人KIM-1基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

目的制备用于人KIM-1基因mRNA实时荧光定量PCR检测的标准品质粒。方法通过PCR扩增出目的片断,纯化PCR产物与p MD18-T载体连接,转化宿主菌E.coli DH5α,获得阳性克隆;通过PCR扩增鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确。提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立KIM-1质粒标准品。结果 KIM-1基因目的片段成功重组至p MD18-T载体上,扩增目的片段长度为131 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库KIM-1序列性一致。结论成功构建KIM-1基因实时荧光定量PCR标准品质粒。     

铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株的构建

目的 构建铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。方法 分别以质粒pUCGM和铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板PCR扩增庆大霉素抗性基因(GM)和铜绿假单胞菌clpP基因及其3'、5'侧翼序列,将clpP基因及其3'、5'侧翼序列克隆至pMD19T载体, EcoRV切除clpP基因37 bp~453 bp片段后,引入庆大霉素抗性基因,构建重组质粒pCKR2;EcoRⅠ/HindⅢ双酶切重组质粒pCKR2,回收FclpP-GM-clpPR片段,与自杀质粒pEX18Tc连接,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pCKR3;将pCKR3质粒转化大肠埃希菌SM10,与铜绿假单胞菌PAO1双亲杂交,庆大霉素筛选得到铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。结果 经酶切鉴定同源重组载体pCKR3构建正确;PCR和DNA测序鉴定铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株构建成功。结论 本研究成功敲除了铜绿假单胞菌clpP基因,为进一步研究clpP基因的生物学功能奠定了基础。     

铜绿假单胞菌外毒素A全长基因的扩增与克隆

目的　从绿脓杆菌中提取染色体DNA ,PCR扩增及克隆外毒素A全长基因 ,为实现外毒素A的高效表达奠定基础。方法　从绿脓杆菌培养物中提取染色体DNA ,PCR扩增外毒素A全长基因 ,A -T克隆入本室自行构建的pSK -T载体中 ,对重组质粒进行酶切与测序鉴定。结果与结论　成功地从高GC含量的绿脓杆菌染色体DNA中扩增到长片段的外毒素A全基因并进行了克隆与鉴定。     

铜绿假单胞菌的基因诊断

目的 早期诊断铜绿假单胞菌感染。方法 采用聚合酶链反应（PCR）检测铜绿假单胞菌OprⅠ基因片段,用HaeⅢ和PvuⅡ酶切鉴定,测序分析。结果 培养阳性的96份标本均扩增到249bp片段,培养为其他菌及阴性的127份均未发现预期扩增片段,经HaeⅢ和PvuⅡ酶切分别得到49bp和112bp小片段,测序分析其序列与基因库序列比较同源性达100%。结论 检测铜绿假单胞菌OprⅠ基因片段,可作为铜绿假单胞菌感染的早期诊断。     

铜绿假单胞菌肺炎的最新进展

铜绿假单胞菌属于条件致病菌,可引起社区获得性肺炎、医院获得性肺炎(特别是呼吸机相关性肺炎)及囊性纤维化患者中的下呼吸道感染,具有较高的死亡率。本文将对铜绿假单胞菌肺炎主要类型、发病机理、微生物学诊断、抗生素治疗及预防的最新进展进行综述。     

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF的构建及其表达

目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株总RNA为模板,自行设计引物,采用RT-PCR方法扩增OprF抗原编码基因,经酶切、连接后定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 RT-PCR扩增出1 016 bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切和测序鉴定证实OprF基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析表达产物分子质量单位约为61 ku,与预期结果一致,表达的蛋白质占菌体总蛋白的16%;Western blot鉴定重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别。结论成功构建了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,该质粒在E.coliBL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

人类疱疹病毒8型实时荧光定量PCR外标准品的构建

目的构建人类疱疹病毒8型(HHV-8)基因质粒标准品,以便快速、灵敏、可靠地检测与HHV-8相关疾病患者的病毒载量。方法提取HHV-8基因组DNA,以HHV-8 ORF26为目的基因设计引物,进行PCR扩增;纯化目的片段与pMD19-T Vector连接并转化到大肠杆菌中;提取重组质粒DNA,并行PCR、测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)构建标准曲线。结果 HHV-8ORF26目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性和序列完整性,标准曲线参数良好,外标准品阈值循环数(Ct)与其相应梯度稀释浓度呈良好的线性关系,扩增效率高。结论成功构建了HHV-8的Real-time FQ-PCR外标准品,可以快速检测样品中的HHV-8载量。     

重组铜绿假单胞菌外毒素A在大肠杆菌中的表达

目的实现铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因的原核载体构建及融合性表达。方法用基因重组技术构建PET-32a-PEA重组体,并在大肠杆菌BL21中进行表达。结果酶切鉴定及测序结果表明PET32a载体上成功地插入了PEA全基因。用IPTG诱导目的基因表达,沸水浴变性后进行SDS-PAGE电泳,在分子量78kD处有一条明显的新生蛋白带。表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的35%。结论成功地对PEA全基因进行了原核载体构建及表达,获得了稳定表达的工程菌,为进一步研出有效的基因工程疫苗和用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。     

分子信标实时荧光定量PCR构绵羊PrP基因质粒和标准曲线

目的为能够用实时荧光定量PCR研究消化系统PrPmRNA的表达水平,构建目的基因PrP的标准品质粒和标准曲线。方法根据GenBank中绵羊基因编码区保守序列,设计特异性引物和分子信标探针;提取总RNA,经反转录、RT—PCR后,提取质粒,PCR-SSCP及测序鉴定,获得ARQ质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果结果显示,本实验设计的分子信标具有特异性强、灵敏度高和结果准确的特性;标准曲线相关系数r。=0．999,表明线性关系好,成功构建了目的基因的标准品质粒和标准曲线。     

采用Red重组系统敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因

目的敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,获得无弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌菌株。方法采用PCR从pKD46质粒上扩增λ噬菌体的Red重组酶基因,并将其克隆到大肠杆菌和铜绿假单胞菌穿梭质粒pUCP多克隆位点上,电击转化铜绿假单胞菌PAO1感受态细胞,构建PAO1/pUCP-Red基因敲除体系。常规基因操作构建两端与弹性蛋白酶基因上、下游同源,中间为庆大霉素抗性基因的线性打靶片段;并将其电击转化pUCP-Red/PAO1感受态;采用庆大霉素和羧苄青霉素抗性平板初步筛选阳性重组菌;通过PCR、RT-PCR及弹性蛋白酶活性检测方法,鉴定菌株弹性蛋白酶基因的敲除情况。结果本研究通过构建Red重组系统,获得了无弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌菌株。结论本研究成功敲除了铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,所获无弹性蛋白酶活性的菌株将为系统深入研究弹性蛋白酶在铜绿假单胞菌致病性中的详细作用机理提供材料和基础。     

荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR)方法。方法依据gltA基因序列设计嗜吞噬细胞无形体特异引物和探针,以克隆的嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900HT)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌DNA样本,检出结果几乎为0;对荧光定量PCR检测重复性进行分析,变异系数(CV)批内和批间误差在0~2.1%之间,证明该荧光定量PCR具有种特异性和良好的重复性。用荧光定量PCR检测体疑染嗜吞噬细胞无形体的10份蜱和30份小鼠脾脏标本,结果与套式PCR检测结果有密切相关性,但是定量PCR检测敏感性和准确率均高于套式PCR。结论本研究建立的检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合检出样本中微量嗜吞噬细胞无形体。     

两种实时荧光定量聚合酶链反应检测血清HCV RNA的比较

目的 比较全自动病毒载量检测系统(COBAS TaqMan)和国产荧光定量PCR试剂盒对血清HCV RNA载量的检测结果,探讨两种检测方法在临床诊断和治疗中的应用价值.方法 收集26例慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗前和治疗过程中2、4、8、12、24、36和48周的系列血标本,共168份,采用COBAS TaqMan 48全自动分析系统和广州某国产TaqMan实时PCR试剂盒分别检测系列血清中的HCV RNA载量.统计学处理采用x2检验和t检验.结果 当血清HCV RNA≥1×104IU/mL时(0周),COBAS检测和国产试剂盒均能很好测定HCV载量,而且国产试剂盒检测值为1.35×107IU/mL高于COBAS检测值2.21×106IU/mL,差异有统计学意义(t=2.05,P<0.05);血清HCV RNA<1×104IU/mL时(2～48周),COBAS检测出的HCV阳性率为21.4%(30/140),远高于国产试剂盒的1.4%(2/140),差异有统计学意义(t=3.66,P<0.01);治疗4周时,COBAS检测26例患者中14例血清HCV为阳性,12例病毒载量低于检测下限,获得快速病毒学应答(RVR);国产试剂盒检测结果为3例血清HCV为阳性,23例获得RVR.COBAS与国产试剂盒梧比,转阴率差异有统计学意义(x2=10.575,P<0.01).治疗12周时,COBAS检测完全早期病毒学应答(cEVR)率为95.7%(22/23),国产试剂盒检测的cEVR为100%(17/17),差异无统计学意义(x2=0.726,P>0.05).结论 国产荧光定量PCR试剂盒可用于HCV疑似患者的筛查和高HCVRNA载量者的确诊,对于低HCV RNA载量的疑似患者和抗病毒治疗过程中HCV载量的检测,COBAS则更为敏感.

Abstract：

Objective To compare the plasma hepatitis C virus(HCV)RNA levels detected by the fully automated viral load detection system(COBAS TaqMan)and the national real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR)kit,and to investigate the clinical application value of these two methods in clinical practice.Methods A total of 168 serial plasma samples collected from 26 patients with chronic hepatitis C(CHC)before and at week 2,4,12,24,36 and 48 of antiviral treatment were detected by both COBAS Taqman 48 analyzing system and the national real-time quantitative PCR kit.The results of two methods were compared by chi square test and t test.Resnlts Both COBAS and national kit showed great positive detecting results when HCV RNA≥1×104IU/mL(at week O),and the virus load value detected by national kit was significantly higher than that detected by COBAS(t=2.05,P<0.05).However,when HCV RNA<1×104(at week 2-48),the positive rate of HCV detected by COBAS was significantly higher than that detected by national kit (t=3.66,P<0.01).At week 4 of treatment,the rapid virological response(RVR)rate was 46.2 % (12/26)detected by COBAS,while that was 88.5%(23/26)detected by national kit,and the difference was significant(x2=10.575,P<0.01).At week 12 of treatment,the complete early virological response(cEVR)was 95.7%(22/23)detected by COBAS,while that was 100%(17/17)detected by national kit,and the difference was not significant(x2=0.726,P>0.05).Conclusions The national TaqMan real-time quantitative PCR kits could be used to screen the suspected cases of HCV infecrion and to diagnose CHC cases with high HCV virus load.COBAS detection is more sensitive in cases with low HCV virus load and in on-treatment monitor during anti-HCV therapy.     

鼠尿液中弓形虫B1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中弓形虫B1基因序列,设计1对引物和1条TaqMan探针。从感染弓形虫小鼠尿液提取弓形虫总DNA,先用普通PCR扩增获得目的基因产物,将纯化的回收产物与pMD18-T载体连接,测序证实为目的片段后,制备系列浓度参照品。再优化实时荧光定量PCR反应体系,并对体系的灵敏度、重复性、线性、特异性和参照品稳定性进行评价。其灵敏度为104拷贝/ml;批内变异系数为2.42%,批间变异系数为4.18%,线性为103～107拷贝/ml,特异性为100%,参照品稳定。该法检测鼠尿样弓形虫DNA具有方便、灵敏、特异和重复性好等优点。     

人G1型轮状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立与应用

目的本研究旨在建立一种快速准确定量检测人G1型轮状病毒的TaqMan探针荧光实时PCR检测方法。方法以轮状病毒VP6基因为靶基因,分别设计2对引物及其相应的TaqMan探针,扩增目的片段,将目的片段克隆于PCDNA3.1+载体上,体外转录获得RNA,系列稀释后为标准品,建立TaqMan探针荧光定量实时PCR检测方法并对该方法进行验证。结果　设计实验找到最优条件下的引物浓度(250 nmol/L)、探针浓度(300 nmol/L);通过对引起腹泻的人柯萨奇病毒、呼肠孤病毒等进行检测,结果均为阴性,表明该方法具有很好的特异性。该方法的最低检测量为5 copies/μL。对该方法进行重复性实验,发现变异率均小于1%,重复性好。用已建立的方法对4份粪便临床样品进行3次重复试验,病毒RNA的检出率为100%。结论本实验初步建立了人G1型轮状病毒TaqMan探针荧光实时PCR检测方法,为G1型轮状病毒的诊断、检测和分子流行病学研究提供了一种新的方法。     

荧光实时定量PCR定量水体中日本血吸虫尾蚴方法的建立

摘要：目的 建立快速、高效、特异的定量水体中尾蚴的数量和检测水体中日本血吸虫尾蚴残余基因组DNA的方法,来评估水体受日本血吸虫尾蚴污染的程度。方法 根据日本血吸虫基因组DNA中的三个多拷贝序列Sjrh1.0（序列号：U92488.1）、18S小亚基单位核糖体核酸基因(18SrRNA)序列（序列号：AY157226.1）和逆转录转座子SjR2的G55A序列（G55A）（序列号：AF412221.1）,设计常规PCR引物和荧光PCR引物,比较选取较好的靶序列建立SYBR GreenI 实时定量PCR方法,绘制尾蚴数的对数与Ct值的标准曲线,并对疫水中日本血吸虫尾蚴残余的基因组DNA进行检测。结果 尾蚴数的对数与Ct值的标准曲线有良好的线性关系,相关系数r2为0.9186,和重复实验的变异系数小于3%。结论 本方法特异性高,灵敏,可定量水体中尾蚴数,重复性好,对疫水检测有一定的预警作用。     

应用竞争性荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的:建立竞争性荧光定量聚合酶链反应(CFQ-PCR),并探讨CFQ-PCR在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义.方法:根据HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,和一条特异的TaqMan探针;根据上述引物序列,采用分子克隆技术制备内对照DNA;再根据内对照序列合成一条内对照DNA特异的与上述TaqMan探针不同标记的TaqMan探针;将适量的内对照DNA加入到PCR反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增.结果:在30μL CFQ-PCR反应体系中,加入约20拷贝内对照DNA能够稳定地获得共扩增曲线;经琼脂糖凝胶电泳分析,加入约100-500拷贝内对照DNA能够有效地获得共扩增产物条带信号;在210个临床HBsAg阳性血清标本的CFQ-PCR扩增中识别出8个未能有效扩增的标本,60份HBsAg阴性血清标本中识别出2个内对照未能有效扩增的标本,后经DNA纯化处理,上述全部标本的内对照均获得阳性扩增结果,其中有7个HBsAg阳性血清标本获得HBV DNA扩增阳性结果.结论:CFQ-PCR能够有效地提示临床标本HBV DNA体外扩增时由于扩增失败导致的假阴性,适合临床推广应用.