抗丙型肝炎病毒5‘非编码区核酶自剪切真核表达载体的构建

引言丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因变异率高，病毒准种多，使ＨＣＶ疫苗的研制遇到一定困难，目前的抗病毒治疗和免疫治疗也不令人满意．核酶（Ｒｚ）作为抗病毒基因治疗的重要策略之一，已在多种病毒显示出潜在的应用价值．抗ＨＩＶＲｚ是目前研究最多、取得效果也最好的抗...     

锤头状核酶RCP对HBV的P基因体外转录物的作用

本文根据Ｈａｓｅｌｏｆｆ和Ｇｅｒｌａｃｈ发表的锤头状核酶结构，设计合成了针对ＨＢＶａｙｗ株Ｐ基因５＇－端２３６０位点（ＧＵＣ）的核酶ＲＣＰ，其作用底物为ＨＢＶａｙｗＰ基因的翻译起始区（２１４０－２４２２区段），运用基因克隆结合体外转录的方法，评价了ＲＣＰ的切割活性，结果表明，ＲＣＰ在体外成功地切割了长为３４０个核苷酸的靶ＲＮＡ分子，这一工作为多们进一步在细胞内评价ＲＣＰ抑制ＨＢＶ全基因组复制及其知     

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

HBV全基因真核细胞表达载体的构建及表达

目的：构建全基因HBV真核细胞表达载体,并对其在细胞内的复制、转录、翻译进行研究。方法：采用分子亚克隆技术,将长约3.2Kb的HBV全基因克隆到真核细胞表达载体pBK-CMV折EcoPI位点,构建的pKB-HBV经FUGENE^TM6导入人肝癌细胞系SMMC－7721细胞中。结果：经PCR、RT－PCR验证pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制和转录。固相放免法显示HBV转染细胞内的HBsAg、HBeAg的合成和分泌。免疫组化法证明,胸内浆型分布为主的HBcAg的表达。结论：HBV全基因真核细胞表达载体pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制、转录及表达。     

乙型肝炎病毒C基因启动子变异株克隆的构建及应用

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）C基因启动子（BCP）变异株克隆。方法：采用PCR产物克隆法。结果：构建成功pBCM质粒，经克隆鉴定及错配PCR－RFLP证实为目的克隆。结论：质粒pBCM可作为错配PCR－RFLP检测HBV BCP基因变异株检测的阳性对照。     

丁型肝炎病毒基因组核酶的反式剪切活性

目的 观察丁型肝炎病毒２种基因组核酶（ＨＤＶ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｉｂｏｚｙｍｅ，ｇ Ｂｚ）是否存在式剪切活性。方法 合成ｇ。．Ｒｚ７４、ｇ．Ｒｚ５５的ＣＤＮＡ，克隆人质粒ｐＧＥＭ－４Ｚ，体外转录获取核酶ＲＮＡ，同时从质粒Ｒｚ２７７Ｂ上转嫌出同源性底物ＲＮＡ，以β－３２ｐ－ＵＴＰ标志，再将核酶与底物按比例混合，在一定条件下观察是否出现的剪切作用，结果 启动反应３０ｍｉｎ后，可以观察到的切产物，９０ｍ     

乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响

惭型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。方法 利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶构建Ｒｚ１核酶自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１）,观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。结果 核酶自剪切转录载体体２上转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪     

剪切HCV RNA的HDV核酶的设计及活性测定

目的：探讨丁型肝炎病毒（Hepatitis D virus,HDV）核酶用于抗丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）基因治疗的可能性。方法：以HDV基因组核酶的假结样结构为基础,优化其茎IV区,改建基底物结合区,获得3种针对HCV RNA的HDV核酶RzC1、RzC2和RzC3。体外转录获取含HCV RNA5‘－非编码区（5‘-noncoding region,5‘-NCR）及部分C区在内的底物RNA（HCV RNA 5‘－NCR－C）,并进行5‘端放射性标记。在pH7.5、37℃、Mg^2 20mmol/L和去离子甲酰胺2.5mol/L等条件下,将核酶和底物按摩尔比100：1混合,在不同的时间点观察剪切百分率。结论：RzC1、RzC2对底物的剪切百分率随时间延长而递增,90min分别达24.9％、20.3％;未观察到RzC3有剪切活性。结论：经过结构构优化的HDV基因组核酶在合适的位点能够剪切异源性RNA分子HCV RNA。     

反义乙型肝炎病毒S基因T载体克隆的构建

目的:构建含部分乙型肝炎病毒(HBV)S基因反义序列的基因克隆.方法:根据GenBank中HBV S基因序列和计算机软件mCLONE分析的结果,设计S基因2侧引物,直接扩增出适合长度的反义HBV S基因,与PMD18T载体连接后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析.结果:获得226 bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆经PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段的反向序列与GenBank中该基因的序列同源性为97%.结论:成功构建了含反义HBV S基因部分序列的T载体克隆.     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒C基因启动子变导异的初步研究

为建立快速特异检测乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒（HBV）DNA的聚合酶链式反应（PCR）方法,产初步分析患者体内乙型肝炎病毒C基因启动子（HBV.CP）变异的情况,对PCR法扩增的HBV DNA直接测序,并应用计算机进行DNA同源性分析。结果显示：应用PCR法扩增20份慢性乙肝患者血清阳性率为95%（19/20）;选择中度、重度乙肝患者血清和pGEM.7Z-HBV质粒扩增的HBV.CP各1份分别测序,与报告基因的同源性分别为72.0%、66.5%、90.0%。研究表明,PCR法可用于HBV.CP区变异的检测,慢性乙型肝炎患者存在该区变异。     

乙型肝炎病毒C基因启动子变异的意义

目的 了解Ｃ基因启动子区Ｔ１７５２Ａ１７６４变异对其启动子的影响。方法ＰＣＲ产物 直接测序，检测重症乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）前Ｃ和Ｃ基因调节序列的Ｔ１７６２Ａ１７６４野株及变异；并将该调节序列插入到氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）表达质粒中，转染ＨepＧ２细胞并瞬时表达，比较Ｔ１７６２Ａ１７６４野株及变异株的Ｃ基因启动小区序列及ＣＡＴ表达水平。结果Ｔ１７６２Ａ１７６４变异在使ＣＡＴ表达下调中起主要     

DNA体外扩增诊断乙肝病毒C基因的研究

应用本室建立的聚合酶链式反应（PCR）系统，利用20bp与21bp的一对特异寡核苷酸引物介导，扩增HBV－C基因区578bp片断。经凝胶电泳，紫外分析以及Suthern印迹杂交表明，扩增产物正确，效果满意。     

乙型肝炎病毒C基因启动子变异的研究现状

乙型肝炎病毒 (HBV)是目前我国病毒性肝炎的主要病因。一般认为在 HBV感染过程中 ,宿主免疫应答决定其进展和转归。当机体免疫功能低下时 ,病毒持续复制而分泌出 HBe Ag,但随着病情的好转 ,病毒复制停止而发生 HBe Ag阴转而出现抗 -HBe。因此 ,过去临床上常将 HBe Ag/抗 - HBe的血清转换认为是病情的好转 ,但近年来由于 PCR技术的应用 ,研究者们发现在许多 HBe Ag阴性和 /或抗 -HBe阳性的肝病患者血清中有高水平的 HBV-DNA。HBV变异问题是当前病毒性肝炎研究的一个热点 ,国内外许多学者对其进行大量研究 ,本文对乙型肝炎病毒…     

HBV前C基因变异株克隆的构建

采用PCR扩增产物克隆法构建HBV前C基因变异株克隆。成功构建pCM质粒，经克隆鉴定及错配PCR－RFLP证实为目的的克隆。因此，质粒pCM可作为错配PCR－RFLP检测HBV前C基因变异株阳性对照。     

针对HBs基因的shRNA表达载体的构建及鉴定

目的以PGenesil-1(Pg)为载体构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(Pgs)。方法设计、合成针对HBs区的三对DNA序列,分别插入PGenesil-1中,并对重组质粒进行限制性内切酶谱和DNA序列测定分析。结果3个不同的重组shRNA表达载体经限制性酶识别和DNA序列测定完全正确。结论成功构建了3个针对HBs基因的shRNA表达载体。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达的载体构建及鉴定

目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物,以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列;将X基因连接到真核表达载体pCDNA3.1上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的为研究HBVX基因（HBx）与原发性肝细胞癌发生的关系，克隆HBx的cDNA并构建HBx真核表达载体。方法 利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法从HepG2．2．15细胞中扩增出HBx的cDNA，克隆到质粒PCDNA3．1中。结果RT—PCR扩增出约460bp片段，经酶切鉴定显示HBx的cDNA真核表达载体（HBx—PCDNA3．1）构建成功，测序结果显示HBx的cDNA与已发表的的序列相同。结论成功地构建了HBx的真核表达载体HBx—PCDNA3．1。     

丙型肝炎病毒不同基因片段真核表达载体的构建与鉴定

引言丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染，迄今仍无特效疗法及预防性疫苗．１９９２年Ｔａｎｇ等［Ｎａｔｕｒｅ，１９９２；３５６：１５２］率先报道在体内经质粒表达的异体蛋白免疫小鼠，成功地诱导产生了针对这种抗原的抗体反应；１９９３年Ｕｌｍｅｒ等［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１...     

c-myc基因mRNA核酶真核表达载体的构建和鉴定

0　引言　冠状动脉腔内球囊成形术 (PTCA)被公认为是治疗冠心病最有效的非手术方法 ,然而 PTCA术后 6 mo球囊扩张动脉段再狭窄的发生率达 30 %以上 ,其中血管平滑肌细胞的增殖、向内膜下迁移是再狭窄的主要病理改变之一 [1 ] .研究表明 ,c- myc基因属于速发 -早期基因 ,编码产物为核内DNA结合蛋白 ,在核内的信息传递过程中起重要作用 ,可促进与细胞增殖有关的基因开放 ,产生细胞增殖效应 ,是血管平滑肌细胞增殖、迁移的触发和调控因素 ,在再狭窄的发生过程中起重要作用 [2 ,3] .我们在计算机辅助下设计了特异性切割c- myc基因 m RNA的…