用于HIV诊断的Oligo基因芯片研制

目的 研制快速筛查诊断HIV病毒的Oligo芯片。方法以HIV-1B亚型U26942全基因组序列为靶序列,利用DNA Club、Oligo 6.0、BLAST、Alignment等生物信息学软件,设计高度特异、长度均一、具近似熔解温度(T_m)的Oligo 探针,并制备成Oligo芯片。B(U26942)、C(U46016)、F(AF075703)、G(AF061640)四种亚型质粒分别经RD-梯度PCR与随机特异性引物PCR,经荧光标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果 与结论 获得22条60mer 探针,Oligo芯片特异性、敏感性及稳定性好,为进一步应用提供了条件。     

B19微小病毒70-mer寡核苷酸探针的设计

目的　设计B19微小病毒诊断基因芯片的寡核苷酸探针。方法　以微小病毒B19为例 ,利用BLAST软件对其序列进行比对并获得特异序列 ;利用软件Oligo 6设计特异性高、Tm值接近、长度均一的寡核苷酸探针。 结果　获得 12条 70 mer寡核苷酸探针 ,用于芯片打印及病毒检测。结论　利用BLAST系统和生物学软件Oligo 6可简便而有效地设计诊断芯片探针     

HSV-2的生物信息学分析及其探针设计的探讨

目的 利用生物信息学分析单纯疱疹病毒2型(HSV-2)基因序列的特点,设计HSV-2诊断芯片的Oligo探针. 方法 利用Matlab7.0和ANTHEPROTV5对HSV-2序列进行分析,并通过BLAST软件对HSV-2的DNA序列进行序列比对,得到有意义的特异序列;用生物学软件Oligo6.0设计特异性高、Tm值相近、长度均一的Oligo探针. 结果 利用Madab7.0和ANTHEPROT V5分析HSV-2二级结构的分布以及其理化性质,同时生物学软件Olig06.0获得13条60-merOligo探针.结论通过生物信息学设计HSV-2诊断芯片的探针,可为后期打印成DNA芯片,用于HSV-2的检测打下基础.     

登革病毒cDNA的生物信息学分析及其Oligo探针设计

目的设计登革病毒诊断芯片的Oligo探针。方法利用BLAST软件对4型登革病毒的cDNA序列进行序列比对,得到有意义的特异序列;然后用生物学软件Oligo6.0设计特异性高、Tm值相近、长度均一的Oligo探针。结果获得48条70-mer Oligo探针,用于打印成DNA芯片,进行登革病毒的检测。结论利用BLAST系统和生物学软件Oligo6.0设计登革病毒诊断芯片的探针,是一种简便可行、有效的方法。     

登革病毒cDNA的生物信息学分析及其O1igo探针设计

目的 设计登革病毒诊断芯片的Oligo探针。方法 利用BLAST软件对4型登革病毒的cDNA序列进行序列比对，得到有意义的特异序列；然后用生物学软件Oligo6．0设计特异性高、Tm值相近、长度均一的Oligo探针。结果 获得48条70-mer Oligo探针，用于打印成DNA芯片，进行登革病毒的检测。结论 利用BLAST系统和生物学软件Olig06．0设计登革病毒诊断芯片的探针，是一种简便可行、有效的方法。     

非修饰性寡核苷酸芯片用于HLA-DQA分型的初步研究

利用非修饰寡核苷酸基因芯片技术,根据HLAⅡ类抗原DQA位点不同基因亚型的特异性序列设计探针,制成分型芯片;待测样本经PCR反应标记上荧光之后,与探针在芯片上进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值,确定样品DQA位点基因亚型。将这一方法应用于125例临床样本和10例标准品的HLA-DQA分型,该方法分型的结果与准确结果相比,准确率达到93.3%。实验结果表明:非修饰性寡核苷酸芯片用于HLA-DQA分型技术可行。     

HIV基因芯片的初步研究

目的：建立HIV基因检测芯片的分析技术，方法：分离HIV 1U26942基因限制性显示片段作探针，应用PixSys 5500点样仪将探针打印在氨基包被的玻片上制作基因芯片，然后与随机引物荧光标记的HIV样品进行杂交，以分析限制性显示基因片段的杂交动力学，经杂交后清洗和干燥，扫描芯片进行检测。结果：对基因检测芯片的制作与检测的实验条件进行了初步研究并筛选了12个限制性显示基因探针。结论：建立的检测芯片的实验方法可行且较特异。     

HIV基因芯片的初步研究

目的建立HIV基因检测芯片的分析技术。方法分离HIV1U26942基因限制性显示片段作探针,应用PixSys 5500点样仪将探针打印在氨基包被的玻片上制作基因芯片。然后与随机引物荧光标记的HIV样品进行杂交,以分析限制性显示基因片段的杂交动力学。经杂交后清洗和干燥,扫描芯片进行检测。结果对基因检测芯片的制作与检测的实验条件进行了初步研究并筛选了12个限制性显示基因探针。结论建立的检测芯片的实验方法可行且较特异。     

60 mer长寡核苷酸微阵列构建的优化

目的　优化长寡核苷酸芯片方阵的构建。方法　采用4种不同玻片表面,4种点样液溶解经设计高度特异性探针,制备长寡核苷酸芯片。样品经RD -梯度PCR扩增标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果　点样液3×SSC与丙烯酰胺聚合物表面(国产玻片)联合使用杂交效果最佳。结论　该研究优化了长寡核苷酸芯片微阵列的构建,为芯片的下游技术发展提供支持。     

流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

荧光原位杂交检测人类免疫缺陷病毒-1 DNA对感染者外周血淋巴细胞染色体的整合

目的：探讨荧光原位杂交（FISH）检测人类免疫缺陷病毒（HIV-1）前病毒DNA对外周血淋巴细胞（PBL）染色体整合的可行性与效率。方法：收集3例HIV-1感染者,常规制备其PBL染色体,采用FISH方法,以生物素标记的HIV-1gag及HIV-1pol的cDNA作为探针,检测HIV前病毒在其中的整合。结果：观察了172套来源于3位感染者PBL的染色体,6套有阳性荧光信号。结论：FISH可用于检测HIV前病毒DNA对患者PBL染色体整合,且是一种灵敏、可靠的方法。     

利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。     

HIV-1感染者外周血单个核细胞缺损病毒基因的研究

目的:研究HIV-1感染者缺损HIV-1 DNA的特性.方法:用长片段PCR法(LD-PCR)研究分析HIV-1感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear, PBMCs)和体外培养感染淋巴细胞中HIV-1基因特征,使用位于HIV-1 DNA链两端的LTR(U5)、LTR(R)为引物,插入有全长HIV-1基因片段的大肠杆菌质粒PNL4-3等为标准对照,并对部分标本克隆测序.结果:经扩增9.1 kb是LD-PCR的主要产物,但在10例HIV-1感染者中有9例PBMCs检测出大小不一、范围较广的缺失HIV-1基因片段,经用基因探针杂交,发现近HIV-1基因中心部位缺失频率增加,缺失结合点常存在3～4个核苷酸短片段直接重复,体外培养中HIV-1基因缺损量减少,完整和缺失基因的存在与培养中病毒分离的时间密切相关.结论:HIV-1感染者PBMCs中存在大量HIV-1基因重组和缺损片段.     

肝炎诊断芯片60-mer长链寡核苷酸探针的设计研究

目的:通过生物信息学软件对易引起慢性肝炎的三种肝炎病毒基因组结构进行分析,设计肝炎病毒诊断分型芯片的寡核苷酸(O ligo)探针。方法:利用BLAST软件对乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)、丙型肝炎病毒(HCV)6个亚型的DNA及cDNA序列进行序列比对,得到有意义的特异序列;然后用生物信息学软件Array designer 3.0设计特异性高、Tm值相近、长度均一的O ligo探针。结果:获得156条60-m er探针,用于打印成DNA芯片,进行HBV、HDV的联合检测和HCV的基因分型。结论:利用BLAST检索系统和生物学软件Array desig-ner 3.0设计肝炎病毒诊断分型芯片的探针,是一种简便可行、有效的方法。     

黄热病病毒检测基因芯片的研究制备

目的制备黄热病病毒寡核苷酸检测芯片。方法根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出22条寡核苷酸探针用于制备基因芯片。克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因经限制性显示技术完成扩增并标记,杂交清洗后对芯片进行扫描和数据分析。结果大部分黄热病病毒寡核苷酸探针检测出阳性信号,阴性对照和空白对照检出阴性信号。结论基因芯片技术为黄热病病毒检测提供了一种早期、快速、可靠的方法。     

乙肝病毒基因分型检测芯片的构建及初步应用

目的:构建乙肝病毒(HBV)常见基因型的分型芯片,并应用分型芯片调查HBV基因型分布。方法:应用生物信息学软件针对乙肝病毒4种常见基因型的特征区域和保守区域分别设计分型探针和通用探针,在优化条件下通过重复杂交及分型测序检验芯片的重复性与可靠性后应用于临床,对150例不同类型的乙肝患者进行HBV基因分型。结果:分型探针和通用探针检测重现率分别为94.7%及100%,反馈的测序结果与芯片分型结果完全一致;经芯片分型发现辽宁省HBV基因型分别为C型占68.7%,B型占22.7%,B、C混合型占8.7%,未发现A、D型。结论:基因芯片技术为乙肝病毒基因分型提供了快速准确的检测方法,辽宁地区HBV基因型分布以B、C两型为主,C型占主要优势。     

The detection of HBV DNA with gold nanoparticle gene probes

Objective:Gold nanoparticle Hepatitis B virus (HBV) DNA probes were prepared, and their application for HBV DNA measurement was studied. Methods:Alkanethiol modified oligonucleotide was bound with self-made Au nanoparticles to form nanoparticle HBV DNA gene probes, through covalent binding of Au-S. By using a fluorescence-based method, the number of thiol-derivatized, single-stranded oligonucleotides and their hybridization efficiency with complementary oligonucleotides in solution was determined. With the aid of Au nanoparticle-supported mercapto-modified oligonucleotides serving as detection probes, and oligonucleotides immobilized on a nylon membrane surface acting as capturing probes,HBV DNA was detected visually by sandwich hybridization based on highly sensitive aggregation and silver staining. The modified nanoparticle HBV DNA gene probes were also used to detect the HBV DNA extracted from serum in patients with hepatitis B. Results:Compared with bare Au nanoparticles, oligonucleotide modified nanoparticles had a higher stability in NaCl solution or under high temperature environment and the absorbance peak of modified Au nanoparticles shifted from 520nm to 524nm. For Au nanoparticles, the maximal oligonucleotide surface coverage of hexaethiol 30-mer oligonucleotide was (132 ± 10) oligonucleotides per nanoparticle, and the percentage of hybridization strands on nanoparticles was (22 ± 3% ). Based on a two-probe sandwich hybridization/nanoparticle amplification/silver staining enhancement method, Au nanoparticle gene probes could detect as low as 10-11 mol/L composite HBV DNA molecules on a nylon membrane and the PCR products of HBV DNA visually. As made evident by transmission electron microscopy, the nanoparticles assembled into large network aggregates when nanoparticle HBV DNA gene probes were applied to detect HBV DNA molecules in liquid. Conclusion:Our results showed that successfully prepared Au nanoparticle HBV DNA gene probes could be used to detect HBV DNA directly. The detection-visuallized method has many advantages, including high sensitivity,simple operation and low cost. This technique has potential applications in many fields, especially in multi-gene detection chips.