冻存后大鼠睾丸组织精原干细胞的体外分离培养

目的 研究冻存的大鼠睾丸组织复苏后精原干细胞（SSCs）体外分离培养的生物学特性。方法 用二甲基亚砜（DMSO）作低温保护液，于液氮中冻存。4个月后复苏冻存的睾丸组织，进行SSCs的分离纯化，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层进行培养，并利用碱性磷酸酶（AKP）鉴定SSCs。结果 从冻存睾丸组织分离的精原干细胞在MEF饲养层上的正常形态、增殖能力与新分离的精原干细胞无明显不同。结论 大鼠睾丸组织的冷冻复苏并不影响精原干细胞其原有的生物学特性，包括其正常的贴壁、形态和增殖能力。     

脐血来源未成熟树突状细胞低温冻存的实验研究

目的观察脐血来源的未成熟树突状细胞(imDC)低温冻存前后的生物学特性,探讨imDC的保存方法。方法取新鲜脐血分离单个核细胞(MNC),在体外经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素(rhIL)4诱导产生imDC后,加入二甲亚砜(DMSO)作为保护剂,-80℃降温,-196℃保存,40℃水浴复温,获得冻存imDC。光学显微镜下观察冻存的imDC与新鲜imDC形态,计算其锥虫蓝拒染回收率(TBR);流式细胞仪检测细胞表面成熟标志;混合淋巴细胞反应(MLR)检测细胞刺激未致敏T淋巴细胞的增殖能力。结果脐血MNC在rhGM-CSF和rhIL-4诱导下可向树突状细胞(DC)分化,相差显微镜显示细胞形态不规则,细胞表面呈树枝样突起;扫描电镜显示,细胞表面不规则,有树枝样突起和不规则皱褶。冻存imDC复苏后TBR为(86．8±1．3)％,冻存imDC在形态上与新鲜imDC无明显差异。MNC体外经rhGM-CSF和rhIL-4诱导生成的imDC表面CD1a阳性率为(62±8)％、CD14为(18±7)％、人类白细胞DR抗原(HLA-DR)为(67±5)％、CD80为(13±7)％、CD86为(12±5)％;反映DC成熟的表面标志物CD83为(4．6±2．0)％,符合imDC的表型特征。冻存imDC的CD80、CD86、CD83分别为(15±5)％、(17±5)％、(7．4±3．3)％,较新鲜imDC有所增高(P<0．05),但仍符合imDC的表型特征。对照组MLR的每分钟放射性荧光闪烁计数(cpm)值为(488±197)min-1;新鲜imDC组为(463±104)min-1,与冻存imDC组的cpm值(512±78)min-1比较,差异无统计学意义(P>0．05)。各组细胞刺激指数(SI)均<2。新鲜imDC和冻存imDC均不能有效刺激同种未致敏T淋巴细胞增殖。结论本实验中获得的冻存imDC具有足够的细胞活力,其细胞免疫表型和细胞功能具有不成熟特征,说明利用DMSO低温保存imDC的方法可行。     

微重力培养提高冻存大鼠胰岛移植的效果

目的观察大鼠胰岛冻存后经三维微重力细胞旋转培养系统(RCCS)培养后移植给受者能否明显提高胰岛移植的效果。方法将分离纯化的大鼠胰岛分为3组。实验1组:即将胰岛在RCCS中培养3d后,悬浮于4℃低温保存液(HTS)中,放置30min,然后进行冻存步骤;冻存1个月后进行复苏,继续在RCCS中培养30d;实验2组:新鲜大鼠胰岛在RCCS中培养30d;对照组:大鼠胰岛在冻存前后均在普通培养基中培养,培养步骤和时间同实验1组。上述3组胰岛复苏后再按各组应用的培养体系培养7d,然后分别以2000IEQ冻存或新鲜胰岛移植入糖尿病大鼠体内,并观察10周。结果每个胰腺纯化后最多收获胰岛1058.47IEQ,最少411.88IEQ,平均(826.95±93.42)IEQ。实验1组、实验2组的胰岛收获率、细胞内胰岛素和DNA含量以及胰岛素刺激指数均高于对照组(P<0.05);实验2组和实验1组的2000IEQ新鲜胰岛或冻存胰岛在移植后1周内可100%纠正糖尿病。结论大鼠胰岛冻存前后经微重力培养后移植可以明显提高1型糖尿病大鼠的治疗效果。     

骨髓基质干细胞-80℃保存的初步研究

目的:探索适合于人骨髓基质干细胞-80℃冷冻保存的条件和方法。方法:体外分离培养人骨髓基质干细胞,以含不同浓度二甲亚砜的冻存液和不同细胞浓度-80℃深低温保存。3个月后复苏接种培养,观察细胞形态、存活率和贴壁率;通过3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入实验比较细胞分裂增殖能力;3H-脯氨酸(3H-Proline)掺入实验检测胶原合成能力;RT-PCR法检测Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达。结果:不同二甲亚砜浓度保存骨髓基质干细胞复苏后的细胞形态和功能有所不同,其中含5%二甲亚砜冻存液组保存效果最差,15%组最佳。15%二甲亚砜冻存液组复苏后骨髓基质干细胞的形态与未冻存组相似,存活率为(85%±3%),贴壁率为(81%±5%)。骨髓基质干细胞保持较强的分裂增殖和胶原合成能力,Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达与5%或10%二甲亚砜冻存液组比较有统计学差异(P<0.05)。冻存骨髓基质干细胞浓度为(5～10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组。结论:含15%二甲亚砜的冻存液适合于骨髓基质干细胞长期保存,高浓度组骨髓基质干细胞冻存效果优于低浓度组。     

不同冻存方法对大鼠脂肪来源干细胞生物学特性的影响

目的：研究不同冻存方法对脂肪来源干细胞（Adipose-derivedstemcells,ADSCs）生物学特性的影响。方法：体外分离培养SD大鼠腹股沟及附睾周围的脂肪组织,取第三代ADSCs冻存于液氮。实验分为三组：对照组A组为非冻存细胞,B组使用无血清非程序冻存液冻存细胞,C组使用传统冻存液（DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1）冻存细胞。12个月后复苏ADSCs,通过对比ADSCs的表面抗原、细胞凋亡、增殖及成骨分化情况,分析各组ADSCs生物学性能的差异。结果：各组细胞高表达CD29、CD90;A、B两组细胞的凋亡率显著低于C组（P<0.05）;B、C两组的增殖情况和A组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,B组细胞的成骨分化能力要优于C组（P<0.05）。结论：无血清非程序冻存液冻存ADSCs的效果要优于传统冻存液。     

汗腺样细胞经冻存复苏后再生汗腺功能的研究

目的:研究由人脐带间充质干细胞(UCMSCs)分化而来的汗腺样细胞在冻存与复苏后的生物学活性与促汗腺再生能力.方法:分离培养人UCMSCs 和人汗腺细胞,通过两种细胞共培养方式促进UCMSCs向汗腺细胞分化.分化后的干细胞经冻存、复苏处理后,局部移植于裸鼠烫伤脚掌,通过组织学观察和发汗试验观察汗腺组织再生修复情况.结果...     

成纤维细胞体外培养、冻存及复苏的实验研究

目的：探讨正常皮肤和瘢痕疙瘩组织成纤维细胞在体外培养情况下其生物学特性的差异，以及与细胞冻存和复苏的方法及其应用价值。方法：对8例正常皮肤和8例瘢痕疙瘩组织标本分别进行体外成纤维细胞的原代培养、传代培养，观察培养的成纤维细胞形态，并作生长曲线比较细胞增殖情况。选取处于对数生长期的培养细胞梯度降温后置入液氮（-196℃）中保存4—6个月，进行细胞复苏培养，以2％台盼蓝确定细胞活力，并观察复苏的成纤维细胞形态学状况。结果：体外培养的正常皮肤和瘢痕疙瘩组织成纤维细胞形态和生长曲线基本相同，但瘢痕疙瘩原代成纤维细胞萌出生长较正常皮肤快，生长融合后成纤维细胞排列紊乱，极性消失，有明显的交叉重叠现象；体外培养的成纤维细胞，经冷冻保存4～6个月后，复苏率超过80％，细胞形态无明显改变。结论：体外培养的正常皮肤和瘢痕疙瘩组织成纤维细胞形态与生长特性基本相同。瘢痕疙瘩成纤维细胞可成功冻存和复苏。     

深低温冷冻肌腱细胞活性的研究

目的研究深低温冷冻方法对肌腱细胞活性的影响,比较程序性降温和普通深低温冷冻法对腱细胞活性的影响.方法纯种SD大鼠24只（出生21 d）,随机分为3组,取双侧跟腱.新鲜肌腱对照组（A）,常规深低温冷冻组（B）,程序性降温深低温冷冻组（C）.采用相同的方法对3组肌腱细胞进行细胞培养.相差显微镜观察原代和传代后细胞的生长,绘制细胞的生长曲线,考察细胞的活性;对细胞进行成纤维细胞染色、胶原染色和对细胞进行形态观察（扫描电镜）;水解法定量分析细胞培养基中羟脯氨酸浓度的变化,检测细胞合成胶原的能力.结果原代细胞培养时A组细胞的生长速度快于B组和C组（P＜0.01）,C组细胞的生长速度快于B组（P＜0.01）,这种生长速度的差异在细胞传代后消失.细胞的形态学和组织学符合成纤维细胞形态.3组细胞培养基中羟脯氨酸浓度变化的差异无统计意义（P＞0.05）.结论经深低温冷冻处理的肌腱中仍存在具有活性的腱细胞,但数量显著少于新鲜肌腱中活细胞的数量.应用计算机控制程序性慢速降温方法处理的肌腱其活细胞的数量有所提高,但仍低于新鲜肌腱中活细胞的数量.     

人胎儿毛囊隆突细胞的培养方法及其向皮脂腺细胞诱导分化的初步研究

目的探讨简单快捷地获得大量人毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性的方法,观察其向皮脂腺细胞分化的可行性。方法用传统的器械分离法(简称传统法)和改进的消化分离法(简称改良法)对人胎儿毛囊隆突细胞进行分离培养,比较两种方法的细胞获得效率和细胞生长特性。在对毛囊隆突细胞进行诱导培养后,行抗上皮膜抗原(EMA)抗体免疫组织化学染色,以检测细胞EMA的表达情况。噻唑蓝(MTT)法检测细胞克隆形成率。用亲和素-生物索复合物(ABC)标记法行毛囊隆突细胞角蛋白19(K19)染色。结果传统法每小时可获得8～10个毛囊隆突,贴壁48h后有细胞长出,贴壁率为40%～50%,培养14d左右传代；改良法每小时可获得毛囊隆突100个左右,接种后12h即可贴壁并有细胞长出,贴壁率30%,细胞生长迅速,7d左右即可传代。毛囊隆突细胞诱导培养7d后,细胞体积变大,随着时间延长,细胞进一步变大,细胞质中有脂滴样颗粒围绕在核的周围,细胞形状不规则。诱导培养14d后,抗EMA抗体免疫组织化学染色呈阳性表达。改良法的细胞克隆形成率为(18．2±2．1)%,明显高于传统法[(12．7±3．4)%,P＜0．05]。毛囊隆突细胞K19免疫组织化学染色呈阳性,其细胞分布满视野,细胞质内含有大量棕色颗粒。结论改良法可以获得大量毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性,在体外诱导条件下,具有向皮脂腺细胞分化的潜能。     

人脐带来源Muse细胞培养、筛选、鉴定及其移植治疗大鼠脊髓损伤

目的:应用免疫磁珠筛选方法从人脐带华通胶间充质基质细胞中特异性地分选多系分化持续应激细胞(multilineage-differentiating stress-enduring,Muse),并探讨Muse细胞移植治疗大鼠亚急性脊髓损伤的安全性和有效性。方法:将捐赠的脐带华通胶剥离剪碎、胶原酶/胰酶消化、密度梯度离心获得足量间充质基质细胞,应用免疫磁珠特异性筛选SSEA3+的Muse细胞,并使用流式细胞仪及细胞免疫组织化学方法鉴定。体内实验:使用NYU-Ⅲ代大鼠脊髓损伤打击仪建立垂直打击脊髓损伤模型,分为A组(假手术组)、B组(对照组)、C组(Non-Muse细胞移植组)和D组(Muse细胞移植组)。A组大鼠接受标准化的椎板切除手术,但不进行脊髓打击;B、C、D组大鼠均接受标准化的脊髓打击损伤,10 g撞击杆于12.5 mm高度自由落下。脊髓损伤造模后2周进行细胞移植,A组大鼠仅打开伤口不接受移植操作,B、C、D组大鼠分别接受PBS注射、Non-Muse细胞移植、Muse细胞移植,每只大鼠脊髓接受四点注射法,共4×105个细胞。自脊髓损伤造模术后1 d及1、2、3、4、5、6周分别进行大鼠BBB运动功能评分,造模术后6周(即细胞移植后4周)处死动物,用免疫荧光染色研究大鼠脊髓内移植细胞存活、迁移和分化情况。结果:流式细胞仪显示脐带间充质基质细胞CD105+、CD90+和CD73+的百分比均达到99.5%以上,且CD45、CD14表达均低于0.5%,而SSEA3阳性率仅有1.46%。MACS特异性筛选后的细胞群有92.0%同时表达SSEA3和CD105,且免疫组织化学显示SSEA3呈典型的膜染色、形态特别。动物实验:A组动物在各个时间点的BBB评分均为21。单因素方差分析及LSD检验BBB评分情况:细胞移植后6周,C、D组与B组比较差异均有统计学意义(P=0.004,0.002),C组和D组比较差异无统计学意义。进一步组内配对t检验表明,C组第4周与第3周比较差异有统计学意义(P=0.005);D组第4周与第3周比较差异有统计学意义(P=0.016),且第6周与第5周比较差异有统计学意义(P=0.034),说明大鼠运动功能持续改善。脊髓免疫组织化学染色显示,Muse细胞和Non-Muse细胞均由注射点向损伤区迁移,但Muse细胞存活数量明显多于Non-Muse细胞,且在损伤区均匀分布。结论:特异性免疫磁珠筛选是获得高纯度Muse细胞的良好高效的方法,Muse细胞可在大鼠损伤脊髓内大量存活4周并向损伤区迁移,且能持续改善大鼠运动功能,Muse细胞有望成为治疗脊髓损伤的一种新的种子细胞。     

不同胚龄人神经干细胞的分离和培养

目的 探索不同胚龄人神经干细胞分离和培养的适宜条件。方法 在多种培养条件下，采用无血清培养和单细胞克隆技术，从7周和13周人胚脑中分离和培养神经干细胞，应用免疫荧光染色予以鉴定。结果 从两个不同胚龄的人胚脑中分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，未包被组7周的人胚脑除高密度县浮培养法生长不良，其它密度及培养法均有克隆球形成；13周的人胚脑仅中等密度悬浮培养法及高密度贴壁培养法有克隆球形成；包被组各种密度培养均生长不良。结论 人胚脑中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞，随着胚龄增大，培养难度逐渐加大，高密度贴壁培养法适宜各胚龄神经干细胞的分离培养。     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的：研究人胚胎神经干细胞的培养条件及体外分化情况。方法：从12周龄人胚胎脑皮质分离细胞，采用无血清培养技术，协同应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(ECF)和重组人白血病抑制因子(rhLIF)进行培养；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记检测细胞的增殖能力，间接免疫荧光化学法检测细胞的分化情况。结果：培养得到的大量半悬浮生长的神经干细胞球能够传代培养；BrdU标记阳性，可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论：人胚胎脑皮质分离细胞培养得到的细胞群具有神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

Isolation and primary culture of urothelial cells from normal human bladder

Summary Trypsinization (WT) was employed to disaggregate urothelial cells from normal human urinary bladder mucosa for the preparation of primary cultures. Urinary bladders of two male adults both 25 years old were obtained autopsy 1–2 h after death. The mucosa was incubated in HBSS containing 0.25% trypsin at 37°C. Mean cell yield, viability, and attachment were 14.6×10⁷, 76%, and 42.5% after WT. In histologic sections of treated mucosa, most of the urothelium was removed by WT. Following plating and attachment, cells obtained by WT formed a monolayer of flattened epithelial-like cells. When stained with polyclonal antikeratin antibody using the indirect immunoperoxidase technique, all of the cells were immunoreactive indicating an epithelial origin. In conclusion, based on morphology and immunocytochemistry, WT removed virtually all of the urothelial cells from the mucosa and no contamination by mesenchymal cells resulted from this procedure. Thus, WT is an appropriate technique for the isolation of urothelial cells and initiation of primary cultures of normal human urothelial cells for subsequent study.This work was supported by NIH Grant CA-28013     

脊髓损伤局部表达NgR的巨噬细胞的体外分离培养

目的从脊髓损伤局部分离培养巨噬细胞,并鉴定其表达Nogo受体（Nogo receptors,NgR）情况。方法胰酶消化大鼠损伤脊髓组织获取其脊髓损伤局部巨噬细胞,细胞贴壁后用添加5％胎牛血清的RPMI 1640培养,显微镜下观察巨噬细胞形态及生物学特点,免疫荧光化学方法鉴定其是否表达CD68及NgR。结果原代培养的臣噬细胞贴壁生长,细胞形态呈圆形、椭圆形等,可存活约3周,表现为CD68抗原阳性,多数细胞NgR抗原阳性。,结论成功地从脊髓损伤局部分离出巨噬细胞,多数细胞表达NgR抗原。     

非接触式共培养体系对脐带间充质干细胞向类髓核细胞的诱导分化效应

目的探讨人脐带间充质干细胞向类髓核细胞的分化潜能,为椎间盘退变性疾病的生物学治疗探索新的细胞来源。方法取人正常足月产婴儿脐带及成人椎间盘,分离消化华通胶组织和髓核组织,收集培养脐带间充质干细胞及成人髓核细胞。利用带有插入层的Transwell 6孔培养板进行细胞非接触式共培养,细胞比例为1∶1,以脐带间充质干细胞单独培养作为对照组。共培养1周后,提取脐带间充质干细胞总RNA,利用Real-Time PCR检测其Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX9基因的相对表达改变。结果成功分离提取脐带间充质干细胞;Real-Time PCR检测结果显示实验组脐带间充质干细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因相对表达较对照组显著增加,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论人脐带间充质干细胞能够被髓核细胞诱导分化为类髓核细胞,有可能为椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供一种新的细胞来源。     

婴幼儿血管瘤内皮细胞的分离、培养及鉴定

目的 建立一个稳定的婴幼儿血管瘤内皮细胞体外培养体系.方法 增生期血管瘤标本经胶原酶消化,CD31-免疫磁珠分选纯化细胞,接种于纤维蛋白铺层的培养皿;分别行细胞形态学观察、细胞生长曲线的测定、培养细胞免疫荧光鉴定、低密度脂蛋白吸收试验.结果 从血管瘤组织分离纯化出CD31+细胞,4 h开始贴壁,细胞呈梭形,7～10 d生长融合呈铺路石状,CD31-免疫磁珠黏附于细胞上.血管瘤内皮细胞CD31、vWF表达阳性,可摄取低密度脂蛋白.结论 我们建立的婴幼儿血管瘤内皮细胞的分离培养方法,可获得血管瘤内皮细胞,并为血管瘤增生消退机制的研究奠定了细胞学基础.     

脊髓损伤局部表达NgR的巨噬细胞的体外分离培养

目的 从脊髓损伤局部分离培养巨噬细胞,并鉴定其表达Nogo受体(Nogo receptors, NgR)情况.方法 胰酶消化大鼠损伤脊髓组织获取其脊髓损伤局部巨噬细胞,细胞贴壁后用添加5%胎牛血清的RPMI 1640培养,显微镜下观察巨噬细胞形态及生物学特点,免疫荧光化学方法鉴定其是否表达CD68及NgR.结果 原代培养的巨噬细胞贴壁生长,细胞形态呈圆形、椭圆形等,可存活约3周,表现为CD68抗原阳性,多数细胞NgR抗原阳性.结论 成功地从脊髓损伤局部分离出巨噬细胞,多数细胞表达NgR抗原.     

人胚嗅球嗅鞘细胞及人胚鼻粘膜嗅鞘细胞的分离培养与纯化

[目的]采用差速贴壁法及免疫组化对人胚嗅粘膜OECs及人胚嗅球OECs进行体外纯化培养,探讨建立嗅粘膜OECs及嗅球OECs体外培养的方法.[方法]对差速贴壁后的人胚嗅粘膜OECs及嗅球OECs分别交替应用含13％胎牛血清DMEM - F12培养基进行原代培养.观察嗅鞘细胞的形态学变化,采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.[结果]人胚嗅粘膜及人胚嗅球均可培养出嗅鞘细胞,嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养时人胚嗅球嗅鞘细胞纯度比人胚嗅粘膜嗅鞘细胞高.[结论]差速贴壁法可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞及人胚嗅球嗅鞘细胞.     

成人鼻腔嗅黏膜嗅鞘细胞的分离、培养与纯化

目的自成人鼻腔嗅黏膜中培养纯化嗅鞘细胞，并进行免疫细胞化学鉴定，探讨嗅黏膜中嗅鞘细胞的培养方法。方法取成人嗅黏膜，采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞，并采用免疫细胞化学法进行形态学观察。结果通过纯化，可获得纯度约为75％的嗅鞘细胞，并表达P75NGFr，光镜下细胞形态以带有细长突起的双极细胞及三极细胞为主，有少量的扁平“煎蛋样”细胞。结论自成人鼻腔嗅黏膜可成功分离培养出嗅鞘细胞，为开展自体嗅黏膜嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤提供了技术与方法。