重组蛋氨酸裂解酶原核体系的表达及纯化

目的 建立L-蛋氨酸γ-裂解酶的原核表达、纯化体系.方法 合成Metase基因并构建重组质粒pBSK-Metase.通过分子克隆技术,构建重组表达质粒pBV220-Metase和pGEX-4T-1-Metase,并将重组子转化到感受态大肠杆菌Dh5α中.pGEX-4T-1-Metase经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导;pBV220-Metase经42℃温度诱导;并对诱导条件进行优化,获得大量表达;建立蛋氨酸裂解酶纯化体系.结果 构建出Metase基因的两种高效原核表达体系pBV220-Metase和pGEX-4T-1-Metase,并优化各自的最佳诱导表达条件;建立重组蛋氨酸裂解酶的纯化体系.结论 成功建立重组蛋氨酸裂解酶的原核表达、纯化体系;获得高效原核表达重组子pGEX-4T-1-Metase,且获得纯度高达95%的蛋氨酸酶.     

人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2 ( hPPARγ2)基因及构建其真核表达重组体,为进一步研究该基因打下基础.方法采用RT-PCR方法从中国人网膜脂肪垫总RNA中扩增出hPPARγ2 cDNA全长基因,将全长hPPARγ2cDRA定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,筛选出阳性克隆.通过限制性内切酶酶切和核苷酸序列测定进行鉴定.结果克隆出全长hPPARγ2cDNA序列与GeneBanK序列相同,真核表达质粒经限制性内切酶酶切后获得的片段大小与理论值一致.结论成功地克隆了hPPARγ2 cDNA,并构建了真核表达重组体.     

小鼠干扰素-γ基因克隆及其腺病毒载体的构建

目的 构建含有小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)基因的腺病毒载体,为探索IFN-γ在肝纤维化治疗中的作用研究奠定基础.方法 从含有mIFN-γ 基因的质粒载体pORF5-mIFN-γ 中PCR扩增出mIFN-γ 基因片段,双酶切将该基因克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV中,限制性内切酶PmeⅠ线性化pAdTrack-CMV-mIFN-γ,转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌株BJ5183细胞,同源重组.卡那霉素及酶切筛选出重组子pAd-mIFN-γ,内切酶PacⅠ线性化重组子,用磷酸钙法转染细胞株AD-293进行包装,收集病毒进行鉴定.结果 PCR后测序获得mIFN-γ基因,全长468 bp,与GenBank中发表的mIFN-γ 基因核苷酸序列完全一致.经酶切和PCR证实各中间过程载体均含有目的 基因.包装的病毒Ad-mIFN-γ在转染的4～6 d观察到荧光产生,8～11 d荧光逐渐增加,12 d收集病毒液.蛋白酶K裂解重组腺病毒,经PCR和Western blot方法鉴定,证实携带有目的 基因mIFN-γ.结论 大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便地构建出含有目的 基因的腺病毒载体pAd-mIFN-γ,重组子能够在AD-293细胞中进行包装和扩增,病毒包装的成功为进一步研究mIFN-γ 基因治疗小鼠肝纤维化提供了一个良好的转导载体.     

融合基因GM-CSF-BZLF1重组腺病毒表达载体的构建

目的构建粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和EB病毒即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法采用逆转录-聚合酶链反应分别获得GM-CSF和BZLF1编码序列的cDNA,应用剪接式重叠延伸(SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因GM-CSF-BZLF1。将融合基因GM-CSF-BZLF1定向亚克隆至pAdTrack-CMV质粒,在原核细胞E.coliBJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因GM-CSF-BZLF1真核表达载体pAd-GM-CSF-BZLF1。将真核表达载体pAd-GM-CSF-BZLF1转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1。RT-PCR鉴定感染重组腺病毒的293细胞中GM-CSF-BZLF1基因的表达。结果 GM-CSF-BZLF1基因插入重组腺病毒表达载体的预期位置,且插入序列完全正确;感染重组腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1的293细胞中检测到融合基因GM-CSF-BZLF1的转录表达。结论成功地构建了融合基因GM-CSF-BZLF1重组腺病毒表达载体,为进一步探讨GM-CSF-BZLF1的功能提供了理论基础和实验依据。     

人腺病毒五邻体基因重组质粒的构建及鉴定

目的 构建腺病毒五邻体基因重组表达质粒.方法 通过PCR方法扩增获得腺病毒五邻体基因的完整序列,将此片段定向克隆到pQE30载体的多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用酶切鉴定方法与核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性.结果 用PCR法获得了人腺病毒的五邻体基因,将该基因正确地重组到表达质粒pQE30中,构建出腺病毒五邻体基因重组表达质粒pQE30-penton.结论 构建腺病毒五邻体基因重组表达质粒pQE30-penton.     

Myocardin表达载体的构建

目的 构建表达载体pEGFP-Myoc1,为转染人脐血间充质干细胞,实现其成平滑肌分化提供条件.方法 通过聚合酶链反应(PCR)以pAdApt.myoc1 为模板制备Myocardin目的 基因,通过pEGFP-N1载体线性化以及连接、转化等方法构建真核表达载体pEGFP-Myoc1,并通过酶切和测序对其序列进行鉴定.结果 正确构建了真核重组表达质粒pEGFP-Myoc1,基因测序结果表明,与Gene Bank公布的已知序列完全一致.结论 成功构建的真核重组表达载体pEGFP-Myoc1,为后续实验提供了基础.     

β-catenin腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人β-catenin基因的重组腺病毒载体,为进一步研究Wnt/Wingless信号通路在肿瘤发生发展中的作用机制奠定重要基础.方法:以含有β-catenin的pcmv-βNS-FC质粒为模板PCR获得目的基因,将目的基因定向克隆至腺病毒穿梭质粒构建阳性重组pAd track-β-catenin,并经PmeI线性化后在BJ5183细菌中与腺病毒骨架质粒pAd Easy-1同源重组获得β-catenin重组腺病毒载体,再将PacI线性化的腺病毒质粒转染HEK293细胞包装重组腺病毒.结果:PCR及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至腺病毒质粒中,目的基因序列与GENEBANK报道一致,荧光显微镜可观察到GFP的表达.结论:成功构建pAd-β-catenin腺病毒质粒载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒.     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建

目的 构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A（LMP2A）编码基因和即刻早期基因（BZLF1）融合基因的重组腺病毒表达载体。方法 逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头（Gly4Ser）3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A。经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A。结果 重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论 本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。     

EB病毒融合基因重组腺病毒表达载体的构建

目的构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cD-NA,采用剪接式重叠延伸(spliced overlap exetension,SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A。经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31kb和4.5kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。     

一种L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒的构建及高效表达

目的:拟通过构建人阴道毛滴虫的L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒,并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化表达产物,从而获得重组蛋氨酸裂解酶.方法:PCR法从人阴道毛滴虫的基因组中获得L-蛋氨酸γ-裂解酶获得L-蛋氨酸γ-裂解酶基因片段,并克隆至pGEX4T -2质粒,获得重组质粒,转化至大肠杆菌DH5α中,在异丙基-B-D-硫代半乳糖苷诱导下,实现高效表达,表达产物经亲和层析纯化获得重组L-蛋氨酸γ-裂解酶.结果:表达产物进行SDS - PAGE检测,结果表明在相对分子质量68000处出现高浓度的GST融合蛋白,相对分子质量与预期大小相符;薄层扫描显示重组蛋白占总菌量的33.6％.结论:人阴道毛滴虫的L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒构建成功,并成功地获得高效表达.     

PPARγ2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建携带PPARγ2基因的腺病毒载体.方法 采用PCR技术从pcDNA3质粒中扩增小鼠PPARγ2基因,将PPARγ2基因亚克隆至质粒穿梭载体pAd-Track-CMV.用脂质体(lipid body)转染法(infection protocol)将重组腺病毒pAd-Track-PPARγ2-CMV和pAdEas-1共转染293细胞,确定转染效率.结果 RT-PCR检测结果显示腺病毒Ad-PPARγ2PCR产物约为470bp;用抗PPARγ2单克隆抗体进行Western blot检测为阳性,感染的重组腺病毒载体在L02细胞中PPARγ2有较高的稳定表达.结论 成功构建携带小鼠PPARγ2基因的腺病毒载体.     

大鼠ZnT1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的利用GatewayTM技术构建含大鼠锌转运体1(ZnT1)基因重组腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达。方法采用化学合成的方法,合成ZnT1/RES/EGFP目的基因片段,通过PCR方法在基因片段两端加入attB重组位点,与含有attP重组位点的pDonr221供体载体BP反应形成入门载体pDown-ZnT1。将含有attL重组位点的入门载体与含有attR位点目的载体Ad/CMV/V5-DEST通过LR反应形成腺病毒表达载体pAd-ZnT1。酶切和测序鉴定后,由PacⅠ酶切线性化转染HEK293A细胞包装,提取病毒颗粒。采用终点稀释法测定重组腺病毒滴度;Western blotting技术分析目的蛋白表达情况。结果目的基因按正确的方向重组入克隆载体中,重组腺病毒表达载体在HEK293A细胞中包装成功,获得成熟的腺病毒颗粒,病毒滴度为1.6×108 pfu/L,在HEK293A细胞中高表达。结论该实验采用GatewayTM技术构建了含有大鼠ZnT1基因的重组腺病毒载体,为下一步研究该基因在脊髓神经细胞中的表达以及与BDNF/TrkB信号调节通路的关系奠定了基础。     

联合应用抗原递呈分子HSP70C基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有抗原加工递呈分子基因HSP70C的HTNV嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒。方法通过PCR扩增获得HSP70C基因,分别克隆入本室已构建的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7及pShuttle-pCAGGcS0.7中,进而构建新的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7-HSP70C及pShuttle-pCAG-GcS0.7-HSP70C。进一步通过双酶切将转移载体中的目的嵌合基因再分别克隆入腺病毒载体,得到重组腺病毒载体rAd-pCAG-GnS0.7-HSP70C、rAd-pCAG-GcS0.7-HSP70C,使用Pac I线性化后转染HEK293细胞,包装后获得重组腺病毒,感染HEK293细胞后用免疫荧光法检测表达产物。结果经过酶切、PCR扩增和测序结果显示,各重组腺病毒转移载体及重组腺病毒载体构建正确。免疫荧光实验检测到各重组腺病毒中目的蛋白的表达。结论成功制备了含抗原递呈分子HSP70C基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒,为进一步研究构建的汉滩病毒重组腺病毒的免疫学特性奠定了实验基础。     

HBV-TR重组腺病毒载体的构建

目的: 构建乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targeted ribonuclease, TR)基因的重组腺病毒载体. 方法: 将HBV-TR基因及其对照组基因分别克隆入质粒载体pDC316得到pDC316/TR等穿梭质粒,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre以磷酸钙法共转染HEK293细胞得到重组腺病毒Ad/TR及对照组重组病毒,并以空斑形成实验(Plaque Assay)测定病毒滴度. 结果: 成功构建了HBV-TR重组腺病毒载体Ad/TR及其对照组病毒并获得了高滴度的病毒颗粒. 结论: HBV-TR重组腺病毒载体成功构建.     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

人肝细胞癌抗原HCA661 DNA疫苗的构建

目的：构建人肝细胞癌特异性抗原HCA661的DNA疫苗。方法：通过PCR从SMMC7721中获得编码肝细胞癌特异抗原HCA661的基因组DNA序列,插入pGEM-T easy载体后测序,并将目的基因定向亚克隆进入真核表达载体pCI-neo,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pCI-neo-HCA661。结果：PCR产物为 1 040 bp,测序结果与Gene Bank登记完全相同;PCR和酶切结果表明,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的目的基因片段。结论：成功地构建了含有HCA661基因的DNA疫苗。     

定点突变重组ING4腺病毒基因转染系统的载体构建及鉴定

目的重组构建hING4（人ING4）氨基酸序列。方法运用定点突变技术,在鼠ING4的基础上,设计两对突变引物P1、P2和P3、P4及全长ING4上下游引物P5、P6,通过四轮PCR,将mING4基因序列进行人源化改造,获得了编码hING4氨基酸的基因序列。将获得酶切目的基因片段,连接到转移载体pAdTrack—CMV上,形成重组转移载体pAdTrack—CMV—ING4。重组转移载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒载体在BJ5183大肠杆菌中同源重组,得到重组腺病毒载体DAdeasy-1-pAdTrack—CMV—ING4,经PacI酶切后脂质体转染QBI-293A包装细胞,获得重组腺病毒Ad—ING4。结果测序和RT—PCR结果表明hING4基因构建成功。结论hING4基因重组腺病毒载体构建成功。     

耐药相关新基因HA117的克隆及重组腺病毒制备

目的:构建表达耐药相关新基因HA117的重组腺病毒表达系统.方法:用基因工程技术将耐药相关新基因HA117的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdEasy同源重组,将重组腺病毒Ad5-HA117经脂质体转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒,通过荧光显微镜及流式细胞仪进行检测.结果:酶切鉴定及PCR结果证明耐药相关新基因HA117重组腺病毒载体构建成功,构建的耐药新基因HA117重组腺病毒载体的效价达到8.3×1011PFU/ml.结论:成功构建了表达ATRA相关耐药新基因HA117的重组腺病毒载体,为后续对HA117基因的相关研究奠定了基础.     

HBx和mIL-12双基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12.方法 采用酶切、连接的方法分别将基因HBx和mIL-12连接到穿梭质粒载体pAdenoVator-CMV5.将构建正确的穿梭质粒pAdV-HBx-mIL-12经EcoR Ⅰ酶切线性化后,转化于含腺病毒骨架质粒pAdenoVatorΔE1/E3的BJ5183感受态细菌,实现细菌内同源重组.将鉴定正确的重组腺病毒质粒pAd-HBx-mIL-12经Pac Ⅰ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞,包装并扩增获得携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12.结果 经鉴定携带HBx和mIL-12双基因的重组腺病毒构建成功,并可在293细胞中有效表达.结论 成功构建了携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12,为探讨其联合抗肿瘤机制及后续基因治疗奠定了基础.