血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒。方法:实验于2005-03/2005-10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成。①通过聚合酶链反应对pcDNA3.1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点,将其分别定向连入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子,通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒。②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞,通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA的表达。结果:①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定:将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作XhoI/MluI和XbaI/NotI双酶切,经10g/L琼脂糖凝胶电泳可见1.2kbp的人骨形成蛋白2条带和592bp的血管内皮生长因子165条带,酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实,目的基因插入片段方向正确,DNA序列无突变。②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165mRNA的表达:以转染pIRES空质粒为阴性对照,48h后提取转染细胞的RNA分别用P1,P2和P3,P4作为引物进行反转录-聚合酶链反应。结果表明转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1.2kbp及592bp两条带。证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA。结论:成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒,为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础。     

人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的：构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒。方法：实验于2005-03／2005—10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成。①通过聚合酶链反应对pcDNA3．1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点，将其分别定向连人真核双表达载体pIPES，构建同时表达两个目的基因的双顺反子，通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒。②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞，通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA的表达。结果：①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定：将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作XhoⅠ／MluⅠ和Xba Ⅰ／NotⅠ双酶切，经10g／L琼脂糖凝胶电泳可见1．2kbp的人骨形成蛋白2条带和592bp的血管内皮生长因子165条带，酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实，目的基因插入片段方向正确，DNA序列无突变。②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165mRNA的表达：以转染pIPES空质粒为阴性对照，48h后提取转染细胞的RNA分别用P1，P2和P3，P4作为引物进行反转录一聚合酶链反应。结果表明转染pIPES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1．2kbp及592bp两条带。证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165 mRNA。结论：成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒，为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础。     

人可溶性血管内皮生长因子受体1基因克隆及真核表达载体的构建

背景;血管内皮生长因子在肿痛新生血管的形成中发挥着关键的作用,可溶性血管内皮生长因子受体1能竞争性地抑制血管内皮生长因子诱导新生血管形成的生物学功能.目的:克降人可溶性血管内皮生长因子受体基因1,尝试构建可溶性血管内皮牛长因子受体1基因的真核表达载体.设计、时间及地点:基因表达载体构建实验,于2006-1012007-11在中山大学附属第一医院外科实验室完成.材料:人脐静脉内皮细胞、pMD-18T载体及pcDNA3载体.方法:提取人脐静脉内皮细胞总RNA,使用反转录一聚合酶链反应的方法扩增获得到可溶性血管内皮生长因子受体1基因cDNA,并将其克隆至pMD-18T载体中,经酶切及测序证实.然后应用聚合酶链反应的方法从pMD-18T可溶性血管内皮生长因子受体1重组载体中克隆可溶性血管内皮生长因子受体1基因,再将其定向亚克降至真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1,提取质粒进行双酶切、聚合酶链反应及测序鉴定.主要观察指标:可溶性血管内皮生长因子受体1基因反转录一聚合酶链反应情况及pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1真核重组体的构建与鉴定结果.结果:构建的真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮牛长因子受体1经过双酶切及聚合酶链反应鉴定,证实其中含有目的可溶性血管内皮生长因子受体1基因;测序结果经比对分析,证实与预期设计的编码区cDNA一致.结论:应用反转录-聚合酶链反应方法成功从人脐静脉内皮细胞中克隆出可溶性血管内皮生长凼子受体1基因,成功构建出了可溶性血管内皮生长因子受体1基因真核表达载体.     

携带人血管内皮生长因子165慢病毒表达载体的构建与表达

背景:已有研究证实血管内皮生长因子在正常肝脏肝部分切除后余肝的再生过程中发挥着重要的作用,但关于其对肝硬化肝脏是否也有相同作用国内外鲜有报道。目的:构建携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体,体外转染BLR3A大鼠肝细胞并观察该细胞中人血管内皮生长因子165基因的表达。方法:采用DNA重组技术将人血管内皮生长因子165基因克隆入pLenti6/V5-D-TOPO慢病毒表达载体中,筛选出阳性克隆与慢病毒包装系统ViraPowerTM Packaging Mix共转染293T细胞产生病毒颗粒,通过实时定量-聚合酶链反应法测定病毒滴度;携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体体外转染BLR3A大鼠肝细胞72h后,利用反转录-聚合酶链反应及Western blot法检测细胞中人VEGF165mRNA及蛋白的表达。结果与结论:成功构建了表达人VEGF165基因的慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO-VEGF165,测得病毒滴度为1.18×107VP/mL。重组慢病毒载体转染BLR3A大鼠肝细胞72h后,荧光蛋白表达率超过80%,反转录-聚合酶链反应及Western blot法测得转染组人血管内皮生长因子165mRNA及血管内皮生长因子165蛋白表达阳性。提示构建的携带人血管内皮生长因子165的慢病毒载体可有效转染BLR3A大鼠肝细胞,并促使该细胞表达人血管内皮生长因子165mRNA及蛋白。     

血管内皮生长因子表达载体的构建及在内皮祖细胞中的表达

背景：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有很强的促进血管生成作用，但构建其真核表达质粒是否可转染缸管内皮祖细胞并完整表达还不清楚。目的：构建VEGF表达载体，并观察其在内皮祖细胞中的表达情况。设计、时间及地点：观察性试验，于2007-12／2008-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心实验室完成。材料：质粒PDC315-VEGFl65自备，质粒pIRES2-EGFP由美国国立卫生研究院Stanko Stojilkovic教授惠赠。方法：运用DNA重组技术构建VEGF表达载体pIRES2-EGFP-VEGF，应用脂质体包裹的方法将载体转染猪外周血血管内皮祖细胞。主要观察指标：采用荧光显微镜观察VEGF在内皮祖细胞内的表达，反转录．聚合酶链反应法检测VEGFmRNA表达水平，ELISA检测VEGF165蛋白表达情况。结果：成功构建VEGF真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF。转染重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF后，在内皮祖细胞内有VEGF的表达，VEGFmRNA和VEGF165蛋白表达水平均明显增加。结论：VEGF表达载体转染猪外周血血管内皮祖细胞后能有效增加VEGF基因的表达，能够获得较高水平的VEGF蛋白。     

难愈性创面修复局部人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建与评价

目的:克隆人血管内皮生长因子165cDNA并构建其真核表达载体,为放创复合伤的难愈性创面的促愈修复提供实验基础。方法:实验于2001-09/2003-05在第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。从白血病HL-60细胞提取总RNA,经过反转录-聚合酶链反应扩增编码人血管内皮生长因子165的cDNA序列,将其克隆至pMD18-T载体后进行测序鉴定,然后将该序列插入双顺反子的真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中。观察以下指标①反转录-聚合酶链反应扩增人血管内皮生长因子165cDNA。②阳性重组质粒pMD18-T-hVEGF165的筛选。③DNA测序鉴定。④阳性重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF165的筛选。结果:反转录-聚合酶链反应扩增得到约600bp的目的DNA片段,酶切pMD18-T-hVEGF165得一与目的片段大小一致的条带,且测序分析其与GeneBank中报道的编码人血管内皮生长因子165cDNA序列完全一致。pIRES2-EGFP-hVEGF165的酶切电泳显示目的条带成功插入真核表达载体pIRES2-EGFP中。结论:成功构建了含有人血管内皮生长因子165cDNA的真核表达载体,如果通过转基因技术可提高血管内皮生长因子165在放创复合伤难愈性创面的局部的表达,有望为修复难愈创面开辟一条新的途径。     

难愈性创面修复局部人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建与评价

目的：克隆人血管内皮生长因子165cDNA并构建其真核表达载体，为放创复合伤的难愈性创面的促愈修复提供实验基础。方法：实验于2001-09／2003-05在第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。从白血病HL-60细胞提取总RNA，经过反转录-聚合酶链反应扩增编码人血管内皮生长因子165的cDNA序列，将其克隆至pMD18-T载体后进行测序鉴定，然后将该序列插入双顺反子的真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中。观察以下指标①反转录-聚合酶链反应扩增人血管内皮生长因子165 cDNA。②阳性重组质粒pMD18-T-hVEGF165的筛选。③DNA测序鉴定。④阳性重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF165的筛选。结果：反转录-聚合酶链反应扩增得到约600bp的目的DNA片段，酶切pMD18-T-hVEGF-65得一与目的片段大小一致的条带，且测序分析其与GeneBank中报道的编码人血管内皮生长因子165cDNA序列完全一致。pIRES2-EGFP-hVEGF165的酶切电泳显示目的条带成功插入真核表达载体pIRES2-EGFP中。结论：成功构建了含有人血管内皮生长因子165cDNA的真核表达载体，如果通过转基因技术可提高血管内皮生长因子165在放创复合伤难愈性创面的局部的表达，有望为修复难愈创面开辟一条新的途径。     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性

目的:应用内部核糖体进入位点构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体,研究外源性基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞ECV304中的转染表达,探讨内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性。方法:实验于2003-12/2004-12在南京鼓楼医院科研部完成。将Phcmvsp1a-enos中内皮型一氧化氮合酶基因和PcDNA-vegf中血管内皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体PcDNA-ires中,构建重组质粒PcDNA-enos-ires-vegf,经酶切,聚合酶链反应扩增和部分DNA测序分析证实后,转染人脐静脉内皮细胞,硝酸还原酶法检测转染后细胞中一氧化氮和一氧化氮合酶活性,免疫组化和荧光双标记及westernblotting检测转染后细胞蛋白水平的表达,Trizol提取总RNA,反转录-聚合酶链反应测定转染后细胞mRNA水平的表达。结果:成功构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf,双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中获得整合及表达。重组基因PcDNA-enos-ires-vegf组与对照组PcDNA-enos在一氧化氮含量和一氧化氮合成酶活性的表达差异无显著性意义。PcDNA-enos-ires-vegf转染细胞后转染效率为30%～40%。结论:双基因表达载体PcD     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的：观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导人正常真皮成纤维细胞后，能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子，为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。 方法：实验于2001—06／2005—06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3．0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3．0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3．0-hVEGF165质粒大量制备（碱裂解法）-质粒纯化-质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EeoRⅠ和xbaⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只，无菌条件下取新生兔皮肤，尽量去除皮下组织，切成宽0．3cm小条块，Ⅰ型胶原酶消化，进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞，经G418筛选，获得阳性转染细胞克隆，并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平；原位杂交显示转基因细胞内VEGF165 mRNA的表达情况；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况；透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。 结果：①质粒酶切鉴定结果：提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5．4kb和0．57kb两个片段，与原质粒图谱符合，表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3．0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况：共进行15次转染试验，35孔（皿）均有G418抗性集落形成，表明pcDNA3．0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达：pcDNA3．0-hVEGF165转染成纤维细胞后，24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋、白表达，高达（3280&;#177;2054）ng／L，并于48，72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果：转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGF mRNA。G418应用2-4周后，可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆，筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEG FmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测：转染后成纤维细胞S期细胞比例增加，G1和G2期细胞减少，表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高。转染前为1．26％，转染后2d为2．64％，至12代时高达17135％。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察：细胞表面有较多微绒毛，核呈不规则形，胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体，沿膜可见一些膜包被颗粒。 结论：真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165成功导人家兔皮肤成纤维细胞，在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子，在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

pcDNA3．1-VEGF165质粒转染骨髓基质干细胞后血管内皮生长因子的表达

目的:检测pcDNA3.1-VEGF165载体转染对兔骨髓基质干细胞血管内皮生长因子表达的影响。方法:实验于2005-07/2006-01在山东省青岛市市立医院中心试验室完成。①pcDNA3.1-VEGF165质粒由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科杨述华教授惠赠。②选取1月龄新西兰大白兔1只,无菌条件下取胫骨和股骨,进行骨髓基质干细胞的分离与培养。③转染前24h计数细胞,每孔5×105细胞接种于6孔板,待骨髓基质干细胞达到80%～90%融合时准备转染,设立未转染组、空载体组和载体组。未转染组无特殊处理,空载体组转染pcDNA3.1载体,载体组转染pcDNA3.1-VEGF165。④转染后72h,反转录聚合酶链反应检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165mRNA的表达;酶联免疫吸附法检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165蛋白的含量。结果:①骨髓基质细胞分离培养形态观察:初始分离的骨髓细胞呈圆形,大小不一;24h后有少量细胞贴壁;48h后贴壁细胞部分为成纤维样细胞;72h贴壁的成纤维样细胞数不断增加;96h后贴壁生长的细胞主要为梭形的成纤维样细胞;分瓶后细胞形成克隆;传代后细胞贴壁生长,分裂相增多,并不断增殖分化形成均一的梭形细胞。②转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165mRNA的表达情况:反转录聚合酶链反应检测到载体组在576bp处有明显条带,空载体组和未转染组均未见血管内皮生长因子165表达。③转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165蛋白含量检测结果:酶联免疫吸附结果显示,载体组转染pcDNA3.1-VEGF165载体的骨髓基质细胞培养上清液中血管内皮生长因子165蛋白浓度为(170.1±14.3)ng/L,而空载体组与未转染组均未检测到血管内皮生长因子165蛋白表达,差异有显著性意义(t均=42.206,P=0.000)。结论:应用pcDNA3.1-VEGF165载体转染,可使兔骨髓基质干细胞获得外源性血管内皮生长因子165基因和蛋白的表达。     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的:观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导入正常真皮成纤维细胞后,能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子,为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。方法:实验于2001-06/2005-06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3.0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3.0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3.0-hVEGF165质粒大量制备(碱裂解法)→质粒纯化→质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只,无菌条件下取新生兔皮肤,尽量去除皮下组织,切成宽0.3cm小条块,Ⅰ型胶原酶消化,进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞,经G418筛选,获得阳性转染细胞克隆,并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平;原位杂交显示转基因细胞内VEGF165mRNA的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。结果:①质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5.4kb和0.57kb两个片段,与原质粒图谱符合,表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3.0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况:共进行15次转染试验,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达:pcDNA3.0-hVEGF165转染成纤维细胞后,24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋白表达,高达(3280±2054)ng/L,并于48,72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果:转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGFmRNA。G418应用2～4周后,可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆,筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEGFmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测:转染后成纤维细胞S期细胞比例增加,G1和G2期细胞减少,表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高,转染前为1.26%,转染后2d为2.64%,至12代时高达17.35%。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察:细胞表面有较多微绒毛,核呈不规则形,胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体,沿膜可见一些膜包被颗粒。结论:真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165成功导入家兔皮肤成纤维细胞,在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子,在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

反义血管内皮生长因子对乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的　构建表达反义血管内皮生长因子165(VEGF165)的真核表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MCF- 7的影响,探讨反义基因治疗乳腺癌的可行性。方法　应用基因重组技术,将人VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,将此表达载体转染人乳腺癌细胞MCF -7,观察转染前后MCF 7的VEGF165表达及细胞生长周期。结果　成功构建出VEGF165反义RNA真核表达载体,反义质粒转染后MCF -7细胞VEGF165表达下降,G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞增殖能力降低。结论　VEGF165反义RNA能够明显减少人乳腺癌细胞株MCF- 7内VEGF165的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖,证明了反义基因干预治疗的有效性,为乳腺癌的基因治疗进行了有益探索。     

转染血管内皮生长因子165基因的狗骨髓基质细胞超微结构变化及成骨能力

目的:探讨转染血管内皮生长因子165基因的狗骨髓基质细胞体外生物学特性。方法:实验于2002-05/2005-06在华中科技大学同济医学院协和医院骨科完成。实验分为血管内皮生长因子基因转染组与对照组。从3只成人杂交犬髂骨取骨髓进行骨髓基质细胞分离培养,将重组的血管内皮生长因子165基因用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞,用反转录聚合酶链反应方法检测血管内皮生长因子的表达;通过四唑盐、对硝基苯磷酸盐检测细胞增殖与碱性磷酸酶的活性;考马斯亮蓝法检测蛋白质含量;透射电镜观察细胞超微结构。结果:①重组质粒pcDNA3-人血管内皮生长因子165转染骨髓基质细胞后第7,14天,反转录聚合酶链反应方法检测有血管内皮生长因子mRNA表达。②骨髓基质细胞转染基因后,细胞的增殖能力无明显影响。③培养后第6,8,10,12天,转染血管内皮生长因子基因骨髓基质细胞与对照组细胞比较,碱性磷酸酶活性增高,蛋白质合成增多[转染组碱性磷酸酶为(428.09±26.67),(565.11±24.17),(562.94±39.17),(596.45±30.17)nkat,对照组碱性磷酸酶为(363.57±20.67),(536.44±11.42),(537.11±26.83),(548.10±22.34)nkat;转染组细胞蛋白合成为1.41±0.23,1.46±0.24,1.59±0.33,1.74±0.26;对照组细胞蛋白合成为0.82±0.11,0.83±0.09,0.85±0.06,0.91±0.09]。④透射电镜可见转基因细胞内质网增多,线粒体致密,而糖原溶解与脂肪空泡则减少。结论:血管内皮生长因子基因转染可促进骨髓基质细胞的成骨分化。     

以红色及绿色荧光蛋白为标记基因的血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2真核表达载体的构建及其在293-T细胞中的共表达

背景：血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白具有协同促进血管生成的作用。 目的：构建在真核细胞中表达人血管内皮生长因子165的红色荧光蛋白表达载体和携带人骨形态发生蛋白2的绿色荧光蛋白表达载体，共转染真核细胞以研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2日在293-T细胞内的表达和定位。 设计：随机对照实验。 单位：解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室。 材料：实验于2002-09/2004-03在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室完成。pCDNA3.1（＋）/骨形态发生蛋白2由美国UCLA大学Dr.Bostrom惠赠；pDsRed1-N1由Professor Roger Y.Tsien,University of Califormia,San Diego,USA惠赠。pUC18/血管内皮细胞生长因子165，293-T cells由本实验室保存。 方法：根据已知的人血管内皮生长因子165序列，设计在目的片段两端分别携带酶切位点的两条引物，用聚合酶链反应从质粒pUC18/血管内皮生长因子165中扩增出去除终止密码子的人血管内皮生长因子165片段，定向克隆至含报告基因的质粒pDsRed1-N1中，构建重组质粒pDsVEGF165Red1-N1；同时，构建pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白表达载体。以DOTAP为介导，将重组质粒共转染293-T细胞，48h后用激光共聚焦显微镜检测报告基因红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白的表达，使用反转录聚合酶链反应及免疫印迹方法检测血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内表达。 主要观察指标：质粒的酶切鉴定及重组质粒在293-T细胞中mRNA及蛋白水平的表达。 结果：重组质粒经酶切，聚合酶链反应和DNA序列测定证明构建正确，目的基因在293-T细胞中在mRNA及蛋白水平获得表达，激光共聚焦显微镜观察到红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白在细胞中共定位的情况。 结论：成功构建pDsVEGF165Red1-N1和pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白2种含报告基因的真核表达载体，两者共转染后能在真核细胞中表达，为研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内的相互作用提供了一个重要而方便的工具。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

超声介导微泡靶向传输基因促血管新生的实验研究

目的探讨超声介导微泡靶向传输血管内皮生长因子VEGF165促心肌血管新生即心肌“分子搭桥”的新途径。方法利用分子生物学方法构建人血管内皮生长因子真核表达质粒pcDNA3.1-/VEGF165;制备载VEGF165基因脂质体微泡,分析其理化性质和功能,在超声场利用超声辐射向大鼠梗死心肌靶向传输VEGF165;2周后取材,逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)评价大鼠心肌中人源VEGF165mRNA表达,蛋白印迹杂交(WesternBlot)观察大鼠心肌VEGF165的蛋白表达,CD34免疫组化微血管密度(MVD)计数半定量法评价超声介导微泡靶向传输VEGF165促梗死心肌血管新生效果。结果①成功构建、克隆血管内皮生长基因VEGF165重组真核表达质粒pcDNA3.1-/VEGF165,测序分析、酶切鉴定准确无误;②研制的脂质体微泡超微结构显示可粘附或包载DNA,粒度分析显示平均粒径<5μm;③在超声介导下该脂质体载基因微泡可靶向传输VEGF165至大鼠梗死心肌,超声介导靶向传输组VEGF165的mRNA、蛋白表达及促血管新生作用(MVD表示)仅次于VEGF165基因心肌注射组。结论超声介导微泡可向大鼠心肌靶向传输VEGF165基因并产生促血管新生效应。     

重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的表达,对目的蛋白进行鉴定和生物学活性分析。方法分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的基因得到稳定表达,目的蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性。结论应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。     

人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人胶质细胞源性神经营养因子（glialcell line-derived neurotrophic factor,GDNF）和血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165）在细胞分化过程中有重要作用。目的：构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-VEGF165并对其进行鉴定。方法：采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因,然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点（IRES）的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。结果与结论：DNA测序显示,提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带,经Bam HI/Not I双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经Bgl II/Not I双酶切后切出GDNF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。