转基因何首乌毛状根生物转化熊果苷的初步研究

应用悬浮培养的转基因何首乌毛状根,获得目标产物熊果苷,具有较大的应用价值.     

转基因何首乌毛状根生物转化青蒿酸的研究

目的利用转基因何首乌Polygonum multiflorum毛状根对青蒿酸进行生物转化研究,分离鉴定其转化产物。方法何首乌毛状根预培养7 d,投入青蒿酸,培养2 d,终止反应,利用TLC和GC-MS对转化产物进行检测,利用硅胶柱、ODS反相柱和Sephadex LH-20柱色谱对转化产物进行分离纯化,并根据理化数据和波谱技术鉴定转化产物的化学结构。结果青蒿酸在何首乌毛状根中发生了转化反应,经GC-MS检测可生成多种青蒿素类化合物。分离鉴定了2个转化产物:异青蒿内酯(1)和3β-羟基青蒿酸(2),利用GC-MS鉴定了另外2个转化产物:去氧青蒿素B(3)和青蒿内酯(4)。结论本实验首次利用转基因植物器官对青蒿酸进行生物转化研究,得到3个青蒿素类化合物和1个羟基化产物。该研究一方面填补了转基因植物器官对青蒿素类化合物生物转化的空白,另一方面也丰富了转基因何首乌毛状根的化合物转化类型。     

转基因何首乌毛状根的二苯乙烯苷含量

以HPLC法比较研究何首乌转基因毛状根及何首乌植株中2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量,结果显示转基因何首乌毛状根含二苯乙烯苷量较高。     

何首乌毛状根生物转化对苯二酚生产熊果苷的研究

目的:利用何首乌毛状根悬浮培养体系生物合成熊果苷,并对转化条件进行考察。方法:利用何首乌毛状根培养体系对底物对苯二酚进行生物转化,通过HPLC制定熊果苷标准曲线,以转化产物熊果苷的产量和转化率为指标,研究了共培养时间、底物加入浓度、培养瓶体积对生物合成熊果苷的影响。同时考察了产物在培养基中的分泌情况。结果:产物在培养物和培养基中同时存在。熊果苷标准曲线Y=440 740X?1.473(r=0.999 7)。当底物加入质量浓度为1 100 mg.L-1,共培养72 h时,熊果苷的产量(2.22 g.L-1)和转化率(81.45%)达到最优。3 L大瓶培养获得成功。结论:本研究大大提高了以生物转化方法生产熊果苷的产量和转化率,并达到了3 L大瓶培养规模。此外,本研究也为利用生物技术方法大规模生产熊果苷提供了有价值的参考资料。     

转基因何首乌毛状根化学成分的研究

目的研究转基因何首乌毛状根中的化学成分。方法采用硅胶、Sephadex LH-20、ODS柱色谱等方法分离何首乌毛状根中的化学成分，并根据理化性质和波谱数据鉴定其化学结构。结果从何首乌毛状根60％乙醇提取物中分离得到了12个化合物。利用理化性质及波谱技术确定其结构分别为：2，3，5，4’-四羟基反式二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（1）、没食子酸（2）、没食子酸甲酯（3）、3，5-二羟基苯甲酸（4）、丁香酸（5）、对羟基苯甲酸（6）、胡萝卜苷（7）、β-谷甾醇（8）、豆甾醇（9）、烟酸（10）、碳直链十七酸（11）、碳直链三十一酸（12）。结论上述12个化合物均为首次从转基因何首乌毛状根中分离得到；化合物3，4，5，6为首次从该种植物中分离得到。     

转基因何首乌毛状根生物转化4-甲基-7-烯丙基氧香豆素的研究

目的:以4-甲基-7-羟基香豆素(Ⅰ)为原料通过Williamson醚法合成4-甲基-7-烯丙基氧香豆素(Ⅱ),对其进行生物转化研究,进一步探讨转基因何首乌毛状根体内酶系统的多样性。方法:Ⅰ在碳酸钾、碘化钾催化剂作用下与3-溴丙烯反应生成烯丙氧基产物Ⅱ,核磁共振技术进行结构鉴定;将Ⅱ投入何首乌毛状根悬浮培养体系中,共培养7 d后,利用TLC和HPLC进行产物检测,硅胶柱层析法分离纯化,核磁共振技术进行结构确认。结果:通过Williamson醚合成法成功得到目标产物Ⅱ。Ⅱ在何首乌毛状根悬浮培养体系中发生了生物转化反应。分离纯化得到两个化合物:4-甲基-7-羟基香豆素(Ⅰ)及4-甲基香豆素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅲ)。结论:何首乌毛状根酶系统具有水解酶及糖基转移酶活性,是良好的生物转化体系。     

何首乌毛状根对倍半萜类化合物Furannoligularenone的生物转化研究

目的：研究何首乌毛状根对倍半萜类化合物furannoligularenone（Ⅰ）的生物转化。方法：将外源底物Ⅰ的甲醇溶液投入到预培养9 d的何首乌毛状根,共培养后终止转化,利用各种色谱方法分离纯化产物,根据产物的理化性质和光谱数据进行结构鉴定。结果：分离得到两个转化产物3-oxo-eremophila-1,7（11）-dien-12,8-olide（Ⅱ）和3-oxo-8-hydroxy-eremophila-1,7（11）-dien-12,8-olide（Ⅲ）。转化的最佳共培养时间为3 d,总的摩尔转化率最高为27.2%。结论：利用何首乌毛状根系统生物转化倍半萜类化合物furannoligularenone获得成功。     

HPLC-DAD同时测定洋甘菊中木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷的含量

目的建立同时测定洋甘菊中木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷和芹菜素7-O-β-D葡萄糖苷含量测定的HPLC方法。方法色谱柱:Agilent Zorbax SB-C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:甲醇-0.2%磷酸(34∶66);流速:1.0 ml/min;柱温25℃;进样量10μl;检测波长:350 nm。结果木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷和芹菜素-7-0-β-D葡萄糖苷的线性范围分别为5.11~409.00、12.56~1 005.00μg/ml,相关系数r>0.999 3,具有良好的线性。精密度、稳定性符合要求,木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷和芹菜素-7-0-β-D葡萄糖苷加样回收率分别为96.44%~103.55%、95.12%~101.52%,RSD均为0.03%。结论该方法简便、准确、重复性好,适用于洋甘菊中木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷和芹菜素7-O-β-D葡萄糖苷含量测定。     

何首乌毛状根培养及大黄酚的含量测定

目的 测定何首乌毛状根中大黄酚的含量。方法 用发根农杆菌Ri 15834菌株感染何首乌茎、叶外植体,均可诱导出毛状根,并能合成大黄酚,采用薄层扫描法测定毛状根中大黄酚。结果 毛状根中大黄酚的含量为0．0164％。结论 该毛状根具有典型的毛状根形态特征,大黄酚含量低于何首乌药材。     

何首乌毛状根中蒽醌类成分的分离鉴定

目的:对转基因何首乌毛状根中的蒽醌类成分进行分离鉴定.方法:何首乌毛状根的60%乙醇提取物,经不同极性的溶剂萃取后,利用理化性质和现代谱学方法将其鉴定.结果:从乙酸乙酯和正丁醇萃取物中分离得到5个蒽醌类化合物,分别为大黄素(I)、大黄素甲醚(II)、大黄酚(III)、芦荟大黄素(IV)和大黄酸(V).结论:上述5个药理活性成分均为首次从转基因何首乌毛状根中分离得到.     

2,3-二氢环戊二烯香豆素类化合物对转基因何首乌毛状根生长及其二苯乙烯苷累积的影响

目的:考察2,3-二氢环戊二烯香豆素类化合物对何首乌毛状根生长的影响,并研究其对毛状根中有效成分二苯乙烯苷累积的刺激作用.方法:将2,3-二氢环戊二烯香豆素类化合物在不同的培养时间加入到毛状根中,共培养特定时间后测定其二苯乙烯苷的含量及生长量,并通过考察不同浓度和继代次数确定最佳实验条件.结果:加入香豆素类化合物的最佳时间为预培养第4天,最佳质量浓度为0.025 g·L-1,毛状根的生长量有较大提高,与对照组相比二苯乙烯苷的含量增加4倍左右.结论:2,3-二氢环戊二烯香豆素类化合物作为一类非生物诱导子能够促进何首乌毛状根的生长及有效成分二苯乙烯苷的累积.     

何首乌中一个新的色原酮糖苷

综合运用各种色谱技术对蓼科植物何首乌的块根进行分离纯化,并通过理化常数、波谱数据和化学方法鉴定化合物的结构。从中分离得到1个化合物,鉴定其结构为（S）-2-（2'-羟丙基）-5-甲基-7-羟基色原酮-7-O-α-L-岩藻糖基（1→2）-β-D-葡萄糖苷（1）,为一个新的色原酮糖苷类化合物。     

何首乌不定根的离体诱导及悬浮培养研究

通过离体不定根的高效诱导与悬浮培养,实现何首乌资源的永续利用。在培养基中添加不同浓度的蔗糖和植物生长物质,筛选从幼茎有效诱导不定根的最适培养基;采用正交试验筛选不定根悬浮培养的最适培养基;对悬浮培养的不定根进行继代培养并测定生长曲线,同时对不定根中的主要有效成分进行检测。结果表明,能够从幼茎有效诱导不定根的最适培养基为MS+蔗糖 40 g·L^-1+α-萘乙酸 2.0 mg·L^-1+6-卞基腺嘌呤 0.2 mg·L^-1;不定根悬浮培养的最适培养基为 MS+蔗糖30 g·L^-1+α-萘乙酸 2.0 mg·L^-1+生根粉 0.2 mg·L^-1;经过检测,发现不定根同样含有何首乌药材中的主要有效成分二苯乙烯苷。该实验实现了何首乌不定根的高效诱导与培养,为中药资源的永续利用研究提供了工作基础。     

近红外光谱法鉴别何首乌真伪的应用研究

目的:建立近红外定性分析模型能够对何首乌真伪进行鉴别,同时区分何首乌与其炮制品制何首乌,可用于该药材快速筛查,加强药品监管效能。方法:采集30多份何首乌和制首乌样品以及其伪品白首乌、冀蓼、毛脉蓼的近红外光谱图,利用近红外光谱技术结合化学计量学方法建立何首乌定性判别模型和一致性检验模型,并尝试对不同产地何首乌进行聚类分析。结果:所建模型能够将何首乌与其伪品准确识别,同时能够区分何首乌与制何首乌。结论:近红外光谱法在何首乌药材鉴别、分类中得到实际应用,可作为鉴别该药材的初筛手段。     

何首乌水培繁殖及生根相关生理生化特征的动态变化

目的:为何首乌人工繁育和更深一步研究何首乌生根机制提供理论依据和技术指导.方法:以何首乌嫩枝为材料,进行2号生根粉(ABT2)不同浓度的对比试验,研究水培繁殖及生根过程中内源激素吲哚乙酸(IAA)、玉米素核苷类(ZRs)、脱落酸(ABA)含量及吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、多酚氧化酶(PPO)活性的动态变化.结果和结论:50mg·L(-1)ABT2处理何首乌插条,平均生根率到达了94%,10,25 mg·L(-1)ABT2处理插条生根率为75%,88%,而对照只有46%生根.何首乌水培生根过程可分为根诱导期、露白期和伸长期3个阶段.内源激素含量、氧化酶活性的动态变化与插条不定根生长过程密切相关,不定根诱导期需要低含量的内源激素IAA,ZRs,ABA和较高活性的IAAO;不定根形成露白期需要高含量内源激素IAA、较高活性的PPO、低含量的ZRs,ABA和低活性的IAAO;不定根伸长期需要一定含量的IAA,ZRs,ABA和较高活性的PPO,IAAO.生根过程中,50mg·L(-1)ABT2的处理增加了插条内IAA含量和PPO活性,降低了插条内ABA,ZRs含量和IAAO活性.     

丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

目的:建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法:考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率,共培养外植体用400 g.L-1Cef水除菌5 min,接种在MS+400 g.L-1Cef+2.5 g.L-1Hyg的固体培养基上,完全除菌后转接入6,7-V+2.5 g.L-1Hyg液体培养基继代培养,GFP荧光检测阳性毛状根,PCR检测农杆菌特征基因rolC,并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。结果:用丹参叶片基部诱导毛状根,成功率可达到93.3%;农杆菌侵染10 min诱导效率最高为63.3%;共培养2～3 d诱导效果最好;PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性;丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论:成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系,为进一步的基因工程应用打下基础。     

Hexane extract from Polygonum multiflorum attenuates glutamate-induced apoptosis in primary cultured cortical neurons

Ethnopharmacological relevance

Polygonum multiflorum has traditionally had wide use as an anti-aging treatment in East Asian countries. We investigated the neuroprotective effects of Polygonum multiflorum against glutamate-induced neurotoxicity with a focus on the anti-apoptotic mechanism in primary cultured cortical neurons.

Material and methods

Cell viability, cytotoxicity, morphological, flow cytometry, Western blot, and caspase activity assays were performed for examination of the neuroprotective effects of active hexane extract from Polygonum multiflorum (HEPM).

Results

Pretreatment with HEPM resulted in significantly decreased glutamate-induced neurotoxicity in a concentration-dependent manner and also resulted in drastically inhibited glutamate-induced apoptosis. Treatment with HEPM resulted in decreased expression of glutamate-induced death receptor (DR)4, and enhanced expression of glutamate-attenuated anti-apoptotic proteins, including Bcl-2, XIAP, and cIAP-1, and slightly reduced glutamate-induced cleavage of Bid. In addition, treatment with HEPM resulted in suppressed glutamate-induced activation of caspase-8, caspase-9, and caspase-3, and, subsequently, decreased degradation of poly(ADP-ribose) polymerase, β-catenin, and phospholipase Cγ1 protein, which are downstream targets of activated caspase-3.

Conclusions

The results of this study demonstrated that HEPM exerts a neuroprotective effect against glutamate-induced neurotoxicity via inhibition of apoptosis. This protection may be mediated through suppression of DR4 and up-regulation of Bcl-2, XIAP, and cIAP-1, as well as inhibition of caspase activation, resulting in prevention of apoptosis of cortical neurons.     

何首乌快繁技术优化及同源四倍体的诱导与鉴定

目的:建立何首乌快速繁殖体系并对之进行优化;探索组织培养条件下诱导何首乌同源四倍体的有效方法.方法:采用正交设计的方法,对何首乌的繁殖培养基进行优化筛选;将顶芽于不同浓度秋水仙碱溶液中浸泡不同时间筛选何首乌同源四倍体的诱导条件.结果:何首乌最佳繁殖培养基为MS +6-BA 1.0 mg· L-1 +NAA 0.3 mg·L-1+ PP3330.4 mg·L-1;0.2％秋水仙碱浸泡芽30 h,或0.3％秋水仙碱浸泡芽18h为诱导何首乌同源四倍体的理想条件,诱导率高达16.7％.结论:采用组织培养方法可进行何首乌的快速繁殖;秋水仙碱是有效的多倍体诱导剂.通过根尖细胞染色体鉴定,共获得25个同源四倍体株系.该实验为何首乌野生资源保护、优良品种的选育奠定了基础.