异性PCR鉴别方法,可在单次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别九里香和千里香。     

金银花配方颗粒的位点特异性PCR鉴别研究

中药配方颗粒已失去所有形态学辨识特征,传统鉴定方法无法有效鉴定其真伪。该文使用位点特异性PCR鉴别技术,根据金银花trnL-trnF的一个SNP位点设计特异性鉴别引物,对金银花基原植物及配方颗粒进行鉴定。经过优化DNA提取方法后,药材与配方颗粒均成功提取到DNA,金银花基原植物及配方颗粒均可扩增获得约110 bp的条带,混伪品无条带。且BLAST结果比对证明PCR产物序列为金银花trnL-trnF序列。该文研究结果表明,DNA分子鉴定方法可弥补性状、显微鉴别局限性,对中药配方颗粒真实性进行快速准确的鉴定,为其生产、流通、用药安全提供科学依据和保障。     

藏菖蒲药材的特异性PCR鉴别

目的 考察利用ITS序列进行药材藏菖蒲及其常见混伪品(石菖蒲、多被银莲花、岩白菜)特异性PCR鉴别的可行性,研究藏菖蒲和混伪品的ITS序列以及基于ITS序列构建的系统发育树.方法 在ITS条形码研究的基础上,为藏菖蒲设计了特异性PCR引物对ZCP-CP19s/CP19a.利用二步法反应进行扩增,并优化扩增条件,缩短鉴别...     

双阻滞位点特异性PCR鉴别铁皮石斛及其近缘物种

建立一种快速、准确鉴别铁皮石斛加工制品的方法。该研究通过对Gen Bank数据库收录的铁皮石斛及其同属近缘物种的ITS序列进行对比分析,根据变异位点设计双阻滞位点特异性鉴别引物,并优化PCR条件,对铁皮石斛及其69种近缘种共362个样品进行扩增和检测。结果显示,在退火温度为60℃的同一PCR反应中,铁皮石斛均扩增出397 bp条带,而其他69种近缘物种均无条带,且该方法灵敏度高,检出限可达0.03 mg·L~(-1)。该文所建立的位点特异性PCR方法可实现铁皮石斛的准确鉴别,具有操作简便、稳定可靠、应用范围广的优点。     

多重位点特异性PCR鉴别海龙及其混伪品

目的:建立一种高效、准确的中药材海龙及其常见混伪品的特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴别方法。方法:通过比较海龙及其混伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(cytochrome C oxidase subunitⅠ,COⅠ)基因序列差异,根据变异位点设计刁海龙、尖海龙及拟海龙的特异性鉴别引物,优化反应体系,并对此方法进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上,将3对特异性引物组合,构建多重PCR体系。结果:在多重PCR体系中,刁海龙能扩增出485 bp片段,尖海龙可扩增出120 bp片段,拟海龙可以扩增出240 bp片段,其他混伪品均无条带。所设计的特异性鉴别引物具有高度的特异性。结论:该文所建立的位点特异性PCR鉴别方法可实现海龙的准确鉴别。     

半夏曲中4种优势微生物的荧光定量PCR方法的建立

目的对半夏曲中4种优势微生物建立快速、有效的荧光定量PCR检测方法。方法以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、宛氏拟青霉Paecilomyces variotii、丝衣霉菌Byssochlamys spectabilis、黑曲霉Aspergillus niger的重组质粒为标准质粒,设计特异性引物并进行特异性、灵敏性及重复性实验。结果 4种优势微生物的熔解曲线峰单一。枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉的最低检测限度分别为584、622、0.272、500拷贝/μL。不同质量浓度的标准质粒变异系数(CV)均小于5%。结论建立的枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉的荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,可用于发酵类中药中微生物的检测及定量。     

双重实时荧光PCR快速鉴别人参和西洋参＊

目的 建立一种能够快速鉴定人参和西洋参的双重实时荧光PCR方法。方法 通过对人参属及其近似种基因序列的分析比对，设计特异性的引物探针，建立双重实时荧光PCR检测方法。PCR反应体系为Premix Ex Taq （Probe qPCR） 10 μL，人参上下游引物各0.5 μL，西洋参上下游引物各0.3 μL，人参与西洋参特异性探针各0.4 μL，DNA模板2 μL，灭菌去离子水补至20 μL。反应条件为95℃预变性30 s；然后以95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s进行40个循环。应用该方法测试了27份DNA样品，包括7份人参、6份西洋参、4份人参与西洋参混合样、10份其他人参属样品及其他常见中药材样品的DNA，以确定该方法的特异性。将人参与西洋参样品DNA混合后10倍稀释成不同浓度后进行检测，用以确定该方法的灵敏度。结果 人参及西洋参样品均在特定的荧光通道下出现典型的阳性扩增曲线，人参与西洋参混合样品均同时出现两条阳性扩增曲线，其它对照样品及空白对照均没有出现阳性扩增曲线。灵敏度检测结果显示该方法检测人参及西洋参的最低检测限均为2 pg DNA/反应。结论 本实验建立的双重实时荧光PCR方法能够同时快速、准确、灵敏地鉴别出人参和西洋参。     

药用淫羊藿品种的分子鉴定研究——朝鲜淫羊藿的位点特异性PCR鉴定

目的:建立朝鲜淫羊藿的位点特异性PCR鉴定方法,用于朝鲜淫羊藿来源鉴定和药材质量控制。方法:依据自己测得和来自于GenBank主要药用淫羊藿种的核糖体基因组ITS序列,比对分析寻找朝鲜淫羊藿区别于其他种的变异位点,并根据这些变异位点设计专属性的PCR鉴定引物对植物样本进行扩增,并用药材饮片进行验证。结果:本研究获得了2对朝鲜淫羊藿特异性鉴定引物,能够区别朝鲜淫羊藿与其他药用品种,本方法适用于淫羊藿药材和饮片。     

浙贝母特异性PCR鉴定方法研究

目的利用特异性引物对浙贝母Fritillaria thunbergii进行特异性PCR鉴定。方法回收RAPD扩增筛选到的浙贝母分子标记ZB1基因,将其连接进入T-载体克隆并测序。根据测序结果设计一对特异性引物P2/P3,以贝母基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增。结果特异性PCR鉴定结果为浙贝母在约750 bp处出现特异性条带,其他贝母品种则未出现条带。结论浙贝母特异性PCR鉴定方法操作简单,准确、灵敏、重复性好,具有较好的应用前景。     

鼓槌石斛特异性PCR分子鉴定

目的 研究能够特异性鉴别鼓槌石斛的PCR引物,并优化PCR检测体系,确立一种快速、准确鉴别鼓槌石斛的方法.方法 从GenBank数据库中下载石斛属rDNA ITS序列170余条,运用MEGA 5.0对所有序列进行同源性比较,找出各变异位点,在非保守区设计1对特异性引物.对35份石斛属植物DNA模板进行特异性引物PCR扩增,显示阳性者为鼓槌石斛.结果 将退火温度升至58℃时,鼓槌石斛能被该引物特异性地扩增出来,而其他石斛属植物均为阴性,且该引物的灵敏度可达到0.69 ng/μL.结论 建立一种特异性鉴别鼓槌石斛的方法,运用该特异性引物可实现从同源物种中快速、准确地鉴定出鼓槌石斛,具有特异性好,操作简便、高效、准确等优点.     

罗布麻叶HPLC指纹图谱构建及在种属鉴别中的应用

目的 建立罗布麻叶的HPLC指纹图谱,用以控制罗布麻叶的内在质量,并对罗布麻叶药材与其混淆品进行鉴别.方法 采用HPLC梯度洗脱的方法建立指纹图谱,"计算机辅助相似度评价系统"软件进行数据处理,据此对不同种属的药材进行比较.结果 建立的罗布麻HPLC指纹图谱方法的精密度、稳定性和重现性较好.罗布麻叶(红麻叶)HPLC指纹图谱共标定12个共有指纹峰,与白麻属样品图谱之间呈显著差异,可以依此鉴别.结论 HPLC指纹图谱可以用作罗布麻叶药材的质量控制.     

基于ITS2序列的滨海白首乌及其近缘种DNA分子鉴定

目的采用ITS2条形码鉴定滨海白首乌及其近缘种药用植物。方法采集滨海白首乌Cynanchum auriculatum及其近缘种植物样品共54份,分别提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,测序结果提交至GenBank;从GenBank下载萝藦科植物16种47条序列,并通过ITS2数据库注释出ITS2序列;对提交与下载的101条序列,应用MEGA5.0软件进行序列比对,计算种内和种间距离,采用相似性搜索法、最近距离法进行鉴定分析,并构建neighber-joining(NJ)系统进化树直观反映鉴定结果。结果滨海白首乌ITS2序列长度均为249 bp,是1个单倍型,与萝藦科鹅绒藤属植物距离较近,与萝藦科其他属近缘种之间遗传距离较远,NJ树结果显示滨海白首乌及其近缘种药用植物均可明显区分,表现出良好的单系性,依据ITS2二级结构,也可以直观地将滨海白首乌与萝藦科近缘种区分。结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别滨海白首乌,为保障安全用药提供了新的技术手段。     

基于ITS序列位点特异性PCR的肉苁蓉与其混伪品的鉴别研究

研究荒漠肉苁蓉、锁阳和黄花列当之间的DNA分子鉴别方法,采集不同产地的30份荒漠肉苁蓉,13份锁阳以及8份黄花列当,所有样品进行总DNA提取,通过对其ITS片段进行扩增,测序。再进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,并对位点特异性PCR的反应条件进行了优化;另外,对位点特异性PCR法与DNA序列分析法的鉴别进行了比较。结果显示,该研究设计的位点特异引物在同一PCR反应中,荒漠肉苁蓉能扩增出331 bp的条带,而混伪品锁阳和黄花列当不能扩增出条带,从而实现了正伪品的鉴别。该文通过位点特异PCR的方法可以实现荒漠肉苁蓉与混伪品锁阳、黄花列当的快速、准确鉴别。