培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究

目的探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。方法将兔角膜缘组织培养出的细胞,分别用两组冷冻保护液冻存,0.5、1、2个月后分批取出。将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞传代培养,采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质。通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。结果AE1和传代细胞鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体染色呈阳性反应,AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应;冻存后的传代细胞贴壁、生长均滞后,而且电镜检查均有不同程度细胞水肿,再培养7d后形态结构均恢复正常;MTT法检测复苏当天冻存后的细胞比未冻存的细胞增殖活性低,差异显著(P<0.05,但培养5d后无显著差异(P>0.05),甘油组和DMSO组间有显著性差异(P<0.05),不同冻存时间的各冻存组测得值无显著差异(P>0.05)。结论冻存的角膜缘上皮细胞传代培养仍保持上皮细胞特性并含有干细胞;DMSO保护液比甘油液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行,选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养,其细胞活性和结构与原代相似。     

角膜缘干细胞生物学特性增龄性变化的实验研究

目的 观察增龄对体外培养的新西兰兔角膜缘干细胞生物学特性的影响.方法 随机选取2月龄,1.5年龄,3年龄新西兰兔各5只,取其角膜缘组织,用酶消化法制成细胞悬液,以相同的密度种植,观察体外培养的角膜缘干细胞的生长情况,细胞免疫荧光鉴定,噻唑蓝(MTT)比色法检测其增殖活性,流式细胞术测细胞周期和细胞大小.结果 2月龄新西兰兔角膜缘干细胞较1.5年龄和3年龄增殖活性高,增殖期细胞和小细胞所占的比例大.结论 角膜缘干细胞的增殖能力随着年龄的增加而降低,其在上皮细胞中所占比例随年龄的增加而减小.     

角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的实验研究

目的 建立兔角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的方法。方法 兔角膜缘上皮细胞组织块接种培养。取第三代细胞进行冻存。于冻存后第2周，3、6个月复苏细胞。用MTT法测细胞生长曲线。结果 兔角膜缘上皮细胞体外生长良好。培养细胞AE1单克隆抗体染色阳性，PAS染色阴性。冻存细胞复苏成功。冻存细胞复苏后生长曲线良好。结论 兔角膜缘上皮细胞可以在体外培养、冻存和复苏。     

改良兔角膜细胞冻存与复苏方法的实验研究

目的建立一种改良的兔角膜细胞冻存和复苏的方法。方法兔角膜细胞消化培养。取第2代细胞分别进行传统和改良方法冻存，于冻存后的第2周、3个月、6个月、la分别行传统和改良的复苏方法。用MTT法测细胞生长曲线，应用三因素分析统计方法评定不同冻存方法、不同复苏方法、不同复苏时间三因素单独和（或）组合对细胞复苏率的影响。结果兔角膜细胞体外生长良好。培养细胞Vim单克隆抗体阳性。细胞的复苏率均受不同冻存方法和复苏方法单、双因素影响，不受复苏时间及与冻存和复苏方法单、双因素及三因素的影响。冻存复苏后生长曲线良好。结论改良后的兔角膜细胞冻存和复苏方法可使细胞保持最佳生物学特性，细胞复苏率高，适用于体外实验研究。     

体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

荧光激活细胞分离技术在角膜缘干细胞研究中的应用

目的探讨荧光激活细胞分离技术（FACS）在体外培养的兔角膜缘上皮细胞生物学特性研究中的应用。方法收集新西兰白兔的角膜缘组织进行组织块培养。采用FACS分离出体外培养的兔角膜缘上皮细胞中的侧群（SP）细胞和非SP细胞。用2%锥虫蓝染色法对分离出的SP细胞进行克隆形成率（CFE）检测以评估SP细胞的活性,用免疫组织化学染色检测K3/12和ABCG2蛋白在SP细胞和非SP细胞中的表达。结果SP细胞在体外培养的兔角膜缘上皮细胞中占（0.22±0.09）%,分离出的SP细胞的CFE为（5.52±0.45）%,而非SP细胞为（0.78±0.73）%,二者差异有统计学意义（t=2.17,P〈0.01）;大部分SP细胞呈K3/K12抗原阴性,ABCG2免疫标记呈阳性;而非SP细胞呈K3/K12抗原阳性,ABCG2免疫标记呈阴性。结论FACS可以应用于体外培养的兔角膜缘上皮细胞的SP细胞分离,分离出的SP细胞具有较强的增生能力。     

培养角膜缘上皮细胞深低温保存后异体移植实验研究

目的深低温保存培养的角膜缘上皮细胞,复苏后进行异体移植实验,为临床应用提供实验依据。方法将浅层角膜基质载体上培养的角膜缘上皮细胞深低温保存,同时制作兔角膜缘干细胞损伤模型,分别用新鲜培养的角膜缘上皮细胞和冷冻复苏后培养的细胞及角膜基质进行异体移植实验。结果角膜缘上皮细胞能成功地培养于载体上,将培养细胞保存于-196℃的液氮罐中二月,可见深低温保存前后细胞的形态结构及生物学特性无显著差异。异体移植实验显示：新鲜培养的细胞及深低温保存后的细胞异体移植后,模型兔角膜表面逐渐正常上皮化,而角膜基质组异体移植后,角膜表面仍结膜化并可见大量新生血管生长,各项检测结果与培养细胞组相比差异显著（P〈0．05）。结论以浅层角膜基质为载体培养的角膜缘上皮细胞深低温保存后仍具有上皮细胞特性并具有高增殖能力,可用以进行异体移植治疗角膜缘干细胞缺陷的角膜病。     

超低温冷藏对体外培养兔角膜缘上皮细胞活性的影响

目的 分析超低温冷藏兔角膜缘上皮细胞活性变化.设计实验性研究.研究对象超低温冷藏兔角膜缘上皮单细胞悬浮液/兔角膜缘上皮单细胞悬浮液.方法 采用NIH 3T3饲细胞培养体系,将角膜缘上皮制成单细胞悬浮液后-182℃冷藏1周,复苏后行体外培养.以角膜缘上皮单细胞悬浮液为对照组.通过测定细胞贴壁时间、分裂周期、MTT值、3H-胸苷值分析细胞代谢和增殖活性,测定单克隆形成率分析干细胞性,采用AE5免疫组织化学方法鉴定培养上皮细胞,HE染色观察培养角膜上皮细胞形态,PAS染色鉴别结膜杯状细胞.主要指标细胞贴壁时间,分裂周期,MTT值,3H-胸苷值,单克隆形成率及角膜上皮细胞形态等.结果 体外培养超低温冷藏、复苏兔角膜缘上皮细胞的细胞贴壁率、分裂周期、单克隆形成分别为(73.16 13.36)%,(25.42±18.73)小时,(13.17±2.87)%,对照组为(74.89±15.72)%,(20.04±9.70)小时,(15.17±3.25)%.细胞代谢、增殖力也较对照组弱(P>0.05).HE染色示细胞形态、结构无差异,AE5免疫组化染色均为阳性,而PAS染色均为阴性.结论 超低温冷藏可降低体外培养兔角膜缘上皮细胞生物学活性,但其影响有限不足以改变细胞生物学特性和在眼表修复中的应用.(眼科,2008,17:108-112)     

冻存复苏后大鼠视网膜干细胞的增生及分化特性

目的研究视网膜干细胞冻存复苏后的成活率及再培养后的增生分化特性。方法对胎龄17 d Long Evans的大鼠眼视网膜干细胞进行分离与体外培养。利用无血清培养基短期体外培养大鼠胚胎来源的视网膜干细胞，将传代三代后的视网膜干细胞以冻存液［体积分数为80%的改良基础培养基（DMEM）/F12，10%牛血清白蛋白（BSA），10%二甲基亚砜（DMSO），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）20 ng/ml］于液氮中冻存，于1、2、4、8、12、16周分别复苏，计数活细胞比例进行再培养，并进一步诱导分化，采用免疫细胞荧光化学方法检测视网膜干细胞的增生及分化特性。结果不同的冻存时间对冻存后细胞存活率的影响无显著差异(P＞0.05)，再培养生长良好，具有视网膜干细胞特异性标志，并可进一步诱导分化为视网膜各种类型的细胞。结论大鼠视网膜干细胞的冻存复苏并不影响其原有的增生及分化特性。(中华眼底病杂志, 2007, 23: 94-97)     

以干燥脱水法保存的异种角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织

目的:观察以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织的生物学特性。方法:采用组织块培养法获得新西兰大白兔角膜缘干细胞,经胰蛋白酶消化法获得细胞,种植于干燥脱水法保存的鸵鸟角膜板层基质上,采用气液界面培养法进行培养,通过倒置显微镜、透射电子显微镜、荧光显微镜观察其形态学、生长特点,超微结构及免疫学特征。结果:在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质上种植兔角膜缘干细胞,接种72h后,细胞形成单层,移置气液交界面后继续培养7～10d,逐渐形成复层。经光镜、透射电镜、及免疫学检测显示其具有角膜上皮组织的生物学特性。结论:兔角膜缘干细胞能够在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质载体上生长,并可形成复层,基本具有正常角膜上皮细胞的形态、超微结构和生物学特性。     

增龄对角膜基质载体培养的角膜缘干细胞生物学特性的影响

目的 观察增龄对新西兰兔角膜缘干细胞在同种异体角膜基质上生长、增殖的影响.方法 用酶消化法将不同年龄新西兰兔角膜缘组织制成细胞悬液培养,以相同的细胞密度种植于不同年龄的新西兰兔的角膜基质上,观察角膜缘干细胞在角膜幕质上的生长情况.原位杂交检测ABCG2、ANp63的表达,IPP5.1软件分析图像,流式细胞术测细胞周期,运用SPSS13.0软件对析因设计资料进行方差分析.结果 角膜缘干细胞供体年龄各水平差异有统汁学意义,相同时间内角膜基质培养的青年兔角膜缘干细胞在角膜基质单位面积卜的牛长总而积均较中年和老年高,增殖期细胞所占比例大;而角膜基质供体年龄各水平差异与角膜缘干细胞和角膜基质的交互作用均无统计学意义.结论 在同种异体角膜基质载体上培养的角膜缘干细胞的增殖能力随着年龄的增加而降低.     

角膜缘干细胞和生物羊膜移植治疗翼状胬肉

目的观察角膜缘干细胞移植和生物羊膜移植治疗翼状胬肉的临床疗效。方法将58例（66眼）随机分为2组,分别采用角膜缘干细胞移植32例（36眼）和生物羊膜移植26例（30眼）,术后随访6个月～2年。结果角膜缘干细胞移植组复发1眼,复发率2．78％,生物羊膜移植组复发7眼,复发率23．33％。两组比较差异有统计学意义。角膜创面愈合时间：角膜缘干细胞组1～3d,平均为（1．85±0．95）d,生物羊膜组2～5d,平均为（3．36±1．65）d。结论带角膜缘干细胞移植和生物羊膜移植术治疗翼状胬肉都能取得良好效果,但带角膜缘干细胞移植比生物羊膜移植角膜创面修复快,复发率低。     

翼状胬肉的不同手术方法疗效分析

目的比较自体角膜缘干细胞移植联合丝裂霉素C,新鲜羊膜移植,及单纯性胬肉切除的临床疗效。方法将胬肉的病人83眼随机分A、B、C三组,A组26眼用单纯切除术,B组28眼用翼状胬肉切除联合新鲜羊膜移植手术,C组29眼行角膜缘干细胞移植联合丝裂霉素C应用,术后随访六月至一年,观其复发率。结果A组26眼中有8眼复发,复发率30．76％,B组28眼有5眼复发,复发17．85％,C组有2眼复发,复发率为6．89％。A组与C组比较复发率差异有统计学意义（χ2=4．32,P〈0．05）,B组与C组比较复发率差异有统计学意义（χ2=4．41,P〈0．05）。结论自体角膜缘干细胞移植联合丝裂霉素C明显有效的降低翼状胬肉术后的复发率,是比较理想的手术方法。     

原代培养角膜缘干细胞与ΔNp63蛋白表达的年龄相关性研究

目的建立兔角膜缘干细胞（LSCs）原代培养体系,了解年龄的增长对兔LSCs的ΔNp63蛋白表达的影响。方法选取3月龄、1.5年龄及3年龄新西兰白兔各10只,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液对LSCs的细胞悬液进行体外原代培养。应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术和间接免疫荧光法分别检测培养细胞中ΔNp63蛋白的表达量。结果接种3d后大部分细胞贴壁,6d左右形成良好的细胞单层,细胞呈圆形、椭圆形或多边形,类似角膜上皮细胞。年龄越大,ΔNp63的表达量越低。不同年龄组之间ΔNp63表达量的差异有统计学意义（P〈0.05）。结论含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液能作为LSCs培养的基础液;ΔNp63蛋白的表达具有明显的年龄相关性,随年龄的增长ΔNp63表达量的下调可能是LSCs老化的分子机制之一。     

CsA滴眼液防治角膜缘移植排斥反应的实验研究

目的 探讨环孢霉素A(CsA)滴眼液对同种异体角膜缘移植术后的免疫抑制作用。方法 32只新西兰白兔随机分成CsA组和生理盐水对照组,每组16只。建立右眼角膜缘缺陷症动物模型,1月后实施同种异体角膜缘移植术,术后分别给予1％CsA滴眼液及生理盐水治疗,共4周。移植术后每日观察植片存活、角膜新生血管和上皮再生情况,共8周;术前1日及术后1～8周动态监测外周血T淋巴细胞CD25的表达。结果 对照组先于CsA组出现上皮排斥反应(P<0.05)。CsA组外周血T淋巴细胞CD25表达低于对照组(P<0.05)。结论 同种异体角膜缘移植术后早期应用CsA滴眼液可抑制外周血T淋巴细胞CD25的表达从而抑制排斥反应发生。     

翼状胬肉自体角膜缘干细胞移植术

目的观察自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的临床疗效。方法手术显微镜下自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉165例临床资料进行分析。结果术后随访18~24个月,149眼治愈,16眼复发。其中原发性翼状胬肉复发率9.17%（11/120）,复发性翼状胬肉复发率11.11%（5/45）。结论翼状胬肉自体角膜缘干细胞移植术是一种有效的手术方法。