葛根素对肾癌GRC-1 细胞多药耐药的逆转作用

目的探讨葛根素对肾癌GRC-1细胞多药耐药的逆转作用。方法体外培养GRC-1人肾细胞癌株,并分为空白对照组、阿霉素处理组（10mg·L^-1ADM）、葛根素处理的对照组（0．48g．L^-1Pur）、阿霉素联合葛根素处理组（10mg．L^-1ADM＋0．24g·L^-1Pur或10mg．L^-1ADM＋0．48g．L^-1Pur）,药物处理24h后,采用细胞毒性实验检测GRC-1细胞的生存率,用流式细胞术（Annexin-V／PI双标记）及TUNEL法检测细胞的凋亡情况。结果以对照组细胞生存率为100％,ADM组细胞生存率为（69．7±0．04）％,显著低于对照组（P〈0．05）,经0．12、0．24和0．48g．L^-1Pur联合用药后,细胞生存率分别为（70.1±0．03）％、（63．2±0．02）％和（42.1±0．04）％,均明显低于空白对照组（P〈0.05）,且0．24和0．48g．L^-1Pur联合用药的细胞生存率显著低于ADM处理组（P〈0.05）;012和0.24g．L^-1Pur单独用药的细胞生存率分别为（97．4±0．02）％和（90．1±0．01）％,与对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）,而0．48g．L^-1Pur单独用药的细胞生存率为（75．0±0.03）％,显著低于空白对照组（P〈0.05）。此外,与空白对照组相比,0．24和0．48g·L^-1Pur处理细胞后,细胞凋亡率明显升高（P〈0．05）,且随Pur剂量增加而升高;而0.24和048g·L^-1Pur联合用药组细胞凋亡率均明显高于ADM组（P〈0．05）。结论葛根素可有效促进肾癌GRC-1细胞的凋亡,并可减轻GRC-1细胞对阿霉素的耐药性.     

hIAP-2-siRNA 对hepG2 肝癌细胞抑制作用

目的合成凋亡抑制蛋白（hIAP-2）的si-RNA,观察其对hepG2细胞增殖、凋亡的影响。方法化学合成三条hIAP-2-siRNA干扰片段并用脂质体法转染hepG2细胞,同时设立脂质体对照。RT-PCR和western blotting检测hIAP-2-siRNA作用后hIAP-2mRNA和蛋白的表达,MTT检测细胞增殖,AV-PI流式细胞术检测细胞的凋亡。结果 RT-PCR及Western blootting检测显示3条siRNA均能有效抑制hIAP-2mRNA及蛋白表达（P〈0.05）,以siRNA1作用效果最显著（P〈0.05）。MTT检测显示hIAP-2-siRNA80nmoL·L-1终浓度转染后的hepG2细胞的增殖受到显著抑制（P〈0.01）,其中以80nmoL·L-1转染72h时增殖性下降最明显（P〈0.01）。流式细胞术检测结果显示hIAP-2-siRNA转染hepG2细胞后凋亡率增加（P〈0.05）。结论 hIAP-2-siRNA可明显抑制该肿瘤细胞的增殖,促进hepG2肝癌细胞的凋亡。     

原花青素联合Apollon siRNA抑制肝癌HepG2细胞增殖及凋亡

目的研究原花青素联合凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族成员Apollon小干扰RNA(small interfer-ence RNA,siRNA)对人肝癌(HepG2)细胞增殖、凋亡的影响。方法设计并合成Apollon siRNA的序列,将一定浓度的人工合成的Apollon siRNA经脂质体包裹转染肝癌(HepG2)细胞,运用实时荧光定量RT-PCR检测Apollon mRNA的表达水平,蛋白质免疫印记技术检测Apollon的蛋白表达水平,并筛选出Apollon siRNA的有效序列,并进一步联合不同浓度的原花青素作用于肝癌(HepG2)细胞48 h后,采用WST-8法检测单用Apollon siRNA、单用原花青素、及Apollon siRNA联合原花青素对肝癌细胞增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞早期凋亡率;Hoechst 33258染色观察HepG2细胞凋亡形态。结果设计的三对Apollon siRNA序列,筛选出其中有一对(NO.2)能明显下调Apollon mRNA与蛋白的表达水平,Apollon siRNA联合原花青素作用于HepG2细胞48 h后,单用原花青素的IC50为25.24 mg.L-1;Apollon siRNA与原花青素联合使用,原花青素的IC50为9.99 mg.L-1,增敏倍数为2.53,表现为协同作用。流式细胞术检测结果显示:Apollon siRNA联合原花青素能促进HepG2细胞凋亡,其早期凋亡率达25.2%;经荧光显微镜观察,Apollon siRNA组可见核高强度荧光的细胞,并见凋亡小体。结论 Apollon siRNA可增强肝癌细胞对原花青素的敏感性,作用机制可能为共同促进肝癌细胞早期凋亡有关,为临床上肝癌的治疗提供理论基础。     

Livin基因和Survivin基因联合靶向siRNA抑制大肠癌细胞增殖的作用

采用1个载体编码2个shRNA技术, 构建Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体, 研究其对人大肠癌细胞生长协同抑制的增效作用。构建Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体并转染大肠癌细胞, 通过RT-PCR和Western blotting方法检测Livin基因与Survivin基因的表达, 利用流式细胞仪检测处理后细胞的凋亡效应。经酶切鉴定和测序分析证实Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功, 它对大肠癌细胞Livin和Survivin mRNA的抑制率分别为27.90%和32.24%, 对Livin和Survivin蛋白表达的抑制率分别为22.28%和40.86%, 诱导肿瘤细胞凋亡率为 (11.69 ± 1.37) %, 但协同干扰作用比单独干扰Livin基因或Survivin基因弱。Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功并能抑制Livin基因和Survivin基因的表达, 但协同抑制作用比单独干扰Livin基因或Survivin基因弱。     

c-Myc靶向小分子干扰RNA抑制人直肠癌Colo320细胞增殖的实验研究

目的：利用小分子干扰RNA（siRNA）技术抑制人直肠癌Colo320细胞c-Myc基因的表达。为研究c-Myc基因在人直肠癌Colo320细胞中的作用提供一个新的方法。方法：设计人直肠癌Colo320细胞基因特异性小分子干扰RNA，用体外转录方法合成人直肠癌Colo320细胞基因的小分子干扰RNA并转染人直肠癌Colo320细胞，培养48—96h后，收集细胞RNA应用实时荧光定量RT—PCR方法检测转染细胞中c-Myc基因mRNA水平变化，骶temblot检测C—MYC蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT法）和集落形成实验检测细胞增殖活性。结果：转染siRNA后，与对照组相比，实验组pGensil—c—Myc-14的c-Myc基因mRNA水平明显降低，MTT法和集落形成实验表明实验组的增殖速率明显低于对照组的增殖速率。结论：在人直肠癌Colo320细胞中存在RNA干扰的机制，特异性siRNA能够有效的抑制c-Myc基因的表达，为研究c-Myc基因在肿瘤细胞中的调节途径提供了一个新的方法。     

靶向Ccnd1基因的siRNA对大鼠晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的探讨靶向Ccnd1基因小干扰RNA(si RNA)对培养的大鼠晶状体上皮细胞(LECs)Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1表达及细胞增殖的抑制作用。方法合成3条靶向大鼠Ccnd1基因的siRNA(si-Ccnd1-1,si-Ccnd1-2,si-Ccnd1-3),LipofectamineTM2000转染体外培养的大鼠LECs,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1表达变化,筛选最有效si RNA序列。MTT法连续测定转染最有效si RNA序列后24、48、72、96和120 h细胞增殖情况。结果与对照组相比,3条si RNA均能不同程度地抑制Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1的表达,以si-Ccnd1-3最为有效(P<0.05)。与对照组比较,si-Ccnd1-3转染后24 h开始明显发挥对细胞增殖的抑制作用,并持续至120 h以后(P<0.05)。结论靶向Ccnd1的si RNA能有效降低大鼠LECsCcnd1 mRNA和周期蛋白D1蛋白表达,抑制LECs增殖。     

曲古抑菌素A对肾癌细胞系GRC-1生长的抑制作用

目的 研究组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制药曲古抑菌素A(TSA)对肾癌GRC-1细胞生长的影响及其作用机制. 方法使用TSA处理GRC-1细胞. 噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长;流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期;Western blot免疫印迹分析p53,p21和bcl-2表达. 结果 TSA能明显抑制GRC-1细胞的增殖,且具有明显的剂量依赖性;TSA处理72 h的GRC-1细胞早期凋亡率明显提高,G0/G1期细胞比例显著升高,S期细胞比例显著降低. TSA能够明显下调bcl-2的表达,上调p21的表达,而对p53的没有显著影响. 结论TSA可以通过诱导肾肿瘤细胞的凋亡和周期阻滞而抑制癌细胞生长;其发生机制可能与下调抗凋亡基因bcl-2和上调肿瘤抑制基因p21的表达有关,TSA可能依赖非p53途径调控p21的表达.     

靶向KDR siRNA与5-氟尿嘧啶对PC3细胞增殖的协同抑制

目的研究以KDR为靶标的小干扰RNA(siRNA)与化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)联合应用抑制PC3细胞增殖的作用。方法已构建了Psilencer3.1-KDR siRNA表达载体,采用脂质体介导的基因法转染PC3细胞,MTT法检测细胞生长速度的变化和流式细胞仪检测细胞周期的变化,以未转染和转染阴性对照质粒pSilencer3.1-NC的PC3细胞为对照,MTT法检测细胞在含5-FU[(0～1.56×106)nmol/L]的培养液中48h后的生存率,并计算IC50。结果转染pSilencer3.1-KDR后PC3细胞生长速度明显变慢,PC3细胞的G0/G1期百分率明显增高,而S期和G2、M期的细胞减少,与其余组相比具有统计学差异(P<0.01)。MTT结果显示,pSilencer3.1-KDR细胞组5-FU的IC50,为(898.34±44.34)nmol/L(P<0.01)。结论 KDRsiRNA与5-FU联用,可显著增强对PC3细胞增殖的抑制,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

靶向P75NTR的siRNA技术诱导U251胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的:利用靶向P75神经营养因子受体(P75NTR)基因的小干扰(siRNA)技术诱导胶质瘤凋亡.方法:利用脂质体介导P75NTR-siRNA质粒转染U251胶质瘤细胞系,RT-PCR方法检测P75NTR的mRNA表达以确定基因沉默效果,绘制细胞生长曲线,原位细胞凋亡实验检测细胞凋亡情况,Western blot方法检测稳定转染后第3天时P75NTR、促凋亡基因Caspase-3和凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表达.结果:转染P75NTR siRNA质粒后U251细胞P75NTR的mRNA表达水平显著下降,细胞增殖能力下降,凋亡细胞数量增加.与对照组和空载组比较,P75NTR与Bcl-2在RNAi组蛋白表达水平显著降低,Caspase-3则明显升高.结论:靶向P75NTR的siRNA技术可通过调控凋亡相关基因表达机制诱导胶质瘤细胞凋亡.     

siRNA-DAD1联合人参皂苷Rh 2对肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨基因沉默DAD1 联合人参皂苷Rh2 对肝癌细胞增殖和凋亡的作用机制。方法　化学合成siRNADAD1,然后转染肝癌SMMC-7721 细胞,分别采用Q-PCR 和Western blot 检测DAD1 的mRNA 及蛋白表达水平变化,CCK-8 法检测肝癌SMMC-7721 细胞增殖能力的改变,DNA Ladder 法和流式细胞术检测肝癌SMMC-7721 细胞凋亡的变化。结果　siRNA-DAD1 可下调肝癌SMMC-7721 细胞中DAD1 的mRNA 及蛋白表达水平;siRNA-DAD1 与人参皂苷Rh2 均具有抑制SMMC-7721 细胞增殖的能力,并促使其发生凋亡,二者联合作用效果更好（P<0.05）。结论　siRNADAD1可下调肝癌SMMC-7721 细胞中DAD1 的mRNA 和蛋白表达水平,与人参皂苷Rh2 协同抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖并促进其凋亡。     

抑制IGF2基因的siRNA表达载体对肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用

目的:研究抑制人胰岛素样生长因子2(IGF2)基因的siRNA表达载体对肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用。方法:将重组人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)双启动子调控抑制IGF2基因的siRNA表达载体pGL3-h AFP-hTERT-siRNA3(简称siRNA3)转染Huh-7细胞和正常肝L-02细胞,另设阴性对照(载体p GL3-hAFP-hTERT)组和空白对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞转染48 h后IGF2 mRNA表达;酶标仪检测转染0、24、48、72 h后的细胞活性;流式细胞仪检测转染48h后细胞周期、细胞凋亡;Western blot法检测细胞IGF2、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin)E2、Cyclin D2、Cdc2、Bcl-2蛋白表达水平。结果:与阴性对照组和空白对照组比较,转染siRNA3的Huh-7细胞中IGF2 mRNA表达明显减弱,转染48、72 h后Huh-7细胞活性明显降低,G1期Huh-7细胞明显增加,S期Huh-7细胞明显减少;Huh-7细胞早期、晚期及总凋亡百分比均明显增加,IGF2、PCNA、Cyclin E2、Cyclin D2、Cdc2和Bcl-2蛋白表达均明显减弱,以上差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。转染siRNA3表达载体的L-02细胞上述指标均无明显变化(P>0.05)。结论:重组hAFP和hTERT双启动子调控针对IGF2基因的siRNA可特异性抑制Huh-7细胞IGF2表达及细胞增殖,其可能与下调IGF2 mRNA及蛋白表达,进而引起细胞增殖相关基因PCNA、细胞周期调控相关基因Cyclin E2、Cyclin D2、Cdc2及细胞凋亡调控相关基因Bcl-2蛋白表达下调有关。     

siRNA干扰MT1H基因对肝癌HEPG2/ADM细胞耐药性的影响

目的探讨siRNA干扰金属硫蛋白1H（metallothionein 1H，MT1H）基因逆转HEPG2／ADM细胞耐药的可行性。方法将针对MT1H的siRNA导入肝癌耐阿霉素细胞株HEPG2／ADM中；用RT—PCR方法分析MT1H基因表达情况；Western blot检测MT1H蛋白的表达，MTT法观察细胞阿霉素耐药性；TUNEL检测阿霉素诱导细胞凋亡率。结果HEPG2／ADM细胞转染MT1H siRNA48h后，与对照组比较，MT1H siRNA转染组MT1H成部分mRNA和蛋白表达均表达明显下调，细胞对ADM的药物敏感性明显提高，ADM诱导凋亡率明显增加。结论MT1H siRNA能降低MT1H的表达，增强阿霉素对HEPG2／ADM细胞凋亡诱导作用，有效逆转HEPG2／ADM细胞耐药。     

siRNA靶向沉默人多梳基因2对鼻咽癌细胞增殖及细胞周期的影响

目的 探讨siRNA沉默人多梳基因2(HPC2)对5-8F鼻咽癌细胞增殖的作用和细胞周期的影响.方法 用RNAi MAX将靶向HPC2的siRNA转染入鼻咽癌细胞5-8F,实验分scrambled阴性对照组,#1 siRNA-HPC2组,#2 siRNA-HPC2组,用CCK8法比较细胞增殖活力,平板克隆实验比较增殖能...     

Bcl-2 siRNA抑制HL-60细胞bcl-2基因表达

目的应用RNA干扰技术观察Bcl2siRNA对白血病细胞HL60中bcl2基因表达的影响,探讨siRNA技术在白血病治疗中的作用。方法利用化学合成法体外化学合成Bcl2siRNA,将Bcl2siRNA与HL60细胞共孵育,用MTT法、荧光染色观察细胞增殖及凋亡情况,用RTPCR检测Bcl2mRNA水平,用荧光染色测Bcl2蛋白水平。结果Bcl2siRNA与HL60细胞共孵育48h后,HL60细胞凋亡率增加,Bcl2mRNA水平下调,Bcl2蛋白表达水平降低。转染GAPDHsiRNA组的细胞对Bcl2表达无影响。结论Bcl2siRNA能够特异性降低Bcl2mRNA水平及蛋白质的表达,促进HL60细胞凋亡。     

靶向Ccndl基因的siRNA对大鼠晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的 探讨靶向Cendl基因小干扰RNA(siRNA)对培养的大鼠晶状体上皮细胞(LECs)Ccndl mRNA和周期蛋白D1表达及细胞增殖的抑制作用.方法 合成3条靶向大鼠Ccndl基因的siRNA(si-Ccndl-1,si-Ccndl-2,si-Ccndl一3),LipofectamineTM2000转染体外培养的大鼠LECs,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测Ccndl mRNA和周期蛋白D1表达变化,筛选最有效siRNA序列.MTT法连续测定转染最有效siRNA序列后24、48、72、96和120 h细胞增殖情况.结果 与对照组相比,3条siRNA均能不同程度地抑制Ccndl mRNA和周期蛋白D1的表达,以si-Ccndl-3最为有效(P<0.05).与对照组比较,si-Ccndl-3转染后24 h开始明显发挥对细胞增殖的抑制作用,并持续至120 h以后(P<0.05).结论 靶向Ccndl的siRNA能有效降低大鼠LECsCcndl mRNA和周期蛋白D1蛋白表达,抑制LECs增殖.     

RNA干扰靶向cyclin D1基因对K562细胞化疗增敏的研究

目的 cyclin D1基因在细胞周期调控中起关键性作用.研究表明其过表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关;并且与肿瘤细胞对化疗药物抗拒性有关.抑制Cyclin D1蛋白表达可达到化疗增敏作用.本研究利用RNA干扰(RNAi)技术体外观测其对K562细胞cyclin D1基因的沉默效应及增强阿霉素(ADM)对K562细胞毒性作用.方法 体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒,通过壳聚糖介导转染K562细胞,Western blot分析检测转染前后Cyclin DI蛋白表达变化,流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率的影响以及MTT法检测K562细胞对ADM敏感性的变化.结果 构建靶向cyclin D1基因的shRNA表达质粒(pshRNA-419和pshRNA-575)经壳聚糖转染后,能显著抑制cyclin D1基因表达;影响K562细胞周期分布,诱导细胞凋亡,并降低ADM半数抑制浓度,提高了化疗敏感性.而设计一碱基突变的序列所构建的质粒并无上述生物学效应.结论 沉默K562细胞cyclin D1基因表达可达到有效的化疗增敏目的.     

siRNA介导的hPOT1基因表达抑制对HeLa细胞凋亡的影响

目的　应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,特异地抑制端粒保护蛋白hPOT1基因在HeLa细胞中的表达,并观察其对细胞凋亡的影响。方法利用先前构建的含hPOT1基因特异性序列(hsRNA)的3种重组siRNA表达质粒,由脂质体介导转染HeLa细胞,以RT PCR和电泳迁移率变化分析法检测转染细胞中的hPOT1基因的表达抑制效果,并通过流式细胞术、Hoechst荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果　不同hPOT1特异性序列的3种的重组质粒转染HeLa细胞4 8h后,细胞中hPOT1基因mRNA和蛋白质表达水平降低,细胞凋亡水平明显增加。结论　siRNA表达载体介导的RNAi能有效地抑制HeLa细胞中hPOT1基因表达,hPOT1基因表达下调导致HeLa细胞凋亡     

沉默MALAT1基因对蜂毒素诱导HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨沉默HepG2细胞株中MALAT1基因对蜂毒素诱导的细胞增殖抑制和凋亡的影响。方法采用MTT法检测蜂毒素对HepG2细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞凋亡率;qPCR法检测HepG2细胞中MALAT1基因的表达;采用特异性siRNA对HepG2细胞的MALAT1基因进行沉默;比较单独用蜂毒素处理和给予蜂毒素同时沉默MALAT1的细胞增殖抑制率和凋亡率变化。结果蜂毒素明显抑制HepG2细胞的增殖并促进细胞凋亡,呈浓度依赖性;和正常肝细胞株L0-2相比,MALAT1 mRNA在HepG2细胞中存在高表达(P<0.05);蜂毒素可下调细胞中MALAT1的表达,并随着浓度的增加抑制率升高;给予蜂毒素同时沉默MALAT1的研究组中,细胞增殖抑制和凋亡率都明显高于单独给予蜂毒素组(P<0.05)。结论蜂毒素可下调HepG2细胞株中MALAT1的表达,且沉默MALAT1可促进蜂毒素诱导的HepG2细胞增殖抑制和凋亡。     

siRNA沉默CD147基因对肝癌细胞的影响

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默CD147基因在肝癌细胞HepG2中的表达,探讨CD147基因对肝癌细胞生长、凋亡的影响.方法 根据CD147 cDNA序列设计具有短发夹结构的两条DNA序列,与载体pSileneerTM4.1-CMV neo构建重组表达载体,鉴定后转染至HepG2细胞,Western blotting法检测抑制效果,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况.结果 成功构建了针对CD147基因表达的干扰质粒,有效抑制了HepG2细胞增殖,促进了HepG2细胞凋亡.结论 CD147靶向RNA干扰重组表达栽体为肝癌的基因治疗提供了可能.