大鼠骨髓间充质干细胞在体外向神经元样细胞的分化

目的探讨2-ME与BHA对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的作用。方法大鼠股骨中分离MSCs,贴壁法体外扩增、传代。以二巯基乙醇（2-ME）预诱导,再加入2-ME、3-叔丁基-4羟基茴香醚（BHA）诱导。免疫细胞化学染色检测巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管联合蛋白-2（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、1-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达,以鉴定分化细胞的表型特征。尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）作为细胞分裂标记检测MSCs增殖特性。结果细胞诱导后具有神经细胞的形态,并被BrdU标记,nestin、NSE、MAP-2、AchE、GABA表达阳性,而GFAP、TH表达为阴性。结论2-ME和BHA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

体外诱导犬骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化的初步研究

目的:探讨体外诱导犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向上皮样细胞分化的可行性和基本条件.方法:抽取成年健康杂种犬的骨髓,用密度梯度离心及贴壁培养法分离纯化BMSCs,培养扩增后,取第2代BMSCs在以下不同培养液中诱导培养:K-SFM EGF BPE、DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS,观察细胞形态的变化,绘制细胞的生长曲线,诱导培养后第7、14天,用免疫细胞化学染色和流式细胞仪鉴定上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白(cytokeratin, CK)和上皮膜抗原(epithelial membrane antigen, EMA)的表达.结果:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞形态变为圆形或椭圆形,有突起,第14天圆形或椭圆形细胞明显增多;诱导培养过程中DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞形态无明显变化.CK免疫细胞化学染色结果提示:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞呈阳性表达,第14天,阳性细胞明显增多;DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均呈阴性表达.流式细胞仪检测发现K-SFM EGF BPE组诱导培养第14天,部分细胞CK和EMA呈阳性表达(>7%),DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均为阴性.结论:本实验提示K-SFM EGF BPE联合培养液能够在体外诱导犬BMSCs向上皮样细胞分化.     

体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化

目的:观察体外雪旺细胞环境对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的诱导分化作用。方法:分离和体外培养新生大鼠MSCs和雪旺细胞;实验组MSCs经DAPI标记后与雪旺细胞按1∶2比例共培养,观察细胞的形态变化,在第1,3,6天时使用免疫细胞化学染色检测MSCs中Nestin,GFAP及S-100表达。对照组MSCs单独培养,其余处理与实验组相同。结果:共培养1 d后部分MSCs出现雪旺细胞样形态,Nestin表达率为(83.4±3.5)%,随时间增加而降低。GFAP及S-100表达率随时间而增加。对照组细胞形态无变化,不同时间点均有少量MSCs表达Nestin,而GFAP和S-100未见表达。结论:MSCs可通过体外共培养向雪旺细胞分化。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化及凋亡的研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经细胞诱导分化的潜能,及分化后的凋亡情况?方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基对第三代MSCs进行诱导分化,诱导分化的细胞按分化时间3?7?14 d分成A?B?C三组?三组诱导分化细胞分别进行NSE免疫组织化学,MAP2免疫荧光化学以及TUNEL凋亡细胞检测?结果:A?B?C三组细胞在细胞形态上与神经细胞相似,并且表达神经细胞特异性标记抗原NSE?MAP2,但是C组细胞表达强度弱于B组,并且阳性细胞比例少于B组(P < 0.05)?A?B?C三组TUNEL凋亡阳性细胞比例呈逐渐增多趋势(P < 0.05)?结论:含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,随着诱导时间的推移,分化细胞状态下降,凋亡比例增多?     

P19细胞体外DMSO诱导向心肌样细胞分化

目的:体外诱导P19细胞向胚胎心肌样细胞分化. 方法:P19细胞经复苏、传代,在体外二甲基亚砜(DMSO)诱导下向心肌细胞分化,分化细胞经HE染色及心肌标志物转录因子(GATA-4), 连接蛋白43(connecxin43), α-肌节型肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的免疫细胞化学染色后,在光镜、倒置显微镜下观察细胞形态学变化,透射电镜下观察细胞超微结构变化. 结果:经DMSO诱导分化后4 d有细胞聚集体形成,6 d有部分细胞GATA-4和connecxin43呈阳性表达,GATA-4阳性表达位于细胞核和细胞质,connecxin43阳性表达呈斑点状分布于心肌细胞胞质内和细胞膜表面. 10 d时GATA-4和connecxin43阳性表达明显增加,并有部分细胞呈α-sarcomeric actin阳性,阳性表达位于细胞质. 电镜观察,未分化细胞为圆形或椭圆形,细胞间连接松散,细胞质较少,细胞器不发达;诱导后6 d,细胞间出现紧密连接和中间连接,细胞质增多,部分细胞表面出现突起,突起内可见微丝. 诱导后10 d,线粒体、粗面内质网、滑面内质网、高尔基体丰富,并有中心粒形成. 结论:P19细胞在DMSO诱导下已有向心肌分化趋向,有类似胚胎心肌细胞形成.     

碱性成纤维细胞生长因子体外诱导犬骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨不同剂量的碱性成纤维细胞生长因子体外定向诱导犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化的可行性。方法采用密度梯度离心法分离犬BMSCs并进行传代培养。四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞术检测第3代BMSCs的增殖及DNA周期;取第3代BMSCs设置对照组,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）10、100μg·L^-1组进行体外诱导培养,镜下观察其形态变化,细胞生长曲线法检测细胞增殖情况;免疫荧光法鉴定心肌肌钙蛋白I（TnI）、肌球蛋白重链（MHC）和波形蛋白（Vimentin）的表达。结果密度梯度离心法得到的BMSCs呈长梭形、聚集性生长,第3代BMSCs MTT法检测结果显示细胞生长阶段为潜伏期、对数生长期及平台期。DNA周期检测结果:G₀/G₁期为（91.90±1.68）%,表明绝大部分细胞处于非增殖状态。经诱导分化3周后,3组细胞经生长曲线法检测结果显示:1³ d,bFGF10、100μg·L^-1组细胞数较对照组增殖明显,差异有统计学意义（P<0.05）;4⁵ d,对照组细胞呈对数生长趋势,bFGF 10、100μg·L^-1组细胞数量减少;6⁷ d,bFGF诱导组较对照组细胞数明显减少（P<0.05）,而bFGF 10μg·L^-1组与bFGF100μg·L^-1组比较细胞数量明显偏少（P<0.05）。免疫荧光法检测结果显示:经诱导分化4周后,bFGF 10μg·L^-1组和bFGF100μg·L^-1组的细胞均表达TnI和MHC,不表达Vimentin;对照组均不表达TnI、MHC和Vimentin。结论 10μg·L^-1bFGF能够有效促进BMSCs的体外增殖,并具有向心肌样细胞分化能力。     

骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨大鼠骨髓间充质干细胞 ( rat mesenchymal stem cells,r MSCs)体外诱导分化成神经元的能力。方法 :用 0 .2 5、0 .5、1 .0 mmol· L-1IBMX诱导传代的 r MSCs,待细胞分化后进行形态学观察 ,并用免疫细胞化学方法进行细胞鉴定。结果 :0 .5 mmol· L-1IBMX诱导细胞效果最好 ,2 d即可见有神经元样细胞出现 ,6d神经元样细胞占细胞总数的 ( 2 3.2± 2 .3) %,NSE染色阳性。未分化细胞表达 nestin,诱导 3d,阳性细胞增多 ,6d减少。结论 :体外 r MSC能扩增、传代 ,并被诱导分化成神经元样细胞     

霉酚酸对人骨髓来源间充质干细胞的作用

目的:研究霉酚酸( mycophenolic acid,MPA)对人骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的作用及其机制.方法:在MSCs生长和分化过程中加入不同浓度的MPA,用CCK-8方法分析MSCs增殖的情况,用Annexin V/PI双染色法检测MPA各浓度组的细胞凋亡,RT-PCR方法分析MSCs次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)的表达;应用von Kossa染色、钙定量和real-time PCR方法分析MPA对MSCs成骨分化的影响.结果:1～100 μmol/L的MPA呈时间浓度依赖性地抑制间充质干细胞的生长,添加鸟嘌呤核苷可以解除该抑制效应,且该抑制效应与细胞凋亡无关;RT-PCR结果显示,MSCs表达IMPDH I和IMPDH Ⅱ两种亚型;yon Kossa染色和钙定量显示,MPA抑制MSCs的成骨分化,Osteopontin和BMP-2的表达相应减低;进一步研究发现,MPA可能通过影响转录因子Runx2、Osterix的表达而影响MSCs的成骨分化.结论:MPA通过耗竭鸟嘌呤核苷的方式呈时间浓度依赖性抑制人骨髓来源的间充质干细胞的增殖;同时,MPA通过抑制Runx2和Osterix蛋白的表达,抑制MSCs的成骨分化.     

骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展

摘要 心肌梗死(myocardialinfarction,MI)是心血管疾病中最常见且最严重的疾病,心肌梗死后心肌组织的损伤、 凋亡和不能再生的问题一直无法解决。在组织工程的研究中发现,通过干细胞治疗损伤的心肌组织从而改善心脏功能 是最理想的选择。骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymalstemcells,BMSCs)具有自我更新、多向分化、获取容 易、增殖迅速的生物学特性,同时具有旁分泌、抗炎抗纤维化、免疫抑制、促血管生成等作用,因此,BMSCs是治疗心血管 疾病的理想途径。诱导BMSCs向心肌细胞方向分化的方法包括化学、生物、物理等方法。该综述主要对BMSCs的生物 特性、作用机制以及在体外诱导 BMSCs向心肌细胞方向分化的方法进行了总结。     

骨髓间充质干细胞多向分化的研究

干细胞是体内存在的一类特殊细胞,既能自我更新又能多向分化。骨髓间充质干细胞作为干细胞中的一种,可分化成多种具有特定功能的细胞,并且证实其可分化为多种组织细胞参与组织损伤的再生和修复。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为心肌细胞实验方法的建立

目的:探讨体外培养并诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs) 分化为心肌细胞（CMs）的实验方法。方法:采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs,采用5-氮杂胞苷( 5-Aza)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对hMSCs进行联合诱导,诱导3～4周,观察细胞形态学的变化,免疫组织化学方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果:hMSCs体外经5-Aza 和bFGF联合诱导1～2周后,细胞体积较诱导前增大,呈长梭形。诱导2～3周后细胞伸出伪足呈多爪形;诱导3～4周后细胞伪足间相互连接形成肌管样结构。联合诱导3～4周后免疫组织化学鉴定结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnⅠ)和横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）表达均呈阳性。结论:hMSCs在体外经5-Aza和bFGF联合诱导可以分化为CMs。     

心肌细胞体外微环境中骨髓间质干细胞向心肌样细胞的分化

目的：分析心肌组织内何种细胞对骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的定向分化起决定作用。方法：利用BMSCs与心肌细胞（cardiomyocytes,CM)、内皮细胞（endothelial cells,EC)共培养和单独培养，分析形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果：与CM共培养后，相邻的BMSCs之间融合成肌管样结构，并与相邻胎鼠CM初步形成闫盘样结构。心肌肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC)抗体染色呈阳性。在与EC共培养以及BMSCs单独培养时，BMSCs均未出现肌管样结构，MHC染色呈阴性。结论：CM对BMSCs的定向分化具有一定作用。     

人骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌细胞的实验研究

目的：建立人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外定向分化为心肌细胞的实验模型。方法：取6个月水囊引产胎儿股骨骨髓,Percoll分离液分离,取单个核细胞层在人MSCs专用MSCGM培养基中体外培养。将第3代生长状态良好的MSCs用10μmol／L 5-氮胞苷孵育诱导24h,继续向心肌细胞诱导分化。结果：用Percoll分离液（1．073g／ml）分离得到的单个核细胞48～72h呈纺锤形、梭形、多角形的多型性改变;经5-氮胞苷孵育24h,细胞逐渐向梭形心肌细胞样形态转变,胞浆中可见棕黄色颗粒。结论：MSCs在体外经5-氮胞苷孵育24h,可被定向诱导分化为心肌形态的细胞。     

成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的能力.方法:利用Percoll分离液(1.073×103g/L)梯度分离成年大鼠MSCs,采用3种不同的方法对其诱导分化,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、星形胶质细胞特异性标志(GFAP)和神经前体细胞(Nestin)的表达.结果:成功进行了成年大鼠MSCs的原代和传代培养,3种诱导方法均能使MSCs分化为神经元样细胞,都能表达NSE、NF和Nestin,而不表达GFAP.结论:MSCs能在体外分离、扩增、传代,并能向非间充类细胞分化.     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离,扩增培养,待细胞融合,传代培养。检测细胞的生长曲线、表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上,表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞,并保持分化潜能;克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

人骨髓间充质干细胞的分化与端粒酶活性

目的　研究人骨瞩间充质干细胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）的分化特性及其端粒酶活性。方法　取人胚胎股　　　　骨骨瞩,分离、培养、扩增ＭＳＣｓ,原位杂交法检测ＭＳＣｓ的端粒酶活性。将ＭＳＣｓ种植于裸鼠皮下,４周后观察ＭＳＣｓ的　　　　分化情况。结果人　ＭＳＣｓ呈端粒酶反应阳性。植入裸鼠体内后可分化成骨、软骨、脂肪、骨骼肌、肌腱样组织和无髓神经　　　　纤维束样结构。结论人ＭＳＣｓ是一种具有多向分化能力的干细胞,具有较高的端粒酶活性。     

成鼠骨髓间充质干细胞体外分化为神经前体细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外分化为神经前体细胞的可能性.方法:MSC原代培养、传代后在细胞因子和氧化剂作用下进行诱导.形态学观察,免疫细胞化学、流式细胞分析和细胞电生理检查.结果:MSC体外可诱导为神经前体细胞,诱导后有表面抗原nestin表达,5 h分化率49.8%,同时具有早期神经干细胞电流特性.结论:骨髓来源的神经前体细胞治疗中枢神经系统疾病成为可能.     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及表型分析

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性,为进一步实验研究打下基础.方法通过密度梯度离心法及贴壁培养分离纯化人骨髓中的单个核细胞、体外培养传代、倒置相差显微镜观察细胞生长情况、瑞氏染色及透射电镜观察细胞形态及结构、绘制生长曲线、流式细胞仪检测细胞表面标记及增殖周期、免疫细胞化学及细胞化学染色对分离培养细胞进行鉴定.结果原代和传代培养的细胞以成纤维样为主,有较强的生长增殖能力;流式细胞仪检测细胞表面标记:CD29、CD105阳性,CD34阴性;细胞周期分析:90%以上的细胞处于G0/G1期;细胞CD106、纤维连接蛋白表达阳性,CD45、CD14及层连蛋白、胶原蛋白Ⅱ表达阴性,细胞糖原(PAS)染色强阳性,细胞碱性磷酸酶(ALP)染色阴性.表明细胞不是造血细胞且未向成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞分化,而是处于未分化阶段的间充质干细胞.结论通过密度梯度离心法及贴壁传代培养可以分离纯化MSCs以满足下一步实验研究,该细胞具有特殊的生物学特性.