不同血清对成人骨髓基质干细胞成骨诱导分化的影响

[目的]探讨三种不同来源血清对体外培养成人骨髓基质干细胞(hBMSCs)向成骨诱导分化的作用.[方法]将体外第3代hBMSCs向成骨诱导分化培养,分为胎牛血清组(对照组)、AB 血清组和自体血清组.对比观察细胞碱性磷酸酶(ALP)染色、钙结节染色.诱导培养后4、7、14 d 和 21 d,各血清组分别进行钙黄绿素法荧光显微镜动态观察矿盐沉积,检测 ALP 活性,实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)法检测成骨基因(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达.[结果]ALP 染色和钙结节染色结果显示,与自体血清(AS)组、胎牛血清(FBS)组相比,AB 血清(ABS)组明显提高了 hBMSCs 的染色阳性率.荧光显微镜下观察诱导 21 d 的 hBMSCs,ABS 组较 FBS 组、AS 组呈现更多的钙盐沉积.ALP 活性结果显示,同一时间点 ABS 组的 ALP 活性均明显高于 FBS 组和 AS 组,差异有统计意义(P<0.05).RT-qPCR 结果显示,在7、14 d 和 21 d,ABS 组 ALP、OPN 和 OCN 成骨基因表达均明显高于 FBS 组、AS 组,其中,ALP 基因表达在 7 d 出现峰值,OPN 基因表达在 14 d 出现峰值,OCN 基因表达在 21 d 出现峰值,差异均有统计学意义(P<0.05).[结论]ABS 对 hBMSCs 成骨分化作用较 FBS、AS 明显增强.ABS 有望替代 FBS 建立符合骨组织工程临床应用要求的体外 hBMSCs 培养体系.     

成骨细胞特异性钙黏蛋白基因转染对人骨髓基质干细胞成骨分化影响的研究

目的 观测成骨细胞特异性钙黏蛋白(Cad-Ⅱ)基因转染对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响. 方法把脂质体介导的Cad-Ⅱ cDNA转染体外分离培养的hBMSCs,检测Cad-Ⅱ蛋白表达变化,并对比观测转染组和单纯成骨诱导组在培养3,7、14、21 d时,hBMSCs碱性磷酸酶(ALP)和骨钙索的表达变化. 结果 转染组和成骨诱导组3 d后开始有ALP的阳性染色,呈棕黑色,7 d开始有骨钙索的阳性染色并随培养时间延长逐渐增多,但各时间点转染组ALP浓度(P=0.008)和骨钙素染色阳性数(P=0.023)均显著高于单纯成骨诱导组.转染组和成骨诱导组从14 d后开始有红色的刚件染色矿化结节出现,结节数目随时间推移而增多. 结论 Cad-Ⅱ基因转染可促进hBMSCs向成骨细胞的分化.     

不同浓度地塞米松诱导脂肪干细胞成骨分化的实验研究

目的地塞米松是MSCs成骨诱导分化的基础试剂,探讨诱导脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)成骨分化过程中地塞米松的优选浓度,为进一步骨组织工程研究提供理论依据。方法 3月龄清洁级健康新西兰大白兔5只,雌雄不限,体重2～3 kg。取腹股沟区皮下脂肪4～6 mL,采用胶原酶消化离心贴壁法分离培养ADSCs,取第3代细胞进行实验。倒置相差显微镜观察细胞形态变化;联合CD44、CD106免疫荧光染色和成脂诱导分化鉴定ADSCs。调整细胞密度为1×105个/mL,分别用普通培养液(A组)及含0(B组)、1×10-9(C组)、1×10-8(D组)、1×10-7(E组)、1×10-6(F组)、1×10-5 mol/L(G组)地塞米松的成骨诱导培养液对ADSCs进行培养。MTT法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测诱导细胞骨钙素(osteocalcin,OC)和核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)的表达;测定ALP活性及矿化面积百分率;对矿化结节行茜素红染色。结果 ADSCs形态多为梭形、多角形,呈"漩涡状"排列;表面抗原分子CD44呈阳性,CD106呈阴性,成脂诱导后可观察到细胞内有脂滴形成,油红O染色呈阳性。MTT检测显示随地塞米松浓度升高,吸光度(A)值呈下降趋势;其中成骨诱导5、7 d时,D、E组A值比较差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测示,成骨诱导7 d OC和Cbfα1 mRNA的表达分别在E组和D组达高峰;成骨诱导14 d ALP活性和矿化面积百分率均在D组达高峰,随后逐渐下降。D、E组间OC和Cbfα1 mRNA的表达量、ALP活性及矿化面积百分率比较差异均无统计学意义(P>0.05),与其余各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。成骨诱导14 d,G组细胞均死亡;茜素红染色除A、G组外均呈阳性。结论成骨培养液中地塞米松浓度为1×10-8 mol/L时,能在减少对细胞增殖抑制的同时,更有效地诱导ADSCs成骨分化。     

尿酸对人骨髓间充质干细胞成骨分化中Cbfα1/Runx2表达的影响

目的 观察不同浓度尿酸对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化过程中核心结合因子α1(Cbfα1/Runx2)表达变化的影响.方法 以体外培养的健康成年hBMSCs为研究对象,分为5个组,分别为对照组(完全培养基组)和加入不同浓度尿酸(0 mmol/l、0.2 mmol/l、0.4 mmol/l、0.8mmol/l)的成骨诱导组,通过倒置显微镜观察细胞形态,碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定细胞.在干预诱导第7天和第14天行RT-PCR检测Cbfα1/Runx2的表达.结果 碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果均阳性,表示诱导后细胞为成骨细胞.RT-PCR结果表明,对照组各时间点均无Cbfα1/Runx2表达,尿酸培养组随尿酸浓度增加和时间的延长,Cbfα1/Runx2表达逐渐增强,呈现时间依赖性和浓度依赖性.结论 尿酸可能通过促进Cbfα1/Runx2的表达,从而促进hBMSCs向成骨细胞分化.     

猪滑膜源性MSCs体外多向分化潜能的研究

目的 体外分离培养猪滑膜源性MSCs(synovium-derived MSCs,SMSCs),探讨其在体外多向分化潜能.方法 2月龄长枫杂交猪3头,雌雄不限,体重8～10kg.取猪膝关节滑膜组织分离SMSCs并行原代及传代培养,待第3代SMSCs长满培养皿后,吸去基础培养液,分别加入特定培养液进行成软骨、成骨、成脂诱导分化,作为实验组;以基础培养液培养作为对照组.成软骨诱导21 d后行甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测;成骨诱导10 d后行ALP染色检测,21 d后行茜素红染色检测;成脂诱导21 d后行油红O染色检测.结果 SMSCs培养24 h后细胞形态细长或呈多角形;48 h后细胞数量增多;72 h后可见大量纺锤形细胞,其间散在分布少许小圆形细胞.实验组成软骨诱导21 d后甲苯胺蓝染色早阳性,细胞外有蛋白多糖(Aggrecan)形成;免疫组织化学染色示特异软骨基质ColⅡ表达;实时荧光定量PCR检测示Col Ⅱ A1、Aggrecan、SOX9 mRNA表达量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).成骨诱导10 d后ALP染色阳性,21d后茜素红染色阳性,有钙结节形成.成脂诱导21 d后油红O染色示细胞内有脂滴形成.对照组除ALP染色观察呈弱阳性外,余染色均呈阴性.结论 猪膝关节滑膜组织可分离获取SMSCs,其在体外具有向成软骨、成骨、成脂多向分化潜能,有望成为组织工程种子细胞来源.     

成骨细胞条件培养液对BMSCs诱导分化作用研究

目的 探讨大鼠成骨细胞条件培养液对同种大鼠BMSCs的成骨诱导分化作用,为骨组织工程种子细胞的获得寻找一种新方法 . 方法 健康1周龄SD大鼠10只,雌雄不限,体重20～30 g,采用贴壁法和酶消化法分别获得BMSCs和成骨细胞,并进行鉴定.无菌条件收集第1～5代成骨细胞培养液上清,与完全培养基1:1混合,制备成骨细胞条件培养液,与第2代BMSCs共培养为诱导组,相同代次BMSCs与完全培养液共培养为对照组.倒置相差显微镜下观察共培养后BMSCs形态变化,MTT法检测BMSCs生长情况,免疫组织化学染色检测共培养后BMSCs的ALP、Col Ⅰ、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白的表达,采用RT-PCR检测Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导组共培养7 d BMSCs体积变大,细胞由长梭形展开为扁平形和多边形,并带有突起;9 d细胞呈集落状生长.细胞生长曲线示BMSCs数量随培养时间延长而增加,对照组增殖能力较诱导组强;诱导培养4～7 d,对照组细胞数量与诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05).诱导组培养12 d,ALP染色呈阳性表达;18 d 出现钙结节;21 d Col Ⅰ和OCN呈阳性表达;对照组均呈阴性表达.RT-PCR检测示诱导组培养21 d有Col Ⅰ、OCN mRNA表达,对照组未见表达. 结论 体外大鼠成骨细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠BMSCs向成骨样细胞分化的作用.     

不同时期bFGF或副甲状腺激素相关肽对TGF-β1诱导的兔BMSCs向软骨细胞分化的影响

目的探讨bFGF和副甲状腺激素相关肽(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对TGF-β1诱导兔BMSCs向软骨细胞分化的影响。方法 2月龄健康日本大耳白兔3只,雌雄不限,体重1.6～2.1 kg;取兔胫骨骨髓分离培养BMSCs。取第3代细胞行团块状立体培养,并按照不同诱导条件分为TGF-β1组(A组)、TGF-β1/bFGF组(B组)、TGF-β1/21 d bFGF组(C组)、TGF-β1/PTHrP组(D组)、TGF-β1/21d PTHrP组(E组)。于团块状立体培养开始时,各组均加入10 ng/mL TGF-β1;B、D组同时加入10 ng/mL bFGF或10 ng/mL PTHrP;C、E组于培养21 d时对应加入10 ng/mLbFGF或10 ng/mL PTHrP。培养后1、2、3、4、5、6周检测各组BMSCs向软骨细胞分化的标志性基因Ⅰ型胶原(collagentypeⅠ,ColⅠ)、ColⅡ、ColⅩ和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)13的表达,1、2、3、4、6周检测ALP活性,6周时行1,9二甲基亚甲蓝(1,9-dimethylmethylene blue,DMMB)染色观察细胞外基质分泌情况。结果 RT-PCR检测示,3周后C、E组ColⅠ基因表达呈显著下降趋势,4、5周时A组显著高于C、E组(P<0.05),3～6周A组显著高于B、D组(P<0.05);B、C组3、4周时及D、E组3周时比较,差异有统计学意义(P<0.05)。C、E组3周后ColⅡ、ColⅩ基因表达均逐渐下降,4～6周时显著低于A组(P<0.05);B、D组各时间点两基因表达均未见显著升高,与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。A组各时间点MMP-13均未见明显表达,3周时B组与A、C组比较差异有统计学意义(P<0.05),D组显著高于A、E组(P<0.05)。随着时间延长A组ALP活性逐渐升高,4周后C、E组显著下降,均低于A组(P<0.05);B、C组间及D、E组间比较,仅在2、3周时差异有统计学意义(P<0.05)。DMMB染色显示6周时A组软骨陷窝明显,其余各组软骨陷窝明显较少。结论 bFGF和PHTrP能通过改变软骨细胞外基质的合成和分解,抑制TGF-β1诱导的兔BMSCs向软骨细胞分化。这种抑制作用不仅通过抑制ColⅩ基因表达而实现,可能还通过抑制其他软骨分化相关蛋白实现。     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

全反式维甲酸与VEGF联合应用诱导小鼠胚胎成纤维细胞定向成骨分化

目的研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)与VEGF联合应用对于小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)定向成骨分化的影响。方法取NIH孕鼠(孕12~15 d)子宫内的胎鼠,去掉头、心、肝等器官后,采用胰蛋白酶消化贴壁法分离培养MEFs。利用HEK-293细胞采用反复冻融法扩增重组腺病毒红色荧光蛋白(recombinant adenovirus-red fluorescent protein,Ad-RFP)及Ad-VEGF。采用ALP染色和ALP定量检测法检测单独ATRA或VEGF以及ATRA和VEGF联合应用培养MEFs第3、5天ALP活性变化。将第3~4代MEFs分为A、B、C、D 4组,分别加入DMSO+Ad-RFP、ATRA、Ad-VEGF、ATRA+Ad-VEGF。实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测第3、7天成骨相关标志物ALP、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)及成血管相关标志物VEGF、血管生成素1(angiopoietin 1,ANGPT1)、内皮黏蛋白(endomucin,EMCN)mRNA表达;免疫组织化学染色检测各组第3、5、7天OPN、VEGF蛋白表达;茜素红染色检测各组成骨诱导14、21 d钙盐沉积水平。取15只4~6周龄无胸腺雌性裸鼠,随机分为3组,每组5只,分别于背侧与腹侧皮下注射经ATRA、Ad-VEGF、ATRA+Ad-VEGF处理后的MEFs。植入后5周行X线片观察、大体观察及组织学染色(Masson、HE及番红O-固绿染色),观察各组裸鼠体内异位成骨情况。结果成功分离培养MEFs;扩增后的Ad-RFP及Ad-VEGF成功转染MEFs,转染效率约为50%和20%。ALP活性检测示,单独使用ATRA或VEGF均能增强MEFs中ALP活性,且ATRA作用较VEGF强;ATRA和VEGF联合使用较单独使用显著增强了MEFs中ALP活性(P<0.05)。qRT-PCR检测示,ATRA联合Ad-VEGF使用上调了早期成骨分化相关标志物ALP、OPN、Ⅰ型胶原mRNA相对表达量(P<0.05);7 d时成血管相关标志物VEGF、EMCN及ANGPT1 mRNA相对表达量有所上升(P<0.05)。免疫组织化学染色示,ATRA联合Ad-VEGF不仅增强了OPN蛋白表达,VEGF蛋白表达在第7天也有所增强。茜素红染色示,单独应用ATRA或Ad-VEGF诱导钙盐沉积作用较弱,二者联合应用明显增强了MEFs成骨晚期钙盐沉积的效应。裸鼠体内植入实验结果显示,X线片观察发现与其余两组相比,ATRA+Ad-VEGF组存在明显骨块,且骨块体积较大,组织学染色可见大量胶原及成熟骨小梁、骨基质形成以及胶原骨组织。结论ATRA与VEGF联合应用能诱导MEFs定向成骨分化。     

四肢火器伤骨缺损修复方法的选择

分析了５６例四肢火器伤骨缺损的发生原因，总结了２８例吻合旋髂深血管的髂骨移植的优点及１５例吻合腓血管的长段腓骨移植的适应证和９例肩胛骨皮瓣移植方法的经验。强调指出半环槽式外固定架在四肢长骨火器伤骨缺损治疗中具有独特的优越性，它将成为四肢火器伤骨折、骨不连及骨缺损治疗的首选方法。     

前臂背侧血管分布特点与皮瓣设计

目的：通过成人前臂背侧血管的解剖学观测，为临床选用皮瓣提供依据。方法：用５０例上肢标本，对前臂背侧血管的分支分布和吻合进行详细的解剖学观察和分析。结果：骨间后动脉和骨间前动脉腕背支是前臂背侧的营养血管，动脉间以及与尺、桡动脉腕背支相吻合。结论：本研究为下述血管为蒂的三种逆行皮瓣，提供了可靠的解剖学依据：（１）以桡动脉腕背支为蒂前臂背侧中下段皮瓣；（２）以骨间前动脉腕背支的尺侧骨皮支为蒂前臂背侧中下段尺侧皮瓣；（３）以骨间前动脉腕背支的桡侧骨皮支为蒂前臂背侧中下段桡侧皮瓣。上述皮瓣可携带骨膜、骨质，用于手部创伤的修复。     

手术治疗胰体尾癌26例临床分析

目的探讨胰体尾癌外科治疗方法和根治性切除的影响因素。方法回顾性分析手术治疗26例胰体尾癌病例的临床病理资料。结果肿瘤侵犯横结肠者2例，脾脏者2例；侵犯脾动静脉14例，门静脉、肠系膜上静脉2例，肠系膜上动脉、腹腔干8例。肿瘤直径小于4cm11例，4—8cm13例，大于10cm2例，根治性切除组肿瘤直径平均为3．8cm（2例胰腺囊腺癌除外），姑息性切除组肿瘤直径平均为5．4cm。根治性切除18例，姑息性切除8例，胰体尾切除加脾切除24例，门静脉、肠系膜上静脉局部楔行切除修补2例，胰体尾切除加脾切除加横结肠切除2例。根治性切除组与姑息性切除组中位生存时间分别为18．6个月和10．3个月。结论积极行手术切除肿瘤是胰体尾癌患者获得长期生存的唯一途径，而肿瘤的大小、对重要血管和邻近脏器的侵犯程度是影响肿瘤能否根治性切除的重要因素。     

胰头癌的外科治疗

胰腺癌的发病率近年来有上升趋势 ,据国外资料 ,胰腺癌的发病率近 30年来已增加 3～ 7倍 ,如美国的发病率达 10 /10万人 ,已超过胃癌的发病率 ,其病死率占恶性肿瘤的第 4位。国内统计 ,胰腺癌发病率较低 ,但近年来也呈上升趋势 ,如上海市区 196 3年统计的发病率为 1.16 /10万人 ,1977年增至3 .8/10万人 ,1990年上升至 5 .1/10万人 ,1974年占恶性肿瘤的第 14位 ,至 1984年跃居于第 5位。中国医科大学一院 196 0年 1月至 1984年 12月 ,2 5年间共收治胰腺癌 36 0例 ,196 0年1月至 1972年 12月 13年间收治 86例 ,1973年 1月至 1984年12月 12年间…     

COMPARISON OF SPEED OF ONSET OF ANALGESIC EFFECT OF DIAMORPHINE AND MORPHINE

In a random, double-blind crossover trial using an ischaemiclimb pain model we have assessed the speed of onset of analgesiaafter an i.v. bolus of equipotent doses of diamorphine and morphinein 12 healthy male volunteers. Pain and its subsequent reliefwere assessed by means of a visual analogue scale. Two of thesubjects found diamorphine acted quicker than morphine, onefound no difference and nine found that morphine was quickerthan diamorphine. The mean time to diamorphine effect was 53%greater than for morphine (P < 0.005, Wilcoxon rank sum test).These findings suggest that, for rapid relief of pain, morphineis more suitable than diamorphine.     

Cajal间质细胞在大鼠"泻剂结肠"结肠肌电变化中的作用

目的　研究长期服用接触性泻剂对大鼠结肠肌电的影响 ,探讨Cajal间质细胞 (ICC)在“泻剂结肠”肌电变化中的作用。方法　 32只大鼠随机分为 2组 ,实验组饲以含酚酞饲料 ,3个月后测定结肠慢波频率及振幅 ;用碘化锌 锇酸法 (ZIO)观察肌间丛ICC变化 ,透射电镜观察肌间丛神经和ICC的超微结构变化。结果　“泻剂结肠”结肠慢波频率明显减慢 (P <0 .0 5 ) ,肌间丛ICC分布不均匀 ,突起连接杂乱 ;电镜下见肌间丛神经轴突空化 ,ICC样细胞变性。结论　长期服用酚酞可导致结肠慢波频率减慢 ,其可能机理为肌间丛神经及ICC变性所引起