动态张、压应力刺激下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架变化

目的:观察不同动态张、压应力刺激下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的变化.方法:用Forcel四点弯曲加载装置对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态的张、压应力(强度为1 000、2 000、4 000 μstrain,加力时间为0、1、2、4、8、12 h),经荧光倒置显微镜观察施加不同动态张、压应力后细胞形态变化,细胞骨架荧光染色强度测定分析细胞骨架F-actin表达量的变化.结果:加力后细胞骨架形态和微丝蛋白发生规律性变化;细胞F-actin荧光染色强度正常→下降→正常;细胞骨架对张、压应力作用的反应敏感程度无明显差异.结论:在一定的张、压应力范围内人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的形态结构具有一定的稳定性.     

周期性牵张力对人牙周膜细胞MMP-1 mRNA表达的影响

目的:观察周期性牵张应力对人牙周膜细胞(HPDLF)的MMP-1 mRNA表达的影响.方法:对培养在弹性膜培养板上的HPDLF施加0.2 Hz、12%形变率的周期性牵张力,利用原位杂交和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术观察HPDLF的MMP-1 mRNA的表达.结果:体外培养的HPDLF正常情况下表达MMP-1 mRNA,加载周期性牵张力12 h、24 h、48 h后,随着作用时间的延长,HPDLF的MMP-1 mRNA有持续增强的趋势.结论:周期性牵张力作用下,HPDLF的MMP-1 mRNA的表达增强,加速ECM的代谢活动.     

机械拉伸对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原及蛋白合成的影响

目的：研究拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞I型胶原及蛋白合成的影响。方法：应用酶联免疫吸附实验及考马斯亮蓝微板法对拉伸应变下的细胞合成代谢变化进行观察,应变范围为1－8％,结果：在0．5－8％拉伸应变范围内,人牙周膜成纤维细胞I型胶原合成无明显变化,但1－8％拉伸应变作用下细胞蛋白合成减少,其中2％拉伸应变影响最明显。结论：拉伸应变可改变人牙周膜成纤维细胞细胞外基质成分。     

周期性张应力对牙周膜细胞内基质金属蛋白酶-8和13表达的影响

目的：观察周期性张应力作用下牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,HPDLC）中基质金属蛋白酶（MMPs）的表达变化。方法：通过建立体外应力加载系统,对培养在弹性膜六孔板的HPDLC施加0.1Hz,硅胶膜形变率分别为6%、12%、18%的周期性张应力,分别在加载2、6、12h后利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot技术检测HPDLC的MMP-8,MMP-13的表达变化。结果：HPDLC在加载周期性牵张力后,细胞生长方向顺应力方向而发生改变,MMP-8和MMP-13的表达明显增加。结论：周期性循环张力可诱导HPDLC中MMP-8、MMP-13表达增强,为MMP-8、MMP-13可能参与正畸力下牙周组织的改建提供了依据。     

机械应力对人牙周膜成纤维细胞整合素β1mRNA表达的调节

目的观察机械力刺激对人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达的影响。方法用Forcel四点弯曲加载装置通过对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态张、压应力（强度为1 000、2 000、4 000 μstrain，加力时间为0、0.5、1、4、8、12 h），采用实时荧光定量PCR法研究机械力对人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达的影响。结果施加动态的张、压应力后，人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达量下调，这种下调变化与所施加应力的性质、大小和作用持续时间相关。人牙周膜成纤维细胞整合素β1对张、压应力刺激的感应不完全一致，机械力刺激越强，整合素β1表达越明显。结论动态张、压应力刺激在本实验提供的微应力范围内可以促进目的基因mRNA表达改变，不同的机械力对细胞整合素β1效应不同。     

茶多酚对脂多糖介导下人牙周膜成纤维细胞 MMP-1、MMP-2表达的影响

目的：观察茶多酚（TP）在脂多糖（LPS）介导下对人牙周膜成纤维细胞（HPDLCs）MMP-1、MMP-2表达的影响。方法：体外培养 HPDLCs,在培养液中添加 TP（200μg/ml）作用于脂多糖（100μg/ml）介导的 HPDLCs,培养24、48、72 h,ELISA法检测 HPDLCs 分泌 MMP-1和 MMP-2的量。荧光实时定量 PCR 法检测 HPDLCs 中 MMP-1和 MMP-2 mRNA 的表达。结果：在 LPS 介导下 HPDLCs MMP-1和 MMP-2分泌量和基因表达升高,TP 可抑制 LPS 介导下 HPDLCs MMP-1和 MMP-2表达。结论：TP 可抑制 LPS 介导的人牙周膜细胞的胶原降解。     

雌激素与机械张应力对碱性成纤维细胞生长因子的影响

目的研究雌激素与机械张应力共同作用对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast,HPDLF)增殖分化相关因子碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)mRNA表达水平的影响。方法体外培养HPDLF,分为两组。实验组使用10-7mol/L雌激素干预后,使用4点弯曲加力装置对HP-DLF进行张应力加载;对照组不使用雌激素干预,只进行机械张应力加载。采用实时多聚酶链反应、琼脂糖凝胶电泳和紫外线分析检测HPDLF加力时3、6、12 h时bFGF基因的表达。结果加力0、3、6、12 h时,对照组bF-GFmRNA表达量光密度值分别为1.000,3.245±0.261,4.498±0.431,7.969±0.597,实验组bFGFmRNA表达量光密度值分别为16.736±1.003,22.542±1.768,27.923±1.914,31.556±2.142。雌激素干预与张应力加载共同作用与单纯受到机械张应力作用相比,bFGF的mRNA表达量明显上调(P<0.05)。结论雌激素对机械张应力状态下的牙周膜成纤维细胞增殖分化相关因子bFGF有较强调控作用,表现为bFGF的mRNA表达量显著上升。     

碱性成纤维细胞生长因子对人牙周膜细胞生长的影响

目的 探讨在碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)作用下,人牙周膜细胞（PDLC）的增殖、DNA合成状况的变化。方法 以常规体外组织块细胞培养法获得PDLC,采用MTTI地和^3H-TdR掺入法测定bFGF对PDLC的影响,实验结果A值和CPM值经方差分析。结果 各实验组与对照组之间均有显著性差异,bFGF能显著提高PDLC的增殖活性及DNA合成,其效应随bFGF浓度增大而增大,1000ng/ml范围内未见抑制现象,最大效应一半的浓度约为100ng/ml。结论 bFGF能促进PDLC增殖及DNA合成,可望在牙周再生治疗中起到重要作用。     

周期性张应变对人牙周膜细胞迁移的影响

目的 探讨周期性张应变对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLC)迁移的影响及其相关机制,为进一步了解机械力对hPDLC功能的影响提供资料.方法 应用FX-4000T细胞应变加载系统,对体外培养的hPDLC施加周期性张应变,牵张幅度分别为10%和20%,加载时间为6 h和24 h,频率均为0.1 Hz,以未加载的静态细胞作为对照组,应用划痕法观察hPDLC的迁移,蛋白质印迹法检测hPDLC的基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)的表达变化;用细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的特异性抑制剂PD98059预处理hPDLC后,在0.1 Hz、10%幅度条件下,加载6 h,检测细胞p-ERK1/2和MMP-9表达的变化.用细胞迁移划痕法观察加载10%和20%幅度张应变,观察24 h后PD98059和MMP家族的抑制剂强力霉素(doxycycline,DOX)对hPDLC迁移的影响.结果 细胞迁移划痕实验结果显示,牵张幅度和加载时间均可显著促进细胞迁移.与静态组相比,施加牵张幅度分别为10%和20%的张应变6 h后,hPDLC迁移变化不明显,但加载24 h后,10%和20%幅度的张应变均显著促进了hPDLC迁移(P<0.05),细胞迁移率分别为(45 ±8)%和(66±14)%,且20%比10%幅度牵张对细胞迁移的促进作用更显著(P<0.05).蛋白印迹法结果显示,周期性张应变促进了hPDLC的MMP-9表达.牵张幅度对细胞MMP-9的表达有显著影响(P<0.05),但加载时间对细胞MMP-9的表达无显著影响.ERK1/2的抑制剂PD98059不仅可以明显抑制张应变诱导的p-ERK1/2活化,而且可通过ERK信号通路明显抑制张应变诱导的细胞MMP-9表达.细胞迁移划痕实验还证实,加载幅度分别10%和20%的张应变24 h后,抑制剂PD98059和DOX均能有效抑制周期性张应变诱导的hPDLC迁移.结论 周期性张应变可通过激活hPDLC的ERK信号通路,促进细胞的MMP-9表达,从而诱导体外培养的hPDLC迁移.     

静压力大小对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原表达影响的研究

目的研究不同大小静压力对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原表达的影响。方法采用第4代人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts,HPDLFs）,对照组不加力,实验组用静压力加载装置分别施加15 kPa、30 kPa、45 kPa的持续性静压力,加力时间为1 h。加力后立即收集样本,用免疫细胞化学染色技术检测细胞内Ⅰ型胶原蛋白的表达情况,用彩色病理图像分析仪分析各组细胞的阳性表达。结果与对照组比较,15 kPa压力下,实验组Ⅰ型胶原蛋白表达显著增多（t=5.806,P〈0.05）;30 kPa压力下Ⅰ型胶原蛋白表达有所下降但仍高于对照组（t=4.933,P〈0.05）;45 kPa压力下Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显减少（t=5.654,P〈0.05）。结论适当大小的静压力能促进人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达,但静压力过强则会抑制其表达。     

循环张应力对牙周膜细胞基质金属蛋白酶-8和13表达的影响

目的 以同一频率下不同力值、不同时间的循环张应力对人牙周膜细胞(HPDLC)中的基质金属蛋白酶(MMP)一8、13表达的影响,探讨生物力介导下牙周组织细胞外基质代谢调节的分子机制和牙周组织改建的分子生物学基础.方法 对培养在弹性硅胶膜6孔板上的HPDLC施加0.1Hz,硅胶膜形变率分别为6%、12%和18%的周期性循环...     

静态拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞的影响

目的：研究人牙周膜成纤维细胞(PDLF)在机械拉伸应变作用下，细胞和细胞核投影面积及其细胞骨架的改变情况，探讨PDLF的形态、功能和应变之间的关系。方法：采用自制的细胞体外静态机械加载装置用不同的拉伸应变量加力于细胞上，通过激光扫描共聚焦显微镜观察细胞骨架的形态及其改变情况，并进行统计分析。结果：在8％、12％、16％力值组，细胞和细胞核投影面积随着加力时间和力值的增加而每天递增，肌动蛋白纤维也随之逐渐增粗，排列更有规律；而在20％力值组，其结果则反之。结论：静态拉伸应变可影响牙周膜成纤维细胞的骨架。     

周期性张应力对牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的 探讨周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)增殖的影响及其机制。方法采用多通道细胞牵张应力加载系统,以hPDLF为对象构建细胞体外培养-力学刺激模型。加力组分别给予1、2、4、6、12和24h的力学刺激,刺激幅度10％、频率为0.1 Hz。以静态组为对照组。应用细胞计数试剂-8(CCK-8)检测hPDLF增...     

缺氧对人牙周膜成纤维细胞基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制物mRNA表达的影响

目的 探讨缺氧对人牙周膜成纤维细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase,TIMP) mRNA表达的影响,以期为牙周组织修复再生机制研究提供依据.方法 组织块法培养人牙周膜成纤维细胞,分为缺氧组和常氧组(对照组).缺氧组细胞分别于1％O2、5％ CO2、94％N2的37℃培养箱中培养12、24和48 h(分别为12、24、48 h缺氧组);常氧组细胞在20％O2、5％ CO2、75％N2的37℃培养箱中培养.采用反转录聚合酶链反应技术检测MMP和TIMP相关基因的表达.缺氧组与常氧组间均数比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验.结果 12、24、48 h缺氧组MMP-2 mRNA的表达呈明显递增趋势(分别为0.769±0.038、0.793±0.043、0.865±0.047),均显著高于常氧组(0.294±0.117),P＜0.01;12h缺氧组TIMP-1,2 mRNA的表达(分别为1.870±0.645、0.862±0.043)均有一过性升高,均分别显著高于常氧组TIMP-1,2 mRNA的表达(分别为0.816±0.043、0.426±0.097),P＜0.05.12h缺氧组MMP-1/TIMP-1 mRNA的比值(0.392±0.206)显著低于常氧组(0.859 ±0.126),P＜0.05;24、48 h缺氧组MMP-2/TIMP-2 mRNA的比值(分别为1.091±0.207、1.264±0.377)均显著高于常氧组(0.695±0.255),P＜0.05.结论 缺氧可以导致MMP-1、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达,并使MMP-2 mRNA与TIMP-2 mRNA的比值失衡,这可能是缺氧导致牙周炎患者牙周组织破坏加重的机制之一.     

应力对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达的影响

目的 探讨机械应力下人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLF)Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达的变化,为阐明力信号的细胞内转导机制提供依据. 方法 对体外培养的hPDLF分别施加不同动态张、压应力(强度为1000、2000、4000 μstrain,加力时间为0、0.5、1、4、8、12 h),定量聚合酶链反应(PCR)检测Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达. 结果 随时间延长1000 μstrain张应力和压应力均使Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达增强,2000 μstrain和4000 μstrain张应力均使Ⅰ型胶原mRNA表达先增强1 h后减弱,而2000 μstrain和4000μstrain压应力均使Ⅰ型胶原mRNA表达持续减弱,2000 μstrain张应力和压应力均使纤连蛋白mRNA表达持续增强,而4000 μstrain张应力和压应力均使纤连蛋白mRNA表达先增强4 h后减弱. 结论 本项实验提供的应力范围内动态张应力和压应力刺激可改变hPDLF Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA的表达.     

加载牵张应力对人牙周膜成纤维细胞生长和增殖的影响

目的：探讨不同力值和不同频率的牵张应力对HPDLF增殖的影响。方法：通过细胞牵张应力加载系统,施加频率为0.1Hz,大小为6%、12%、18%形变率的牵张应力;大小为12%形变率的频率为0.1Hz、0.2Hz及持续性的牵张应力,利用四唑盐（MTT）比色试验观察牵张应力对HPDLF增殖的影响。结果：频率为0.1Hz时,6%、12%的牵张应力对HPDLF有促增殖作用,12%的牵张力作用最强,18%的牵张应力对HPDLF的增殖有抑制作用;大小为12%时,0.2Hz的牵张应力对HPDLF的促增殖作用最强,持续性牵张应力促增殖作用最小。结论：不同力值和频率的牵张应力对HPDLF的促增殖作用影响不同,12%形变率、频率为0.2Hz的牵张应力有最佳的促增殖效果。     

RGD七肽固定对胶原粘附人牙周膜成纤维细胞粘附的影响

目的：将促粘附分子RGD七肽（GRGDSPC）固定于Ⅰ型胶原材料,研究其对人牙周膜成纤维细胞粘附性的影响。方法：实验分4组。A组：耦联组,采用化学交联剂sulfo—Lc—SPDP,使含RGD肽的GRGDSPC肽与胶原支架结合。B组：混合组,将GRGDSPC肽与I型胶原直接混合后涂层。C组：单纯胶原涂层组。D组：未涂层孔板组。采用贴壁法培养人牙周膜成纤维细胞,鉴定其细胞起源;检测细胞贴壁率,评估不同时间、不同浓度人牙周膜成纤维细胞粘附效果。结果：成功建立人牙周膜成纤维细胞的分离和体外培养方法;方差分析分组变量、浓度变量及时问变量对贴壁率的影响,结果显示A、B、c、D分组（P〈0．05）、GRGDSPC浓度分组（P〉0．05）及时间分组（P〈0．05）,各因素间无交互作用;A组与B、C、D各组比较,有统计学差异（P〈0．05）。结论：耦联组GRGDSPC肽固定Ⅰ型胶原后细胞粘附率明显高于其它各组,且呈时间和肽浓度依赖性。     

牙周膜肌成纤维细胞功能特点的体外研究

目的 体外实验研究牙周膜肌成纤维细胞（MFB）的作用特点。方法 体外培养人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）,采用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导成纤维细胞向MFB转化。MFB为实验组,以hPDLFs为对照,连续培养两组细胞,按0、12、24、48、72 h共5个时间点终止培养收样。免疫细胞化学检测MFB标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况,检测实验组纤维粘连蛋白（FN）以明确细胞间接触作用情况。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测α-SMA mRNA、胶原（Col）ⅠmRNA、ColⅢ mRNA的表达情况,免疫印迹法检测α-SMA、ColⅠ蛋白的表达情况,用以比较两组细胞分泌细胞外基质情况。结果 实验组α-SMA持续稳定表达,从0 h开始表达均显著高于对照组（P<0.001）;细胞间FN阳性表达,提示MFB之间有细胞突触相互连接。从24 h开始,实验组ColⅠ、ColⅢ的表达均显著高于对照组（P<0.001）。结论 牙周膜MFB持续高表达α-SMA并且可能通过FN相互作用。MFB具有大量分泌细胞外基质的能力。     

周期性张应力对人牙周膜细胞生物学活性的影响

目的:探讨周期性张应力对体外培养的人牙周膜细胞生物活性的影响。方法:对体外培养的人牙周膜细胞施加不同大小的周期性牵张力(6%、12%、20%细胞表面拉伸率),24h后检测其对细胞的总蛋白合成、ALP活性、Col-Ⅰ和OCN分泌的影响。实验结果用SPSS 13.0进行统计分析。结果:较小的牵张力对人牙周膜细胞生物活性无显著影响,随力值的增大,牵张力能够呈强度依赖性抑制人牙周膜细胞的活性,减少总蛋白合成及ALP活性,抑制Col-Ⅰ及OCN的分泌。结论:周期性张应力可以抑制人牙周膜细胞的生物学活性,并呈强度依赖性。     

动态张应力下黏着斑激酶对人牙周膜成纤维细胞转录因子c-fos和c-jun mRNA表达的影响

目的 研究动态张应力刺激下体外培养的人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLF)转录因子c-fos和c-jun mRNA的变化以及黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)对c-fos和c-jun mRNA表达的影响,为进一步探索人PDLF中力学信号转导途径提供依据.方法 刮取牙根中1/3牙周膜组织,采用Ⅰ型胶原酶消化结合组织块贴附法进行PDLF原代培养并传代.用四点弯曲加载装置对体外培养的第六代PDLF分别施加动态张应力,以加入FAK抗体作为抗体组,不加入FAK抗体作为对照组,采用实时荧光定量PCR法研究动态张应力下FAK对人PDLF转录因子c-fos和c-jun mRNA表达的影响.对实时荧光定量PCR所得数据取常用对数后行单因素方差分析.结果 抗体组加力0、0.5、1、2、4h后c-fos mRNA表达量分别为(1.64±0.20)、(1.67±0.28)、(1.57±0.18)、(1.44±0.26)、(1.33±0.29) lg拷贝数/μg;c-jun mRNA表达量分别为(1.56±0.67)、(1.60±0.21)、(1.46±0.31)、(1.41±0.13)、(1.38±0.14) lg拷贝数/μg.c-fos和c-jun mRNA表达量在加力后上调,0.5h达到峰值,0.5h后出现持续性下调.抗体组细胞c-fos和c-jun mRNA表达变化规律与对照组相似,但同一时段抗体组较相应对照组高,1h后差异有统计学意义(P＜0.05).结论 转录因子c-fos和c-jun可能在牙周膜对机械力刺激的反应中发挥作用,FAK可能是人PDLF中力学信号转导途径的重要分子.