基因测序鉴定新等位基因A＊33：03：14

目的：鉴定一个广东省结直肠癌患者人群中发现的 HLA 新等位基因并检测分析其核苷酸序列。方法采用 Qiagen 试剂盒提取样本 DNA,聚合酶链式反应-直接测序分型技术（PCR-SBT）获得 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的核苷酸序列及 HLA 高分辨率分型结果,并分析其与 HLA-A＊33：03：01基因序列的异同。结果发现1个与 HLA-A＊33：03：01核苷酸序列高度相似的新等位基因,与已知 HLA-A＊33：03：01相比,该等位基因在外显子3的碱基位置492出现 T→A 点突变,密码子位置149由 GCT→GCA,所对应编码的氨基酸均为丙氨酸,为同义突变。结论基因测序结果表明该基因序列为新的 HLA 等位基因,已提交 GeneBank,并于2013年2月被世界卫生组织 HLA 因子命名委员会正式命名为 HLA-A＊33：03：14。Genbank 注册号为 HWS10017874。     

HLA新等位基因HLA-A~* 33:39的序列分析及鉴定

目的人类白细胞抗原(HLA)新等位基因HLA-A*33∶39的序列分析及鉴定。方法利用多聚酶链反应—基于测序的分型(PCR-SBT)技术鉴定HLA新等位基因。结果发现1个与A*33∶03∶01序列相近的未知等位基因,实验结果表明其在A*33∶03∶01第4外显子649位G>A,其突变造成A*33∶03∶01氨基酸序列中192位的丙氨酸(A)>苏氨酸(T)。结论此为HLA-A位点的1个新等位基因,2010年10月被世界卫生组织HLA命名委员会命名为HLA-A*33∶0339。     

HLA新等位基因A＊9217家系调查分析

背景：目前所发现的HLA等位基因是在人类进化过程中,为了适应某种外界环境过程中逐渐产生的,新近产生而不曾被人们发现的为新等位基因,这些新的等位基因产生诱因千变万化,在诱发因素消除之后这些突变是否持续存在,尚需进一步观察。目的：采用DNA测序技术确认聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸分型检测中的可疑结果,确认新的HLA等位基因,分析新等位基因HLA-A＊9217（WHO注册号：WHS10004629）的遗传方式。设计、时间及地点：以DNA为观察对象的开放性试验。其中常规初检聚合酶链反应-寡核苷酸探针分型反向杂交荧光微珠法于2007-11在河南省红十字血液中心中华骨髓库河南分库人类白细胞抗原组织配型实验室完成,测序实验于2008-02在戴诺生物技术（北京）有限公司人类白细胞抗原实验室完成。材料：中华骨髓库志愿捐献者（编号：371xxxxx）及其直系3代亲属血样,受试者共9人在实验室逐个登记,采集静脉血5mL,EDTA抗凝。方法：用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸流式荧光微珠HLA分型方法、SBT测序分型方法,对A＊9217携带者家庭成员进行中低分辨,DNA测序高分辨检测分析,血清学方法检测ABO,MN,Rh血型系统,分析新基因的发现及遗传方式。主要观察指标：HLA新等位基因A＊9217携带者A位点外显子3序列对比。结果：通过受检者HLA分型结果和红细胞系统ABO,MN,Rh血型分析,先证者A＊9217应来自父方,但父方并没有检出A＊9217,而是检出了与之序列相近的A＊020301,与A＊9217在处显子3有3处碱基改变391T〉G,414C〉G,418T〉G,A＊9217携带者的2个孩子均检出A＊9217。结论：新基因A＊9217先证者父方产生突变所致,该突变能正常遗传给后代,该基因是否能稳定遗传下去有待进一步观察研究。     

基因组序列分析HLA新等位基因B*3818内含子和外显子同时突变

目的 分析HLA新等位基因B*3818的基因组序列.方法 克隆测序方法 对PCRSBT中发现的1个未知HLA-B等位基因的基因组序列进行双向全长测序,并采用微量淋巴细胞毒方法 鉴定该等位基因编码分子的抗原特异性,通过群体调查和家系分析了解该等位基因的群体分布频率和单倍型组成情况.结果 新等位基因HLA-B*3818(序列注册号为FJ561482)与B*380201在第4外显子和第5内含子同时存在1个核苷酸的差异.第4外显子的第660位碱基由C变为A,导致第196个密码子由GAC变为GAA,相应氨基酸由天门冬氨酸变为谷氨酸,与IMGT/HLA中的HLA-B等位基因的序列进行对比,该突变为新的单核苷酸多态性位点.第5内含子的第2133位碱基由A变为C,除此之外,B*3818的内含子序列与B*380101、B*380201和B*3814相同.该新HLA等位基因的血清学特异性为B38,其在中国汉族人群中的分布频率小于0.000 5,家系调查结果 表明携带该新等位基因的单倍型为A*030101-CW*010201-B*3818-DRB1-1312-DQB1*060101.结论 新等位基因HLA-B*3818的内含子和外显子同时存在变异,研究新等位基因的基因组序列可为HLA基因相关研究和应用提供更多的序列信息.     

WHO HLA命名委员会命名的新等位基因HLA-A*24:327序列分析及确认

目的 发现一个人类白细胞抗原(HLA)-A新等位基因并对其核苷酸序列进行分析及确认。方法 采用序列特异性寡核苷酸探针技术(SSO)对2015年中国造血干细胞捐献者资料库(CMDP)陕西分库入库数据进行HLA常规检测,针对罕见结果进一步选择多聚酶链反应-测序(PCR-SBT)和组序列特异性引物(GSSP)进行确证试验,明确突变位点。结果 SSO分型结果显示为罕见等位基因,经PCR-SBT复核无完全匹配结果,提示疑似新等位基因,经GSSP确证发现该基因与同源基因HLA-B*24:02:01:01相比,在第3外显子544位置发生碱基变异由G>A,该突变造成氨基酸序列158位由丙氨酸(GCC)变成苏氨酸(ACC)。结论 确认了一个新的HLA-A等位基因,2015年12月31日被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA-A*24:327。     

山东鲁西地区汉族人群HLA—A、B、DRB1座位高分辨等位基因多态性分析

目的了解山东鲁西地区汉族人群HLA—A、B、DRB1座位高分辩水平的基因多态性特点。方法采用PCR—SBT对647例山东鲁西地区汉族造血干细胞志愿捐献者进行HLA—A、B、DRB1座位高分辨分型,直接计数法计算各等位基因频率。结果本研究共检出HLA—A、B、DRB1等位基因139种,其中,常见基因为HLA—A＊02：01（0．097372）、A＊11：01（0．165379）、A＊24：02（0．156105）;HLA—B＊13：02（0．084235）、B＊51：01（0．072643）、B＊40：01（0．065688）;HLA—DRB1＊15：01（0．139104）、DRB1＊07：01（0．138331）、DRB1＊09：01（0．125966）。结论山东鲁西地区汉族人群HLA—A、B、DRB1座位高分辨水平等位基因表现为高度多态性特点,常见基因的种类和频率分布与中国北方汉族近似,与中国南方汉族存在明显差异。     

中国汉族人群人类白细胞抗原新等位基因A^＊1155的确认

背景：在国内发现的新等位基因中,大部分都是先采用人类白细胞抗原分型低分辨方法进行分型,如发现反应格局异常后,再进一步用基因测序或基因克隆方法进行确认,这样有可能导致一些新等位基因未被发现。基因测序分型方法被认为是人类白细胞抗原分型的金标准,它可得出精确的核苷酸序列。目的：直接采用基因测序分型方法对中华骨髓库标本进行检测,识别和确认中国汉族人群中新发现的等位基因。方法：应用中国造血干细胞捐献者测序结果可疑为新等位基因的重采血样5mL,采用基因测序分型技术,发现一样本HLA-A位点的杂合结果HLA-A＊030101/A＊110101在外显子上有1个位置与数据库不符,为了区别哪一个为新等位基因,采用基因克隆（TOPOTACloning）技术对两个等位基因1-8外显子进行DNA双向测序,发现1个与HLA-A＊110101序列相近的新等位基因,分析两者核苷酸序列的差异。并将测序结果与已知人类白细胞抗原等位基因序列比较分析。结果与结论：通过克隆分离杂合等位基因,再进行测序确认发现新的序列与A＊110101相比,在第2外显子第330碱基位置上C→G,密码子86AAC→AAG,发生了氨基酸的改变,由天冬酰氨变为赖氨酸。提示该等位基因为新的HLA-A等位基因,2009-10-31被世界卫生组织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为HLA-A＊1155。     

新等位基因HLA-B~* 15∶179∶02的确认和基因序列分析

目的鉴定并确认HLA新等位基因HLA-B~*15∶179∶02,分析其核苷酸序列。方法使用磁珠法抽提标本DNA,采用聚合酶链反应序列-特异寡核苷酸探针杂交技术(PCR-SSOP)进行HLA高分辨分型常规检测,发现1个与HLA-B~*15∶179相关的异常等位基因,使用DNA测序分型技术(PCR-SBT)及使用组特异性GSSP引物Z74,直接测定其基因序列,分析其相关核苷酸序列差异。结果新等位基因与所有已知的HLA-B序列均不相同,与同源性最高HLA-B~*15∶179∶01基因序列相比在第3外显子486位碱基发生突变(CG)。结论发现1个新的HLA-B等位基因,现已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B~*15∶179∶02。     

HLA新等位基因HLA-B*35:155的确认

目的发现和认定一个人类白细胞抗原(HLA)新等位基因。方法应用多聚酶链式反应—基于测序的分型技术(polymerase chain reaction-sequence based typing,PCR-SBT)进行HLA常规分型,HLA-B位点分型结果与等位基因B*35:03:01,51:01:01在112位有一个碱基不匹配,不能指定为任何HLA-B位点等位基因,用针对于B*35、B*51的序列特异性SSSP引物测序,确认与同源性最高的HLA等位基因序列的差异。结果测序结果表明该等位基因与其同源性最高的等位基因B*35:03:01的差异是在第2外显子112位的C>T,其突变导致密码子CGG>TGG,结果造成B*35:03:01氨基酸序列中14位的精氨酸(R)变为色氨酸(W)。结论该等位基因为HLA-B位点的一个新等位基因,世界卫生组织(WHO)HLA命名委员会将其正式命名为HLA-B*35:155。     

克隆测序确认HLA新等位基因B*3712

目的：由于技术原理的限制，目前尚不能对所有的HLA等位基因进行严格的区分，特别是以往没有发现的新基因序列只能通过测序的方法解决，然而，当遇到等位基因杂合时，测序给出的结果仍然无法确认新的序列改变发生在等位基因的哪一侧，这时需要用分子生物学方法分离杂合子然后进行测序才能确定新的基因序列。采用基因克隆方法确认HLA新等位基因。 方法：实验于2006-01／05在河南省红十字血液中心HLA实验室，美国海军骨髓库HLA实验室完成。造血干细胞血样由中华骨髓库提供。采用荧光微珠HLA分型方法对中华骨髓库捐献者血样进行HLA分型检测，无法给出确切结果的摸棱两可结果标本用基因克隆（TOPO TA Cloning）、DNA测序的方法确认新的HLA基因序列。 结果：通过克隆分离杂合等位基因，再进行测序确认发现新的序列与B^＊3709相比，出现4个核苷酸改变：1．355nt C〉A，2．363nt C〉G，3．412nt G〉A，4．477ntC〉G，而且均发生在H哺B基因外显子3（exon3）。4处改变引起氨基酸编码改变：①编码95CTC〉ATC，氨基酸改变L〉1（亮氨酸〉异亮氨酸）。②97AGC〉AGG．S〉R（丝氨酸〉精氨酸）。③114GAC〉AACD〉N（天门冬氨酸〉天冬酰胺）。（9135GCC〉GCGA=A无氨基酸改变。 结论：①新的基因序列已经在GenBnak注册，被WHO的HLA因子命名委员会得到正式命名为HLA-B^＊3712基因。②基因克隆是确认HLA新基因的根本方法。     

PCR-SSO流式荧光微珠法HLA-A~＊02高分辨分型检测模棱两可结果的统计分析

背景：由于HLA的复杂多态性,实际分型过程中难免会出现一些结果判读模棱两可现象。目的：统计分析基于PCR-SSO流式荧光微珠HLA-A＊02高分辨分型方法的模棱两可组合结果种类、比例,探讨解决模棱两可解决方法,提高高分辨分型比例。方法：对河南骨髓库捐献者1100人份HLA分型结果进行统计分析,计数法进行分类统计分析软件给出的包含HLA-A＊02：01／02：09模棱两可组合代码,计算百分比;与确认为A＊02：09的基因多态性分布进行比对,找出与A＊02：09关联性较强的等位基因,用补充实验进行复核、确认,建立A＊02：01／02：09模棱两可组合的判读方法。结果与结论：1039例有效数据中包含A＊02：01／02：09模棱两可组合279例（279/1039,26.853%）,代码种类19种,检出比例较高的有DMDC,DYVK,GMDD,GMDE;34例确认为A＊0209的基因多态性统计显示A＊0209的出现与A＊11：01（0.1471）B＊07：02（0.2647）、DRB1＊01：01（0.2647）、DRB1＊03：01（0.1176）有较强关联,选出高风险标本38例,经检测外显子1～7,并用SBT复核确认有1例结果为A＊02：09（代码组合为GMDC）,其余241例未检出A＊02：09。提示A＊02：09的出现与B＊07：02、DRB1＊01：01、DRB1＊03：01有较强关联,重点对这些关联标本进行外显子1～7检测,可有效地检出A＊02：09。通过统计分析制定合理的判定规则和必要的复核实验可有效地简化操作程序,节省时间,降低费用,提高高分辨比例。     

人类白细胞抗原HLA-C04:01:01G组的区分鉴别

本研究旨在区分人类白细胞抗原（HLA）-C＊04：01：01G组内等位基因,并分析其与HLA-A、-B的连锁情况。通过收集HLA．C＊04：01：01G组标本,采用多聚酶链反应序列分型法（PCR-SBT）分析HLA-c座位第2-7外显子序列,采用PCR-SBT方法对HLA-A、-B、-DRBl和-DQB1基因进行分型。结果表明：在189例HLA-C＊04：01：01G组标本中,178例（94．2％）为HLA-C女04：01,11例（5．8％）为C＊04：82;共检出HLA-C＊04：01：01和C＊04：82相关单体型72条,频率大于0．0050的单体型为26条;连锁分析显示HLA-C＊04：01：0l与A＊02：03,A＊02：07,A＊11：01,A＊33：03,B＊13：01,B＊15：01,B＊15：05,B＊15：27,B＊0：01,B＊54：01关联,而HLA-C＊04：82与B＊40：01关联。结论：HLA-c＊04：01：01G组中存在HLA-C＊04：01：01和HLA-C＊04：82,在常规分型指定中应加以鉴别。     

HLA新等位基因HLA—A＊1127认定

目的发现和认定HLA新等位基因HLA—A＊1127。方法应用PCR—SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因,采用分子克隆和PCR产物直接测序方法得到核苷酸序列,通过软件分析基因序列及其与最同源HLA等位基因序列的差异。结果发现1个样品的HLA—A位点结果异常。其序列与已知所有HLA—A等位基因序列不一致,与同源性最高的等位基因A＊1104的差异是在第三外显子区域的570位碱基发生G→C的替换,并导致了相应的166密码子由GAG→GAC,编码的氨基酸由谷氨酸（Glu）变成天冬氨酸（Asp）;571位碱基发生T→G的替换,并导致相应的167密码子由TGG→GGG,编码的氨基酸由色氨酸（Trp）变成甘氨酸（Gly）。结论该等位基因为HLA新的等位基因,被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA—A＊1127。     

陕西地区10165例造血干细胞捐献者HLA-A／B／DRBl座位罕见等位基因确认与分析

本研究分析陕西地区2009-2012年度10165例造血干细胞捐献者HLA-A／B／DRBl分型中罕见等位基因的检出状况。应用PCR-SBT方法对10165陕西地区造血干细胞捐献者的HLA-A／B／DRBl进行分型。结果发现,在48例捐献者中确认罕见等位基因40种,其中在15个捐献者中确认的10种等住基因虽不包含在中华骨髓库的常见及确认等位基因表（common allelesandwelldoeumemedalleles,CWD）中,但已包含在美国免疫遗传协会的常见及确认的等位基因表中,分别是：A＊02：04、B＊07：10、B＊27：09、B＊35：11、B＊44：29、DRB1＊03：04、DRB1＊08：18、DRB1＊13：05、DRB1＊13：14、DRB1＊14：11,检出2例以上的罕见等位基因包括A＊68：24、B＊35：11、B＊44：29、DRB1＊03：04、DRB1＊08：18、DRB1＊13：05。本实验室从2005-2012年发现并被世界卫生组织人类白细胞抗原因子命名委员会命名的共21例新的HIA等位基因中,有些在多个实验室的多个个体被确认,现已有HLA-A＊02：90、HLA-B＊48：14、HLA-DRB1＊01：14被列入中华骨髓库的确认及常见等位基因表。结论：在实际工作中,对于发现的新等位基因要及时上报,对确认的罕见等位基因要记录统计,保证中华骨髓库HLA基因人群分布不断累积和多态性完整,给修正中国CWD表提供依据。在参照常见及确认等位基因表进行实验分析时,对于模棱两可样本含有已确认过的罕见等位基因时要慎重取舍,以避免错检或漏检发生,保证患者尤其是携带罕见等位基因的患者最大可能的找到匹配的供者。     

HLA-A、B等位基因与梧州汉族--~（SEA）/αα型α~0-地中海贫血患者红细胞参数的关系

本研究探讨HLA-A、B等位基因多态性与梧州汉族--SEA/αα型α0-地中海贫血患者红细胞参数的相关性。采用聚合酶链反应-直接测序分型法（PCR-SBT）,对广西梧州籍汉族57例--SEA/αα型α0-地中海贫血患者进行HLA基因分型,自动血细胞分析仪进行平均红细胞体积（MCV）、血红蛋白（Hb）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）测定,采用电泳法测定HbA2。应用多分类有序Logistic回归模型进行统计分析。结果表明：HLA-A＊33：03、B＊15：01或者B＊55：02阳性的梧州汉族--SEA/αα型α0-地中海贫血患者Hb、HbA2明显较低,而HLA-B＊15：02阳性的患者Hb、HbA2则明显较高（P〈0.05）。结论：多个HLA等位基因与梧州汉族--SEA/αα型α0-地中海贫血患者Hb水平可能有关联。研究结果对了解地中海贫血表型与基因型的关系具有一定的参考意义。     

克隆测序确认HLA新等位基因B^＊3712

目的：由于技术原理的限制，目前尚不能对所有的HLA等位基因进行严格的区分，特别是以往没有发现的新基因序列只能通过测序的方法解决，然而，当遇到等位基因杂合时，测序给出的结果仍然无法确认新的序列改变发生在等位基因的哪一侧，这时需要用分子生物学方法分离杂合子然后进行测序才能确定新的基因序列。采用基因克隆方法确认HLA新等位基因。 方法：实验于2006-01／05在河南省红十字血液中心HLA实验室，美国海军骨髓库HLA实验室完成。造血干细胞血样由中华骨髓库提供。采用荧光微珠HLA分型方法对中华骨髓库捐献者血样进行HLA分型检测，无法给出确切结果的摸棱两可结果标本用基因克隆（TOPO TA Cloning）、DNA测序的方法确认新的HLA基因序列。 结果：通过克隆分离杂合等位基因，再进行测序确认发现新的序列与B^＊3709相比，出现4个核苷酸改变：1．355nt C〉A，2．363nt C〉G，3．412nt G〉A，4．477ntC〉G，而且均发生在H哺B基因外显子3（exon3）。4处改变引起氨基酸编码改变：①编码95CTC〉ATC，氨基酸改变L〉1（亮氨酸〉异亮氨酸）。②97AGC〉AGG．S〉R（丝氨酸〉精氨酸）。③114GAC〉AACD〉N（天门冬氨酸〉天冬酰胺）。（9135GCC〉GCGA=A无氨基酸改变。 结论：①新的基因序列已经在GenBnak注册，被WHO的HLA因子命名委员会得到正式命名为HLA-B^＊3712基因。②基因克隆是确认HLA新基因的根本方法。     

新等位基因人类白细胞抗原B＊15：133的鉴定及其原核表达

背景：国际上至2010-04共报告人类白细胞抗原4633个等位基因,中国自2000年至少发现200个新的等位基因,由于资金和时间有限,大部分新等位基因未作血清分型、家系研究以及进一步的功能性研究。目的：在健康志愿者人群中发现新等位基因,并对其进行家系研究,同时构建重链胞外区多肽的原核细胞表达载体,鉴定其在原核细胞中是否表达。方法：利用PCR-SSO和PCR-SBT技术,对人群的人类白细胞抗原进行筛选。使用血清学和SBT技术对拥有新等位基因的供者进行家系分析。用分子克隆的方法构建表达载体转染原核细胞,运用Western-blot鉴定是否表达。结果与结论：发现一个新等位基因与人类白细胞抗原B＊15：18：01在第419位相差一个核苷酸,C-〉T,即Codon116位TCC-〉TTC,导致氨基酸由丝氨酸改变成苯丙氨酸。最终确定命名为人类白细胞抗原B＊15：133。血清学表达B71（70）抗原。发现此供者的新等位基因来自于母亲。表达载体pET30a（＋）-B＊15：133在原核细胞中表达的多肽可被抗HIS标签单克隆抗体特异性识别。结果表明,使用分子生物学技术在大样本的筛查下发现了新等位基因人类白细胞抗原B＊15：133,利用分子克隆的方法成功构建表达载体pET30a（＋）-B＊15：133,并在原核细胞中有大量高纯度蛋白表达。