前列腺素合成酶的酶组织化学反应和定量化探讨

在组织切片上显示前列腺素合成酶的原理是该酶可催化底物花生四烯酸而氧化成前列腺素 ,反应中所形成的活泼氧原子又使 3,3′-二氨基联苯胺形成棕色沉淀 ,以间接证实前列腺素合成酶的存在。正常 Wistar大鼠和昆明小鼠 ,体重分别为 2 0 0 g和 2 0 g左右。取其肾和胃行 6 μm厚冰冻切片。用 Janszen显示法 :花生四烯酸 0 .4mg,DAB 2 mg,KCN 0 .6 5 mg和 0 .2 M Tris- HCl缓冲液 ( p H8.0 ) 1 0 ml,35℃孵育 3h。孵育后标本用蒸馏水洗 ,分别以甘油明胶和中性树胶封固。经 Leica Q5 0 0 MC图像分析仪进行平均灰度值 ( Mean Grey,MG)的测…     

大鼠心内神经节胆碱乙酰转移酶阳性神经元——免疫组织化学法研究

应用 ABC免疫组织化学技术对大鼠心内神经节胆碱乙酰转移酶阳性神经元进行了研究 ,发现大鼠心脏心房后壁神经节内存在着胆碱乙酰转移酶 ( Ch AT)免疫阳性神经元。材料与方法 ,成年大鼠 1 0只 ,雌雄不限 ,体重 1 5 0克左右 ,0 .4%戊巴比妥纳腹腔麻醉 ,经左心室 0 .9%Nacl灌洗 ,4%多聚甲醛 30 0 ml( p H7.2磷酸缓冲液 ) ,灌注固定。取心房后壁 ,后固定1 2 hr,常规石蜡包埋 ,切片厚 5 μm,切片脱蜡至水 ,用 SABC法免疫组织化学反应 :切片于 3% H2 O2 1 0 min,D· W洗 3次× 2 min,0 .0 1 M枸橼酸缓冲液 ( p H6 .0 )微波修复( 1 0 0℃ )…     

大鼠中央杏仁核内亮氨酸脑啡肽的分布

雄性Wistar大鼠6只,复合麻醉剂(Chloroper t)腹腔注射麻醉(3ml/kg),经左心室-升主动脉插管快速灌入生理盐水50m1,随后灌注1%多聚甲醛、0.2%苦味酸、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4,4℃)300ml,30min灌完。立即取脑,入同样固定液后固定2h(4℃),置入含30%蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液内(4℃)24h。恒冷箱连续冠状切片(厚48μm)。0.01mol/L PBS接片。第1抗体为兔抗L-ENK血清(INC产品),用ABC(Vector产品)程序孵育切片,DAB法呈色。对照实验采用替换实验和吸收实验,结果为阴性。     

一种显示网状纤维的方法

网状纤维是一种嗜银纤维 ,如用一般的银浸染 ,纤维难于分辨 ,而采用碳酸铵银法染色网状纤维的结构则显示得异常清晰。因而 ,碳酸铵银法是一种较理想的显示网状纤维的方法 ,现将该方法介绍如下 :1 .用岑克液或 1 0 %福尔马林固定脾、肝标本。 2 .切片脱蜡后蒸馏水洗数次。 3.将切片放入 0 .3%高锰酸钾内 5 min。 4.切片经水洗后入 5 %草酸漂白 ,至切片上的组织呈现为白色为止。 5 .蒸馏水洗数次后 ,置切片于碳酸铵银内 ( 5 0℃ ) 30 min。铵银液配方 :1 0 %硝酸银 1 0 ml,磷酸钾饱和液 1 0 ml,上述二液混合后产生沉淀 ,倾去上层液体 ,将沉淀…     

显示三磷酸腺苷酶和乙酰胆碱酯酶的结合染色技术

三磷酸腺苷酶 (ATPase)和 Ach E是研究中常用的两种酶 ,将两种酶同时显示在一张切片上 ,收到良好效果 ,特介绍如下。材料和方法 :取新鲜的动物肌组织 ,平铺于滤纸上 ,在冰冻切片机上 ,进行纵行切片 ,厚度 10～ 30μm。也可用 4%中性甲醛固定保存在 0～ 4℃的冰箱内 ,时间不宜过长 ,2 4～48小时内 ,仍可收到良好效果。 ATPace显色 :将切片放在下列的孵育液内。孵育液为 :0 .1巴比妥钠 2 0 m l,0 .18M氯化钙 10 m l,双蒸馏水 30 ml,ATP钠盐 15 2 mg,用 0 .1M Na OH调至 9.4,再加蒸馏水至 10 0 m l,每配一次可使用 1周左右。在孵育液内 …     

用组织化学DAB法显示微血管

组织化学中可应用二氨基联苯胺(DAB)法显示红细胞的过氧化氧化物酶,但应用DAB法显示微血管则在国内尚未见报道。我们经过多次摸索,终于应用DAB法显示微血管获得成功,并首次应用此法对大鼠、兔、猫等的脑、肝、肾、肠等器官进行试验,均取得了满意的效果。此法的操作过程是:动物快速断头或经麻醉后取材,固定于Baker福尔马林或含10%福尔马林的0.1 M磷酸缓冲液(pH 7.6)中1～数天。冰冻切片,厚100～300微米。切片入0.05%DAB液     

骨骼肌m-ATPase染色改良法

我们在实验中发现 ,用常规的钙钴法很少能保存骨骼肌中 ATP酶的活性 ,且 ATP酶对固定非常敏度 ;而使用未固定的材料骨骼肌中常出现人工假象。固定液的张力很重要 ,而蔗糖是把张力提高到足够水平的最适当添加物。我们将原 ATP酶钙钴法作了如下改进 :1.固定 :将新鲜骨骼肌组织用双面刀片切成约 1 mm厚的薄片 ,入固定液中固定1 0 min,4℃。固定液配制 :多聚甲醛 4g;二甲砷酸钠 3.0 8g;氯化钙 0 .75 g;蔗糖 1 1 .5 g;双蒸水加至 1 0 0 ml,调节 p H值为 7.2。2 .OCT包埋 ,- 2 0℃恒冷箱切片( 8μm) ,室温下自然干燥 30 min。3.切片预处理 1…     

显示ACPase和AKPase的简便方法

ACPase和AKPase是组织化学上最常研究的酶,因此Gomori硫化铅、钙钴法及其改良法,有关书刊上介绍各异。但在配孵育液时较繁琐,易沉淀,重复性差,要现配现用。经改良后的方法简便,省时省试剂,不沉淀,重复性好。单液分别配制,4℃下7-15天仍可用,一、ACPase的显示:冰冻切片。配孵育液:①0.3％硝酸铅0.1(pH4.6-4.7)醋酸缓冲液。②0.3％β-甘油磷酸钠水溶液。临用时取①10ml②30ml温合。37℃下孵育10-20分钟(石蜡切片时间要长)。蒸馏水快洗2-3次。入1％硫化铵数秒到1分。入此     

NO合成酶神经元在大鼠大脑皮质顶叶的形态特点及分布

<正>本实验选用成年雄性SD大鼠15只,经多聚甲醛灌注固定.通过顶叶,冠状切取2mm厚的脑组织块,冰冻切片20～30μm厚,用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)脱氢酶组织化学染色,采用0.1M磷酸缓冲液pH7.4洗切片3次,入Triton—1000.3%室温下(20℃左右)5’～10’酶组织化学处理,Nitroblue Te-trazc lium 0.1mg/ml+1.0mg/ml NADPH(SIGMA公司),稀释液为0.1M Tris—HCl pH 8.0,37℃孵育60’,效果较好.观察结果:NO合成酶神经元各层均有,以Ⅴ—Ⅵ层最多,其次是Ⅱ—Ⅲ层,最少是Ⅰ怪.通过     

灯盏花素在家兔体内的药动学研究

建立了测定家兔血浆中灯盏花素主要有效成分灯盏乙素浓度的 RP- HPL C法 ,研究灯盏花素静脉注射给药后在家兔体内的药动学。色谱柱为 Diam onsil TMC18柱 (钻石 ,4 .6 m m× 2 5 0 m m,5 μm) ;流动相为 p H3.0的磷酸盐缓冲液 (0 .0 2 mol磷酸二氢钠用磷酸调 p H至 3.0 ,用 0 .4 5 μm水性滤膜滤过 ,即得。) -甲醇 -乙腈 (6 5 :35 :10 ) ;流速 1m l.m in- 1 ;柱温 2 5℃ ;检测波长 :334nm。灯盏花素静脉注射给药后主要有效成分灯盏乙素在家兔体内的药动学结果表明 ,灯盏乙素的药 -时曲线符合二室模型 ,主要药动学参数 t1 /2 α和 t1 /2 β分别为 1.2 9± 0 .5 3m in和10 .4 0± 1.97min;Vc为 14 8.1± 118.6 ml;CL 为 5 7.5± 31.7m l· min- 1。     

微波修复在冰冻切片免疫组化中的应用

微波修复法多用于石蜡切片 ,我们在长期的研究生免疫组化教学过程中 ,实行改良 ,将微波抗原修复法用于冰冻切片 ,取得了满意的效果 ,方法如 :1.常规固定取脑组织冰冻切片。 2 .漂洗后 3%H2 O2 封闭 10分钟 ,蒸馏水洗 2分钟 3次。3.微波抗原修复 :入柠檬酸盐缓冲液 (PH6 .0 ) ,用微波或电炉加热 ,循环 3次后入 1% BSA孵育 15分钟。 4.入一抗 30分钟 ,转入二抗2 0分钟 ,三抗 2 0分钟 ,显色。结果讨论 :1.与对照切片成比 ,阳性细胞染色增强 ,背景变浅 ,阳性检出率提高。由于常规的冰冻切片免疫组化方法所用的固定剂多含甲醛 ,醛基与蛋白质中…     

增强免疫金银法敏感性的探讨

试剂:兔抗5-HT抗体,为INC产品。胶体金标记的羊抗兔抗体,为陕西中医研究院病理室产品。材料:豚鼠小肠段经Bouin氏液浸泡固定后,制成6μm厚的小肠卷石醋切片。免疫金银法的程序:石醋切片按常规脱蜡到蒸馏水。入0.05 M TBS pH 7.45分钟×2。滴加3%正常牛血清(用0.05 M TBS pH 7.4配制)10分钟。滴加5-HT抗体(1:1000～1:90000)在不同温度(4℃～37℃)孵育不同时间(3小时～24小时)。于0.05 M TBS pH 7.4洗5分钟×3。于0.02 M TBS pH 8.2配制)10分钟。滴加胶体金标记的羊抗兔抗(1:30稀释)于室温孵育60分钟。入0.02 M TBS pH 8.2洗5分钟×2。入0.05M TBS pH 7.4小船坞钟×2。入蒸馏水洗4分钟×3。入银显色     

大白鼠脚内核至外侧缰核投射的突触特点——WGA-HRP顺行标记法电镜研究

实验用大白鼠6只,经戊巴比妥钠麻醉后,于定向仪上,通过微玻管将2～5%WGA-HRP 的Tris 溶液(pH 8.2)微电泳入脚内核,电流强度为3μA,持续通电6～10 min。术后存活2天,用含1%多聚甲醛和1.25%戊二醛的磷酸缓冲液灌注取材,取出脑后,置于2%戊二醛的磷酸缓冲液中后固定4h(4℃),于5%蔗糖磷酸缓冲液中置冰箱内(4℃)过夜。震动切片机切片,厚100μm,作 TMB     

家鼠类肾上腺嗜铬细胞简易染色法

一、染色方法 :( 1 )固定小家鼠肾上腺髓质于下列固定液中 2 4hr:即 3%重铬酸钾水溶液 1 0 ml,1 0 %福尔马林 2 0 ml,蒸馏水2 0 ml。 ( 2 )移浸入 3%重铬酸钾水溶液 48hr。( 3)水洗 2 4hr。 ( 4 )石蜡包埋、切片。 ( 5 )切片脱蜡至蒸馏水。 ( 6 )常规苏木素染液 1 5 min、水洗。 ( 7) 1 %盐酸酒精分化适度、水洗1 5 min。 ( 8)各级酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。结果 :肾上腺髓质嗜铬细胞颗粒呈现棕黄色 ,细胞核呈蓝色。二、注意事项 :( 1 )动物选择家鼠类 ,组织力求新鲜。 ( 2 )固定液临用前配制。 ( 3)组织铬化过程需每日更换新液…     

显示三磷酸腺苷酶和乙酰胆碱酯酶的结合染色技术

三磷酸腺苷酶(ATPase)和AchE是在科学研究中常用的两种酶,在科学研究中为了同时观察肌肉和神经中两种酶的分布和酶的活性,经实验研究,将两种酶是时显示在一张切片上,收到良好效果,特介绍如下。1　材料和方法1.1　组织的制备,取新鲜的动物肌组织,平铺于滤纸上,用冰冻切片机上,行纵行切片,厚度可切10～30μm,用4%中性甲醛固定保存在0～4℃的冰箱内,时间不宜过长,如固定24～48小时内,仍可收到良好效果。1.2　结合染色程序(1)ATPase显色,将切片放在下列的孵育液内。孵育液为:0.1巴比妥纳20ml,0.1gM氯化钙10ml,双蒸溜水30ml,ATP钠盐152mg。…     

胰岛B细胞、A细胞的快速双染

组织学特殊染色技术及免疫组织化学技术已广泛应用于基础医学和临床医学的科研工作中。本快速染色法即用组织学醛品红染色法和免疫组织化学 SP法在同一张切片上对胰岛 B细胞和 A细胞进行了双重染色 ,取得较好的效果 ,现作简单介绍。取大鼠胰腺 ,Bouin液固定 ,石蜡包埋 ,切 5 μm厚切片。双染步骤如下第一步 ,胰岛 B细胞的醛品红染色 :切片脱蜡到水 ;入 0 .2 5 %浓硫酸和 0 .2 5 %高锰酸钾等量混和液中 3min;蒸馏水洗后入 5 %草酸 2 min;蒸馏水洗 ;再经 70 %酒精后入醛品红染液 1 5 min;70 %酒精分色后 ,蒸馏水洗。第二步 ,胰岛 A细胞的免…     

松果体胆硷酯酶阳性神经的分布

<正> 用大白鼠22只,体重200克左右,10％福尔马林生理盐水灌注,取松果体浸泡于30％蔗糖缓冲液中过夜,然后分三组实验。第一组动物12只,将松果体冰冻切片,厚40微米,然后入下述孵化液2小时(37℃),显示胆硷酯酶。即乙酰硫代胆硷7mg,蒸馏水1ml,0.1M磷酸氢二钠4.5ml,0.1M磷     

抗原免疫对外周淋巴器官中细胞凋亡的影响

日的 :观察抗原免疫刺激后外周淋巴器官中细胞凋亡的情况。方法 :用完全佛氏佐剂免疫 B1 0 .A小鼠 ,2 1天后解剖 ,取出腹部淋巴结 ,制成冰冻切片。采用 TUNEL原位染色法 ,步骤如下 :1 .制备冰切片 ,过夜 ;2 .用 4%多聚甲醛 ( PBS,p H7.4)固定1 0分钟 ,然后 PBS洗 30分钟 ;3.用 3% H2 O2 (甲醇稀释 )封闭 ,室温下1 0分钟 ,然后 PBS洗 30遍 ;4.用 0 .1 % Triton X- 1 0 0 ( 0 .1 %柠檬酸钠 )在冰上 ( 4℃ )作用 2分钟 ,然后 PBS洗2遍 ;5 .擦干切片 ,每张加 5 0μl TUNEL反应混合液 ,置于湿盒中放于 37℃反应 30分钟 ,然后 PBS洗 …     

10%福尔马林与中性福尔马林的比较

传统上我们都采用 1 0 %福尔马林固定组织。福尔马林系甲醛液的俗称 ,是由甲醛 ( Formaldeny de HCHO)气体饱和于水而成。一般市售的福尔马林含甲醛 37%～40 %。配法 :取 40 %甲醛液 1 0 ml与蒸馏水90 ml混合 ,即得 4%甲醛 ,亦即 1 0 %福尔马林。由于福尔马林久存则氧化产生甲酸 ,呈酸性 ,固定标本不适宜 ,特别是需长期固定的组织更不适合 ,故我们主张采用中性福尔马林固定组织标本。其配法如下 :40 %甲醛 1 0 0 ml酸性磷酸钠 (或无水磷酸二氢钾 ) 4.0 g磷酸氢二钠 6 .5 g蒸馏水 90 0 ml因中性福尔马林中加入了磷酸缓冲液 ,不易被氧化 ,能…     

豚鼠耳蜗内Corti氏器NOS免疫组织化学研究的体会

内耳骨迷路埋藏在颞骨岩部内 ,对内耳的免疫组化研究技术关键在于脱钙 ,既要制作出完整的耳蜗切片 ,又要保存抗原。特别是一氧化氮合酶 ( NOS)本身是一种蛋白质 ,更容易受温度和酸度的影响。本实验选用中性脱钙剂对内耳进行脱钙 ,改良石蜡包埋法进行石蜡包埋切片 ,取得了良好效果。现介绍如下 :1 .实验材料与方法 :( 1 )取豚鼠1 0只 ,快速断颈处死 ,沿外耳颞侧暴露出内耳 ,取出螺旋器 ,先从蜗底以 5号针刺一小孔 ,再吸取适量的 4%多聚甲醛固定液 (用p H7.4的 0 .1 M PB配制 )自蜗顶注入膜蜗管内 ,将螺旋器放入 4%多聚甲醛固定液内继续固…