共刺激分子B7-H1转染角朊细胞对T细胞增殖、细胞因子分泌和表面标记的作用

分析B7 H1共刺激分子阳性细胞激活的T细胞亚群表面标志和细胞因子分泌格局的变化 ,初步鉴定所诱导具有调节功能的人体T细胞亚群生物学特性。用抗CD3、CD2 8抗体分别作为第一和第二信号的来源 ,建立了T细胞体外增殖体系 ,引入B7 H1阳性A4 31细胞。结果表明B7 H1阳性A4 31细胞提供第二信号并加入抗CD3分子时 ,引起纯化的T细胞中等程度增殖 ,IL 10和TGF β升高 ,CD4 5RBlowT细胞亚群比例增加。而在阳性对照组 (同时加抗CD3和抗CD2 8抗体 )可见T细胞高度增殖 ,此时再加入B7 H1阳性A4 31细胞 ,增殖反应受到抑制 ,加入B7 H1封闭型单抗 ,抑制缓解。认为B7 H1阳性A4 31细胞具有双向效应 :当CD2 8不参与共刺激时 ,由B7 H1发挥共刺激作用 ,协同抗CD3抗体引起T细胞增殖 ;一旦T细胞从抗CD3和抗CD2 8抗体获得第一和第二信号出现高度增殖时 ,B7 H1阳性A4 31细胞发挥抑制作用。B7 H1阳性A4 31细胞提供第二信号的T细胞增殖 ,含有呈现典型Tr1细胞表型。针对增殖性T细胞应答 (如移植排斥 ) ,表达B7 H1的非专职性抗原递呈细胞KC ,可选择性诱导人体调节性T细胞 (Tr1)的分化 ,发挥负向调节作用。     

可诱导共刺激分子的研究进展

可诱导共刺激分子 (InducibleCostimulatoryMolecule ,ICOS)是新发现的表达于活化T细胞的共刺激分子 ,属CD2 8/CTLA 4家族。ICOS的小鼠配体B7RP 1和人类配体B7 H2具有不同的表达形式和条件。人类ICOS通路可被抗原 TCR信号和IL 2激活。该共刺激通路诱导T细胞分化、增殖并分泌IL 4、IL 10、IFN γ和TNF γ等细胞因子 ,对B细胞和CTL细胞免疫应答也有一定的影响。阻断ICOS通路会引起T细胞凋亡。ICOS与CD2 8通路无功能交叉性 ,在免疫应答过程中具有重要而且独特的作用。     

B7-DC可通过IFN-γ调节小鼠的哮喘反应

Th1/Th2细胞在过敏性哮喘炎症发展中有重要的作用 ,而APC细胞和T细胞的相互作用是决定Th2细胞效应发展的关键 ,是诱导哮喘发病的第一步。研究表明APC/T细胞相互识别中B7家族协同刺激信号分子和其配体的结合是诱导Th2效应的关键。新发现的B7家族成员B7 H1和B7 DC是CD2 8/CTLA 4家族成员PD 1的配体 ,B7 H1/B7 DC与PD 1的结合可抑制TCR介导的T细胞的增殖和细胞因子的产生 ,下调T细胞的活性。然而又有实验表明 ,静息T细胞可被CD3单抗和B7 DC/B7 H1 Ig刺激后活化增殖 ,并伴有IFN γ、GM CSF、IL 10等细胞因子的表达增高…     

rIL-2、IFN-γ和胸腺肽对T细胞共刺激信号分子CD137表达的影响

外周血静止T细胞成为有功能活性T细胞需两个独立的刺激信号系统 ,即第一信号 (MHC 抗原肽 TCR CD3)和第二信号刺激系统。而CD137和CD137配体是新近发现的除CD2 8 B7之外的另一对关键的第二刺激信号 ,并引起人们的注意〔1,2〕。本研究用流式细胞仪检测健康人外周血单个核细胞经rIL 2、IFN γ和胸腺肽刺激后T细胞及其亚群共刺激信号分子CD137表达的特点 ,以比较、了解三者对共刺激信号分子CD137表达的影响。材料和方法主要试剂 :基因重组人IL 2 (rIL 2 ) ,军事医学科学院基础医学研究所、北京瑞得四环生物技术研究所联合研制产…     

协同刺激分子CD28在结核杆菌抗原体外激活人外周血γδT细胞中的作用

目的 :为了探讨CD2 8协同刺激分子在结核杆菌 (Mtb)低分子多肽抗原体外激活人外周血γδ T细胞中的作用。方法 :采用激发型抗CD2 8单抗模拟第二信号 ,Mtb低分子多肽抗原作为刺激原 ,对纯化的人外周血T细胞进行体外刺激和培养 ;用流式细胞仪检测γδ T细胞上CD2 8分子的表达、γδ T细胞的增殖效应及活化的γδ T细胞上CD6 9分子的表达。结果 :人外周血γδ T细胞中有 5 0 %左右表达CD2 8分子 ;抗CD2 8单抗协同Mtb抗原可刺激γδ T细胞的活化和增殖 ;但抗CD2 8单抗或Mtb抗原单独刺激则无作用。活化的γδ T细胞表面表达CD6 9分子。结论 :Mtb抗原在选择性活化人外周血γδ T细胞时需要第二信号的参与 ;CD2 8在Mtb抗原激活γδ T细胞时可提供协同刺激信号 ;CD6 9可作为γδ T细胞的早期活化标志。     

B7-H1协同刺激淋巴细胞增殖并诱导产生抑制性T细胞

目的：探讨B7-H1分子在抗原诱导的免疫反应中的作用。方法：在可溶性抗原PPD诱导淋巴细胞增殖体系中,加入中和抗体检测B7-H1的协同刺激作用。转染表达B7-H1的ECV304细胞,观测其对PPD诱导的淋巴细胞增殖、细胞因子分泌及淋巴细胞亚群比例的影响。将刺激后的淋巴细胞过继至自体或同种异体增殖体系中,检测其功能。结果：抗B7-H1中和抗体可降低PPD诱导的淋巴细胞增殖反应和细胞因子分泌;转染B7-H1的ECV304细胞可协同刺激抗原诱导的淋巴细胞增殖,促进细胞因子IL-10的表达,并改变T细胞亚群分布,增加CD4^＋T细胞亚群比例;自体或同种异体过继实验显示,B7-H1刺激后的淋巴细胞具有显著的免疫抑制功能。结论：B7-H1分子可协同刺激淋巴细胞增殖并诱导产生具有免疫抑制功能的T细胞亚群。     

抗CD28单抗对T细胞体外抗瘤作用的影响

采用健康人外周血T淋巴细胞分别与BEL 740 2人肝癌细胞和抗CD2 8混合培养 ,检测淋巴细胞活化增殖能力、CTL细胞的杀伤活性、培养上清IFN γ和TNF α的水平。结果发现 ,在BEL 740 2刺激细胞存在时 ,抗CD2 8促进增殖的最佳浓度为 6 μg/ml,而单一抗CD2 8不能刺激T细胞增殖。BEL 740 2细胞和抗CD2 8共刺激后IFN γ和TNF α分泌均比单纯BEL 740 2高 ,同时其诱生的CTL细胞杀伤BEL 740 2的能力也强于对照组 ,其差异均具有显著性 (P <0 0 1)。上述结果提示 ,抗CD2 8单抗共刺激诱导CD4+ 和CD8+ T细胞参与抗肿瘤免疫 ,使IFN γ、TNF α的分泌增多 ,增强了体外T细胞抗瘤作用。     

ICOS共刺激途径中MAPK家族信号分子对活动期SLE患者T细胞增殖及细胞因子分泌的作用

目的研究可诱导共刺激分子（ICOS）共刺激途径中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族信号分子对活动期系统性红斑狼疮（SLE）患者T细胞增殖及细胞因子分泌的作用。方法体外分离纯化活动期SLE患者和正常人外周总T细胞、CD4^＋和CD8^＋T细胞，予以抗CD3／抗ICOS刺激，通过Western blot检测信号分子的活化水平，ELISA检测培养上清细胞因子表达，^3H—TdR法测定细胞的增殖水平。结果活动期SLE病人CD4^＋或CD8^＋T细胞经ICOS共刺激后，胞外信号调节激酶（ERK）的活化水平明显低于正常人，CD4^＋或总T细胞分泌IL-2明显低于正常人，PD98059抑制ERK活化可致细胞增殖水平下降与IL-2分泌减少，SB-203580抑制p38MAPK活化可致IL-10分泌减少，细胞因子IL-2能明显促进T细胞的增殖水平。结论活动期SLE患者ICOS共刺激T细胞增殖功能降低与其ERK信号活化障碍所致的IL-2分泌减少密切相关，MAPK家族信号分子在ICOS共刺激不同T细胞亚群增殖与细胞因子分泌中具有不同的作用。     

流式细胞术检测淋巴细胞增殖方法的建立

目的 :建立一种用流式细胞仪同时测定T淋巴细胞增殖与细胞因子分泌的方法。方法 :用非特异性刺激剂PMA、PHA刺激 1 0例正常人外周血单个核细胞 ,体外培养 2、4、6、8、1 0h ,流式细胞术在单细胞水平检测T淋巴细胞的功能性激活、表面活化标志性抗原 (CD69)的表达、DNA合成 (BrdU掺入法 )及胞内细胞因子 (IL 4、IFN γ)分泌。选择合适的刺激剂、调整细胞浓度、优化实验方法 ,确定最佳实验条件。结果 :BrdU掺入法测定T淋巴细胞增殖 ,最佳的反应细胞浓度为 1× 1 0 6ml-1 ,比较不同刺激剂和体外培养时间 :PMA(2 0ng ml)刺激后 8hT细胞中CD69+、BrdU+双阳性细胞比例最高 (82 3 %± 7 2 % ) ,IFN γ+、IL 4+细胞百分率分别为 2 5 2 %± 3 7%和 3 4%± 1 6 % ,均显著高于未刺激组 (P <0 0 1 )。结论 :应用流式细胞术进行单个核细胞的增殖分析可以同时检测细胞表面活化抗原的表达、DNA合成及胞内细胞因子的分泌。此方法能够分析不同亚群细胞对于不同刺激原的反应和激活表型。敏感性高、重复性好 ,可在单细胞水平检测单个核细胞的增殖和功能性激活     

乳鼠角朊细胞分离表达共刺激分子CD80/CD86

以往研究认为角朊细胞不表达共刺激分子CD80／CD86，无法提供淋巴细胞增殖过程中关键的共刺激信号，但培养的角朊细胞膜片移植后，最终供者细胞被完全排斥，具体机理不明。本实验使用近交系小鼠，有和无血清两种体系培养角朊细胞1、4、7d，采用流式细胞技术、激光共聚焦技术，RT-PCR方法检测角朊细胞在培养过程中MHCⅠ类、Ⅱ类抗原，及CD80、CD86的表达。证实培养的细胞中不含郎格罕氏细胞，首次发现乳鼠角朊细胞在培养过程中表达CD80，但不表达CD86，可刺激异基因淋巴细胞增殖，执行抗原递呈细胞功能。本研究结果为角朊细胞膜片移植排斥提出另一种可能的解释：MHCⅠ／Ⅱ类分子和CD80的表达，使培养的异体角朊细胞兼具外来抗原和抗原递呈细胞的功能，刺激受体淋巴细胞增殖，参与排斥反应。     

两种HLA-B分子对外周血单个核细胞分泌细胞因子的影响

为了解HLA B2 7和B39分子对外周血单个核细胞 (PBMC )分泌IFN γ和TNF α的影响。我们将外源HLA B 2 70 4和B 390 5 2基因分别表达在HLAI类分子缺陷的K5 6 2细胞表面 ,与PBMC作用 12h后 ,用ELISA法检测IFN γ和TNF α的含量。结果显示 :HLA B2 7分子能显著抑制PBMC分泌IFN γ ,而对TNF α分泌的影响不显著 ;而HLA B39表达于K5 6 2细胞后 ,均不能影响IFN γ、TNF α分泌。提示HLA B2 7分子与HLA B39分子影响PBMC分泌细胞因子的能力不同     

可诱导共刺激分子的研究进展

可诱导共刺激分子（Inducible Costimulatory Molecule,ICOS)是新发现的表达于活化T细胞的共刺激分子，属CD28－CTLA－4家族。ICOS的小鼠配体B7RP－1和人类配体B7－H2具有不同的表达形式和条件。人类ICOS通路可被抗原－TCR信号和L-2激活。人刺激通路诱导T细胞分化，增殖并分泌IL－4，IL－10，IFN－γ和TNF－γ等细胞因子，对B细胞和CTL细胞免疫应答也有一定的影响。阻断ICOS通路会引起T细胞凋亡。ICOS与CD28通路无功能交叉性，在免疫应答过程中具有重要而且独特的应用。     

B7-H3单抗交联作用对Mo-DC体外生物学功能的影响

探讨B7-H3分子对人外周血单核细胞来源树突状细胞(Mo-DC)体外成熟和生物学功能的影响。采用常规方法从健康人外周血单核细胞诱导DC,在诱导过程中,加入B7-H3单抗21D4共培养,经流式细胞术检测Mo-DC上B7-H3分子和其他共刺激分子的表达,ELISA试剂盒检测培养上清中细胞因子IL-10和IFN-γ的分泌量,并采用3H-TdR掺入法测定T细胞的增殖。结果:B7-H3分子在未成熟和成熟Mo-DC上均有高水平表达,抗人B7-H3单抗21D4能上调Mo-DC表面CD80、CD86和CD83的表达,提高Mo-DC的共刺激能力,促进T细胞的体外增殖,并能显著促进T细胞分泌IL-10。由此表明,B7-H3单抗21D4交联作用可以促进Mo-DC体外成熟,上调其共刺激T细胞的能力。     

TLR3激动剂对B细胞功能的影响

目的观察TLR3激动剂Poly I:C对B细胞功能的影响,包括细胞增殖、共刺激分子表达、细胞因子和抗体的分泌情况。方法利用免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD19+B细胞,RT-PCR法证实其表达TLR3。体外用Poly I:C刺激B细胞一定时间后,CFSE分裂法检测B细胞增殖,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测B细胞表面共刺激分子表达,CBA(cytometric bead ar-ray)法或ELISA法检测培养上清中细胞因子含量,CBA法检测B细胞分泌Ig的亚型。结果 Poly I:C可以促进B细胞增殖,上调B细胞表面CD40、CD80、CD86和MHC II类分子的表达,促进IL-6和TNF-α的高分泌,诱导IgG1κ抗体的产生。结论 Poly I:C可以通过促进增殖、细胞因子分泌,诱导抗体产生和上调共刺激分子表达等多方面调节B细胞功能。     

CD28单抗对CD3AK细胞增殖及表型的影响

CD3AK细胞是用小剂量CD3单抗交联CD3分子而活化的T细胞 ,它具有较强的细胞增殖和细胞毒效能。CD2 8分子则是T细胞激活过程中所需的协同刺激分子 ,可提供T细胞活化所需的第二信号。本文利用CD2 8单抗作为CD2 8分子的配体 ,观察了CD2 8信号途径的激活对CD3AK细胞的影响。结果显示CD2 8单抗可增强CD3AK细胞的增殖活性和趋化团聚形成集落的能力 ,并优先引起CD4+T细胞的增殖。     

共刺激分子4-1BBL和B7-1对人T淋巴细胞的协同激发作用

目的 :探讨 4 1BBL和B7 1这 2种共刺激分子在人外周血T淋巴细胞活化、增殖中的作用和机制。方法 :采用免疫磁珠阴性选择方法分离纯化人外周血T淋巴细胞 ;单向混合淋巴细胞反应 (MLR)分析共刺激分子对T细胞的激发作用 ;3H TdR掺入法测定细胞增殖 ;免疫荧光标记和流式细胞仪表型分析 ;ELISA检测细胞因子。结果 :经免疫磁珠阴性选择分离获外周血单个核细胞中的T细胞纯度 >90 %;人多发性骨髓瘤细胞株 (XG细胞 )转染 4 1BBL和B7 1cDNA后 ,细胞膜表面能稳定高表达这 2个分子 ,4 1BBL和B7 1转基因细胞也均能使同种异体T细胞发生活化、增殖、存活时间延长和介导细胞因子IL 2的分泌 ,且 2种共刺激分子具有一定的协同效应。结论 :4 1BBL和B7 1分子具有赋予XG细胞对T细胞的体外激发、促增殖和分泌IL 2的作用 ,4 1BBL和B7 1分子能产生协同效应。     

B7H1-Ig诱导Tr1细胞向CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞转化的研究

为探讨Ⅰ型调节性T细胞(Tr1)与CD4+CD25+Foxp3+Treg之间的转化和相互关系,以预包被而固相化的B7H1-Ig融合蛋白加抗CD3单抗刺激初始CD4+CD62L+T细胞,分析细胞因子及Foxp3表达水平的变化,检测细胞功能;在B7H1-Ig开始刺激时或诱导细胞分化结束后加入重组人TGF-β,观察其对细胞分化的影响。结果显示,B7H1-Ig激活的CD4+T细胞产生高水平IL-10、IFN-γ和IL-5,极低水平的IL-2和IL-4,不表达Foxp3,通过分泌抑制性细胞因子IL-10发挥免疫抑制功能,证实B7H1-Ig可诱导Tr1细胞的产生。同时发现TGF-β不影响B7H1-Ig刺激的初始CD4+T的分化,却可促进B7H1-Ig诱导的已分化Tr1细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg转化,提示在特定条件下,Tr1细胞可转化的CD4+CD25+Foxp3+Treg。研究结果为将来临床应用CD4+Treg治疗免疫失调性疾病奠定了基础。     

人CD137单抗诱导不同状态T细胞增殖和凋亡的研究

为了研究一种新的T细胞共刺激分子—CD137对不同状态T细胞增殖和凋亡的双重调节作用。采用3 H TdR掺入法测定T细胞增殖 ,用流式细胞仪测定细胞凋亡。结果显示 :(1)CD137单抗可与T细胞表面的CD137抗原结合 ,明显增强PHA刺激T细胞增殖 ,使T细胞增殖指数较PHA单独作用高 2～ 3倍 ,但CD137单抗单独不能刺激T细胞增殖 ;(2 )对于慢性活化的T细胞 ,CD137单抗可协同PHA诱导T细胞凋亡 ,使T细胞凋亡率从PHA单独作用的 19 2 0 %增加到 36 31% ,CD137单抗单独并不能诱导慢性活化T细胞凋亡。CD137单抗一方面可协同PHA刺激静止状态T细胞的增殖 ,另一方面可协同PHA诱导慢性活化T细胞凋亡 ,对T细胞起双重调节作用。     

阻断CD28-CD86共刺激途径抑制小鼠气道炎症的研究

TH2淋巴细胞及其分泌的细胞因子在哮喘发病过程中起关键作用。T细胞激活需要由APC表面的共刺激分子与T细胞表面的共刺激分子受体结合形成的共刺激信号。已经公认T淋巴细胞表面的CD28／CTLA4与APC表面的B7-1(CDS0)、B7-2(CD86)是产生共刺激信号的主要分子。本实验旨在探讨抗CD86单克隆抗体对小鼠哮喘模型气道炎症的影响。     

转染MHCII类基因对卵巢癌细胞株免疫特性的影响

建立稳定表达CIITA基因的人卵巢癌细胞株HO CIITA ,分析转染CIITA基因对T细胞体外抗肿瘤免疫应答的影响。以CIITA基因逆转录病毒 (pLXSN/CIITA )转染并筛选获得HO CIITA。用FACS和RT PCR分析HLA以及抗原加工递呈基因表达水平。以磁珠法分离得到正常人外周血CD4 +/CD8+T细胞 ,分别进行混合淋巴细胞反应及细胞因子测定 (ELISA和RT PCR )。结果显示 ,转染CIITA基因后 ,使HO细胞HLAII类分子和LMP7基因表达增高 ,而Ii基因表达由阳性转为阴性 ,未检测到TAP1表达 ;HO和HO CIITA细胞刺激CD4 +T细胞分泌IL 4含量两者有显著差异。刺激 4 8h后达到顶峰 ,前者分泌量约为后者的 1/2 ,但分泌IFN γ无差异 ,RT PCR与ELISA两种测定结果一致。表明转染CIITA基因可增加肿瘤细胞表面MHCII类分子的表达 ,该作用与IFN γ具有协同效应 ;并能诱导CD4 +T细胞表达IL 4。