枸杞多糖对胎儿卵巢组织冷冻保存的影响

背景：抗氧化剂的应用对于提高卵巢组织冻存后的活力起着很重要的作用。目的：通过观察冷冻保存的胎儿卵巢组织异种移植到裸鼠肾被膜下的发育情况,探索枸杞多糖在卵巢组织冷冻保存中的作用。方法：实验分为4组。①新鲜移植组：取材后的新鲜胎儿卵巢组织直接进行移植。②冻存对照组：冷冻保护液为基液。③β-巯基乙醇组：冷冻保护液为基液添加100μmol/Lβ-巯基乙醇。④枸杞多糖组：冷冻保护液为基液添加400mg/L枸杞多糖。对冷冻复温后的胎儿卵巢皮质块进行祼鼠的肾被膜下移植,并于移植后12周取材。结果与结论：各组在移植物的存活率上差异无显著性意义（P〉0.05）。在卵泡计数上冷冻对照组最低（P〈0.05）。在卵泡的存活率上,各组间差异均有显著性意义,其中以冷冻对照组最低,枸杞多糖组最高。β-巯基乙醇组和枸杞多糖组卵巢超微结构较冷冻对照组保存的好。提示400mg/L的枸杞多糖和100μmol/L的β-巯基乙醇有利于卵巢组织的冷冻保存,并可显著提高冷冻卵巢组织移植后的存活率。     

大鼠卵巢组织的冷冻移植

背景:玻璃化冷冻是应用高浓度的冷冻保护液结合极快的制冷速度,使细胞快速冷冻,避免细胞内外冰晶形成对细胞的破坏作用,是一种比较新的冷冻方法,具有操作简单、冷冻效率高等特点.目的:采用玻璃化冷冻技术冷冻大鼠卵巢组织,比较4种冷冻保护剂对大鼠卵巢组织学和功能的影响.方法:将大鼠随机数字表法分为6组,每组6只:二甲基亚砜+乙二醇组、二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖组、二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组、乙二醇+蔗糖+乙酰胺组、去势组、正常对照组.4冷冻组摘除卵巢后应用相应的冷冻保护液冻存,去势组仅摘除卵巢不冻存、不移植,正常对照组不作处理.冻存2周后解冻复苏行同体异位移植,将卵巢组织植入大鼠后肢大腿内侧.移植后30 d,观察阴道上皮类型及动情周期;移植后3个月,经腹主动脉采血检测血清雌二醇水平;回收卵巢组织做组织学检查.结果与结论:4冷冻组均可见卵巢组织结构受损表现,原始卵泡的形态正常率分别为67.9%,71.6%,80.5%,59.4%,初级卵泡形态正常率分别是41.6%,52.3%,55.9%,36.7%.二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组卵泡正常率较二甲基亚砜+乙二醇组、乙二醇+蔗糖+乙酰胺组高(P<0.05);不同发育阶段卵泡构成比差异无显著性意义,均未见典型的次级卵泡.受损的卵细胞主要表现为体积变小、胞浆内出现空泡、核皱缩等.4冷冻组未出现典型动情周期的细胞类型.移植物自周围组织获得可见的血管供应,将卵巢组织块连接形成网络.移植物内毛细血管丰富,皮质中可见成群的原始卵泡,初级卵泡、次级卵泡所占比例低于原始卵泡,形态与正常者相似.4种冷冻方法冻存卵巢组织血清雌二醇水平较正常对照组明显降低(P<0.01),二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组高于其他冷冻组(P<0.05).结果提示4种冷冻方法均对大鼠卵巢组织有一定程度破坏,初级卵泡的损伤大于原始卵泡.冻存复苏后,卵巢功能恢复,但并不完全,二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组效果优于另外3组,但移植后动物没有出现规律的动情周期,提示冷冻方法尚需进一步完善.     

促卵泡刺激素干预改善绵羊卵巢组织玻璃化冻存后异种移植的效果研究

背景:卵巢皮质片移植是无血管吻合移植,因此,提高卵巢组织对冻存-解冻和移植后缺血的耐受力是提高冻存后移植物卵泡存活和延长功能寿命的关键环节.目的:观察促卵泡刺激素在玻璃化冻存过程中对绵羊卵巢组织形态和功能的保存效果,为成人卵巢组织的冻存提供技术方法.方法:BALB/c品系雌性裸鼠随机分为3组.均行羊卵巢皮质片裸鼠异位移植:①新鲜移植对照组,取材后即移植.②玻璃化冻存移植组,采用玻璃化冻存解冻后移植,所用液体均未添加促卵泡刺激素.③添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组,采用冷冻液、解冻液和培养液均添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存后移植.移植后检测受体鼠动情周期恢复率、恢复时间、卵泡数和发育状况,于移植后4周取移植卵巢进行组织学观察、并行血清雌二醇水平分析.结果与结论:含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组与新鲜移植组相比动情周期恢复率、每高倍视野卵泡计数差异均无显著性意义(P>0.05),卵泡计数高于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P<0.05);动情周期恢复需要的天数接近于新鲜移植组,明显短于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P<0.05).移植后4周,含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组组织学观察见卵泡发育,未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组仅偶见原始卵泡.含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组与新鲜移植组相比血清雌二醇水平差异无显著性意义(P>0.05),显著高于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P< 0.05).结果提示,在玻璃化液中加入促卵泡刺激素可提高冻存绵羊卵巢组织移植后卵泡存活率.     

大鼠胚胎卵巢冷冻保存和异体无血管皮下移植的生长

背景:胚胎卵巢组织免疫原性低,不易引起宿主的免疫排斥反应,是卵巢异体移植的理想供体.但由于获取胎儿卵巢的不随意性和来源限制,标本的冷冻显得至关重要,成功的冷冻保存和复苏技术是建立胎儿卵巢库的关键.目的:通过对大鼠新鲜或冻融胚胎卵巢组织异体无血管移植后的组织形态和功能的观察,探讨胚胎卵巢组织异体移植和超速冷冻保存的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验.于2006-03/05在云南省第一人民医院生殖遗传科进行课题设计,于2006-05/2007-02在云南大学单克隆抗体研究中心完成实验.材料:卵巢来源于孕龄为18～20 d SD大鼠胚胎.取阴道脱落细胞涂片证实有正常动情周期未交配过的SD成年雌性大鼠作为移植对象,分4组:正常对照组(n=10)、去势对照组(n=10)、新鲜胚胎卵巢移植组(n=25)、冷冻胚胎卵巢移植组(n=25).方法:正常对照组仅行皮肤筋膜肌肉切开缝合术,去势对照组切除双侧卵巢组织.将孕龄为18～20 d的新鲜或经超速冷冻法冷冻复苏的大鼠胚胎卵巢植入去势后4周的大鼠颈部皮下作为实验组,分别为新鲜移植组和冷冻移植组.主要观察指标:通过阴道脱落细胞的观察和血清雌二醇、孕酮的测定了解大鼠内分泌恢复情况,并对移植卵巢进行组织学观察.结果:新鲜移植组和冷冻移植组分别有52.17%和38.01%大鼠恢复了动情周期,两组血清雌二醇和孕酮在分别在35和49 d恢复到正常,且动情周期天数与正常对照组比较,差异无显著性意义.冷冻移植组大鼠恢复动情周期虽稍短于新鲜移植组,但差异并无统计学意义.63 d后取出移植物观察,见移植物色泽红润,表面有丰富的血管形成,镜下见卵巢内有大量的小动脉和小静脉;移植物组织学检查发现卵泡的发育,光镜下可见不同发育阶段的卵泡,有成熟卵泡和黄体形成,形态与正常卵巢无明显差别.结论:大鼠胚胎卵巢异体异位无血管皮下移植后能存活、生长发育并具有与正常卵巢相似的内分泌功能;超速冷冻法能较好的保存胚胎卵巢的活性,复苏后与新鲜胚胎卵巢组织具有相同的生理活性.     

冻存卵巢组织移植后抗损伤处理对移植结局的影响

背景:卵巢组织移植是无血管吻合移植,改善卵巢组织对移植后损伤的耐受力是提高冻存后移植卵巢组织卵泡存活和发挥功能的关键环节.目的:比较冻存后卵巢组织自体异位移植后,应用血管内皮生长因子、维生素E、黄芪抗损伤处理对卵巢组织形态和功能恢复的影响.方法:将成年雌性Wistar大鼠随机数字表法分为4组:正常对照组、去势组、自体新鲜卵巢组织移植组(卵巢组织未冻存,直接移植)、冷冻保存卵巢组织移植组.冷冻保存卵巢组织移植组移植后分3组干预:未经抗损伤处理组,血管内皮生长因子、维生素E、黄芪联合抗损伤组,血管内皮生长因子、维生素E联合抗损伤组.移植2个月后检测血清雌二醇水平,苏木精-伊红染色后观察卵泡的形态及正常卵泡数量.结果与结论:应用血管内皮生长因子、维生素E、黄芪联合抗损伤组较未用药物组血清雌二醇水平升高,初级卵泡数量增加,且差异显著(P＜0.05),即抗损伤药物对卵巢形态和功能的恢复有作用.血管内皮生长因子、维生素E、黄芪联合抗损伤组血清雌二醇水平、初级卵泡数量略高于血管内皮生长因子、维生素E联合抗损伤组,但差异无显著性意义.尚不能认为加用黄芪抗损伤处理效果更佳.提示自体异位移植后应用血管内皮生长因子、维生素E、黄芪抗损伤处理对卵巢形态和I功能的恢复均有作用.     

大鼠胚胎卯巢冷冻保存和异体无血管皮下移植的生长

背景：胚胎卵巢组织免疫原性低，不易引起宿主的免疫排斥反应，是卵巢异体移植的理想供体。但由于获取胎儿卵巢的不随意性和来源限制。标本的冷冻显得至关重要，成功的冷冻保存和复苏技术是建立胎儿卵巢库的关键。 目的：通过对大鼠新鲜或冻融胚胎卵巢组织异体无血管移植后的组织形态和功能的观察，探讨胚胎卵巢组织异体移植和超速冷冻保存的可行性。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006—03／05在云南省第一人民医院生殖遗传科进行课题设计，于2006—05／2007-02在云南大学单克隆抗体研究中心完成实验。 材料：卵巢来源于孕龄为18—20dSD大鼠胚胎。取阴道脱落细胞涂片证实有正常动情周期未交配过的SD成年雌性大鼠作为移植对象，分4组：正常对照组（n=10）、去势对照组（n=-10）、新鲜胚胎卵巢移植组（n=25）、冷冻胚胎卵巢移植组（n=25）。 方法：正常对照组仅行皮肤筋膜肌肉切开缝合术，去势对照组切除双侧卵巢组织。将孕龄为18-20d的新鲜或经超速冷冻法冷冻复苏的大鼠胚胎卵巢植入去势后4周的大鼠颈部皮下作为实验组，分别为新鲜移植组和冷冻移植组。 主要观察指标：通过阴道脱落细胞的观察和血清雌二醇、孕酮的测定了解大鼠内分泌恢复情况，并对移植卵巢进行组织学观察。 结果：新鲜移植组和冷冻移植组分别有52．17％和38．01％大鼠恢复了动情周期，两组血清雌二醇和孕酮在分别在35和49d恢复到正常，且动情周期天数与正常对照组比较，差异无显著性意义。冷冻移植组大鼠恢复动情周期虽稍短于新鲜移植组，但差异并无统计学意义。63d后取出移植物观察，见移植物色泽红润，表面有丰富的血管形成，镜下见卵巢内有大量的小动脉和小静脉：移植物组织学检查发现卵泡的发育，光镜下可见不同发育阶段的卵泡，有成熟卵泡和黄体形成，形态与正常卵巢无明显差别。 结论：大鼠胚胎卵巢异体异位无血管皮下移植后能存活、生长发育并具有与正常卵巢相似的内分泌功能；超速冷冻法能较好的保存胚胎卵巢的活性，复苏后与新鲜胚胎卵巢组织具有相同的生理活性。     

卵巢组织玻璃化冷冻保存和移植的研究进展

背景:卵巢组织玻璃化冷冻技术作为一种快速、简便、经济的冷冻方式被逐渐应用于卵巢组织的保存。目的:综述国内外关于卵巢组织玻璃化冷冻保存及移植的研究进展。方法:由第一作者检索1995/2011PubMed数据库及清华同方数据库有关卵巢组织玻璃化冷冻保存以及卵巢组织移植技术等方面的文献。结果与结论:玻璃化冷冻是一个超高速的冷冻过程,形成高黏度的"玻璃样凝固状态",可以避免由于冰晶形成所造成的细胞损伤。但至今玻璃化冷冻仍缺乏统一的标准化程序。影响卵巢组织玻璃化冷冻保存效果的主要因素有卵巢组织块的大小、冷冻保护剂的种类、渗透平衡的时间和温度、冷冻载体等。随着低温生物学的发展和卵巢组织冷冻保存效果的提高,卵巢组织的移植已经具备了一定的临床应用可行性。到目前为止,全世界已有一系列关于冻存卵巢组织移植后成功妊娠及分娩的报道,移植成功的关键在于减少缺血再灌注损伤和促进新生血管的形成。     

不同冷冻方法对人卵巢组织血管内皮生长因子表达及血管生成的影响

背景:人卵巢组织冷冻已成为一种保存生育能力的手段,卵巢组织移植后必须经过血管重建过程才能恢复血供,冷冻保存和复苏技术是影响移植后卵巢组织血管重建的关键.目的:比较新型玻璃化冷冻和慢速冷冻后人卵巢组织血管内皮生长因子表达情况及微血管密度,探讨不同冷冻方法对人卵巢组织血管重建的影响.方法:8份卵巢组织标本取自子宫内膜癌患者手术切除的正常卵巢组织,将每份卵巢皮质切成1.5 mm×1.5 mm×1.0 mm大小的组织块共12块后,随机数字表法分为3组:对照组(新鲜组)、新型玻璃化冷冻组和慢速冷冻组.将新型玻璃化冷冻组卵巢组织块依次在含体积分数7.5%乙二醇+体积分数7.5%二甲基亚砜+体积分数20%胎牛血清的TCM-199培养液和含体积分数15%乙二醇+体积分数15%二甲基亚砜+0.5 mol/L蔗糖的TCM-199培养液中平衡脱水,然后直接浸入液氮并装入冷冻管保存,解冻时按浓度梯度1.0,0.5,0.25 mol/L蔗糖和含体积分数20%牛血清的TCM-199培养液依次洗脱冷冻保护剂.将慢速冷冻组人卵巢组织块放入盛有1 mL冷冻液(含1.5 mol/L二甲基亚砜+体积分数20%牛血清+0.1mol/L蔗糖的TCM-199培养液)的1.8 mL冷冻管内平衡,然后放入程序冷冻仪中按设定程序进行冷冻.解冻时按浓度梯度1.0 mol/L二甲基亚砜+0.1 mol/L蔗糖、0.5 mol/L二甲基亚砜+0.1 mol/L蔗糖、0.25 mol/L二甲基亚砜+0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L蔗糖依次洗脱冷冻保护剂.冻融组及对照组均进行体外培养.免疫组织化学观察培养0,2,4,6 d各组人卵巢组织血管内皮生长因子和CD34表达情况,并进行微血管计数.结果与结论:3组人卵巢组织培养前后间质细胞中均见血管内皮生长因子成斑片状弱表达,培养2 d血管内皮生长因子表达均增加并达到峰值,培养4 d均开始减弱,6 d时进一步减弱;与慢速冷冻组相比,新型玻璃化冷冻组血管内皮生长因子表达更接近对照组.3组人卵巢组织培养2 d微血管密度均增加并达到峰值,对照组和新型玻璃化冷冻组明显高于慢速冷冻组(P<0.05):慢速冷冻组培养4 d时微血管密度较培养2 d时显著下降(P<0.05);3组培养6 d时微血管密度较培养2 d时显著下降(P<0.05).与慢速冷冻法相比,新型玻璃化冷冻法能更好地保存人卵巢组织间质细胞和细胞外基质,对卵巢组织血管内皮生长因子表达及微血管生成的影响更少.     

冷冻保存同种异体软骨移植修复膝关节软骨缺损

背景:采用传统方法冻存后,关节软骨细胞存活率低,且软骨表层与深层的软骨细胞存活率差别较大,移植物易发生退行性变,导致手术失败.目的:经打孔梯度降温冻存膝关节软骨后并行异体移植,观察打孔梯度降温冻存对兔关节软骨的影响.方法:自2月龄新西兰白兔膝关节股骨膑面取骨软骨移植物,随机分为3组:实验组在软骨面以3 mm×3 mm矩阵打孔,梯度降温冷冻保存.以非打孔经梯度降温冷冻保存组、非打孔超低温冷冻保存组为对照.复温后移植到成年新西兰白兔相应膝关节缺损部位,观察各组移植物大体形态学、组织化学、免疫组织化学染色效果的差别.结果与结论:实验组、非打孔经梯度降温冷冻保存组大体形态学、组织化学、免疫组织化学染色效果均明显优于非打孔超低温冷冻保存组.实验组与非打孔经梯度降温冷冻保存组效果差别不明显,但实验组明显加强了对中间层软骨组织的保护程度.提示关节软骨的梯度降温冷冻保存效果优于快速降温冷冻保存;关节软骨打孔冷冻保存对深层细胞有一定的保护作用,提高了软骨细胞存活率,延缓了移植软骨组织的退变过程.     

不同冷冻方案保存人类卵巢组织的活性比较

背景：卵巢组织冷冻保存被认为是保存女性生殖内分泌功能安全、有效的方法,但目前尚无统一确定的方案。 目的：探讨3种冷冻方案对人类卵巢组织保存冷冻效果及卵泡活性的影响。方法：采用丙二醇慢速程序冷冻法、二甲基亚砜玻璃化冷冻法、液氮直投法对20例人类卵巢组织进行冷冻保存,复苏后采用细胞存活/死亡荧光分析法计数有活性的细胞,体外培养测定培养液雌二醇浓度及各级卵泡计数,判断3种不同冷冻方案对人类卵巢组织活性的影响。结果与结论：不同冷冻方案冻融后卵巢组织块的活性卵泡率均低于新鲜卵巢组（P 〈 0.05）,二甲基亚砜组最低,液氮直投法组与慢速程序冷冻法组差异无显著性意义。体外培养各冷冻组分泌的雌二醇水平比较,第4天时二甲基亚砜组低于液氮直投法组和慢速程序冷冻法组（P 〈 0.05）,至第8天时各冷冻组雌二醇水平与新鲜卵巢组一致。培养14 d组织学观察,各组卵巢组织内生长期卵泡比例增多,始基卵泡仍然占最主要的。新鲜卵巢组织正常卵泡的总数高于冷冻组（P 〈 0.05）,二甲基亚砜组的正常卵泡数低于液氮直投法组和慢速程序冷冻法组（P 〈 0.05）。提示冷冻保存对卵巢组织卵泡有一定的损伤,但仍能保存大部分始基卵泡的活性,经体外培养后可进一步发育并具有分泌功能,在3种冷冻方案中,慢速程序冷冻法和液氮直投法的冷冻效果优于二甲基亚砜玻璃化冷冻法,液氮直投法操作简便,冷冻效果稳定。     

卵巢移植及移植卵巢的保存

目的:结卵巢移植的研究现状及卵巢组织的冷冻解冻方法。资料来源:应用计算机检索Medline1996-01/2006-12与卵巢移植相关的文章,检索词为“ovary transplantation,auto-ovary transplantation,heterologous transplantation,cryopreservation,vitrification,hysterocarcinoma”,限定文献语种为“English”;同时检索万方数据库2000-01/2006-12相关文章,检索词为“卵巢移植,自体移植,异种移植,低温保存,玻璃化冷冻”,限定文献语种为中文。资料选择:共检索到相关文献280余条,选择卵巢移植及卵巢组织的冷冻解冻方法相关文章,无论观察对象是人还是动物均纳入,筛除明显重复文献。资料提炼:将筛选的文献进一步查找全文,纳入35条文献进行综述。其中26篇论述卵巢的自体移植、异体移植及异种移植的研究进展,另外9篇是介绍卵巢组织的冷冻解冻方法以及各种方法的差异。资料综合:目前卵巢的移植可以分为自体移植、异体移植、异种移植:①目前人类卵巢组织的自体移植无论是异位还是原位移植有效性和实用性尚不完全清晰。理论上自体原位移植在卵泡的发育和恢复生育功能上更具有优势,但是,在实际观测临床应用中,卵巢组织自体异位移植仍然是最佳首选。②目前同种异体移植面临的最大难题就是免疫排斥反应,其次是受体提供者的问题;另外胚胎卵巢组织作为移植物所具有的优越性越来越受到关注,但是在应用于临床中除了有伦理道德等社会问题,还存在潜在的检测不出的基因的异常表达等技术检测问题需要解决。③异种移植仅处于实验室研究阶段,迄今为止绵羊、猪、猫、猴和人等卵巢组织已经作为材料用于实验室异种移植中。在卵巢组织的移植过程中,卵巢组织的冷冻方法有慢速冷冻法、快速冷冻法和玻璃化冷法;大多数冻存的卵巢组织应用快速复温法解冻。结论:随着免疫移植学、卵巢组织冻存技术的发展,卵巢组织的移植技术将成为解决女性生殖及内分泌的最佳有效途径。但是就目前发展状况来看,还存在许多亟待解决的问题。     

传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果的比较

目的:比较传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果,建立一种适合于人胎肝细胞冷冻保存的方法。方法:实验于2006-07/11在广州医学院进行。①人胎肝组织取自中期终止妊娠胎儿(20周,经胎儿亲属知情同意及医院伦理委员会批准)。冷冻保护液包括A液(DMEM培养液含1.5mol/L乙二醇 体积分数为0.2胎牛血清);B液(A液 0.1mol/L蔗糖)两部分。②传统冻存法:用0.025%Ⅰ型胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞。胎肝细胞在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏培养观察。③改良冻存法:胎肝组织在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护液B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏,入DMEM培养液37℃孵育1h,胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞培养观察。④新鲜分离的胎肝细胞做为对照组。⑤复苏后分离所得胎肝细胞用锥虫兰染色评估细胞活率,并记录贴壁时间,观察集落生长情况。结果:①锥虫兰染色结果显示传统冻存法复温后的胎肝细胞活率为(73.8±2.2)%,明显低于新鲜分离的胎肝细胞活率(89.2±3.6)%及改良冻存法所得胎肝细胞活率(82.5±4.2)%(P<0.01)。②贴壁情况观察发现新鲜胎肝细胞与改良冻存法胎肝细胞于培养24h开始贴壁,而传统冻存法胎肝细胞贴壁时间滞后48h。③新鲜胎肝细胞及改良冻存法胎肝细胞于第3天出现生长集落(细胞数>10为一个集落),传统冻存法胎肝细胞在第5天出现生长集落,集落的数量低于改良冻存法及对照组(P<0.01)。结论:改良冻存法可避免冻存前损伤,提高细胞对冷冻的耐受性和冻存复温后细胞的活率。     

苦参碱对于人肝细胞冻存保护效应的实验性研究

目的:了解苦参碱对人肝细胞液氮冻存复苏后功能的影响,探索一种改善人肝细胞冻存的新方法。方法:将胎肝细胞及常规培养的L-02人肝细胞系分别以5种不同冻存保护体系犤10%二甲亚砜(DMSO)、5%DMSO+0.2mg/L苦参碱、5%DMSO+2mg/L苦参碱、5%DMSO+6mg/L苦参碱、5%DMSO+10mg/L苦参碱犦在液氮中冷冻保存1个月。1个月后快速复苏,进行存活率、形态学及功能检测。结果:不同冻存保护体系保存的人肝细胞存活率、形态学及功能表现均有所不同。其中5%DMSO+6mg/L苦参碱组效果最好,复苏后细胞存活率、24h贴壁率及细胞功能检测优于其他冻存液组。结论:⑴苦参碱对人肝细胞液氮冻存有保护作用,6mg/L苦参碱是最好的浓度;⑵苦参碱与DMSO联合使用降低了冻存保护剂DMSO的浓度,表明两者有协同作用。     

枸杞多糖对顺铂化疗诱导的大鼠卵巢早衰模型的卵巢保护作用

目的:探讨枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)对顺铂诱导的大鼠卵巢早衰模型的作用。方法:将80只雌性SD大鼠随机分为对照组、单纯顺铂给药组(DDP组)、顺铂+低剂量LBP处理组(DDP+LBP-L组)、顺铂+高剂量LBP处理组(DDP+LBP-H组)4组。对照组大鼠正常饲养;DDP组大鼠每天腹腔注射2 mg/kg DDP,持续14 d;DDP+LBP-L组和DDP+LBP-H组大鼠每天分别灌胃5 mg/kg,10 mg/kg LBP溶液后,再腹腔注射2 mg/kg DDP,持续14 d。用药14 d后,采集股静脉血、卵巢组织和子宫组织。取卵巢组织进行HE染色和DDX4免疫组织化学染色;对卵巢各发育阶段的卵泡计数和形态进行分析;检测血清中卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和雌二醇(estradiol,E2)的含量;取子宫组织进行HE染色。结果:与对照组相比,DDP组大鼠的卵巢受损,原始卵泡、初级卵泡、窦前卵泡、窦卵泡和总卵泡数减少,闭锁卵泡增加。而DDP+LBP组与对照组卵巢相似,其中高剂量LBP组相似程度更高;与对照组相比,DDP能升高血清中FSH含量而降低E2含量,LBP可改善此情况;DDP处理可损伤大鼠子宫内膜,使腺体数目减少,而LBP处理后子宫内膜损伤情况减轻,且高剂量LBP改善程度更明显。结论:顺铂可对大鼠卵巢造成结构和功能的损害,枸杞多糖可在一定程度上减轻这种损伤,对卵巢起保护作用。     

小鼠卵巢器官不同部位移植的效果比较

背景:最佳移植部位的选择对于保证卵巢的存活起着很重要的作用.目的:比较小鼠卵巢器官不同移植部位自体移植后的生长发育情况.设计、时间及地点:动物实验观察,于2008-09/11在宁夏医科大学生殖与遗传重点实验室完成.材料:清洁级健康ICR品系雌性小白鼠60只,按照不同的移植部位随机分为对照组、自体肾被膜下、颈部皮下、腹腔内及下肢根部肌肉内移植组,12只/组.方法:①对照组:新鲜取卵巢后立刻固定.各移植组在切除双侧卵巢后,立即进行自体异位移植.②肾被膜移植组:在肋脊角处逐层切开两侧的皮肤和肌肉,充分暴露小鼠双侧肾脏,用显微手术镊将完整卵巢由肾被膜切口移入肾脏下端.③颈部皮下移植组:在颈部双侧靠近颈动脉处切口,钝性分离皮下组织,用缝线将附近结缔组织缝成荷包,将完整卵巢植入荷包内并缝合.④腹腔移植组:将卵巢移植于腹腔子宫角系膜处.⑤下肢根部肌肉组织移植组:移植前4 d分别在小鼠左右下肢根部作一切口,用小弯钳在肌层内进行钝性分离制备一创面后,缝合切口.4d后进行自体卵巢移植时,将卵巢组织移进肌层预制的创面内,缝合切口.主要观察指标:于移植后48,168 h取移植卵巢进行组织学和血供重建分析.结果:移植48 h后,肾被膜下移植组卵巢与移植部位重建血供,而下肢根部肌肉移植组无血供建立;移植168 h,腹腔移植组的卵泡计数最低,与对照组相比有显著性差异(P<0.05);下肢根部肌肉移植组卵泡结构正常,但数日较肾被膜移植组及颈部移植组少,但差异无显著性(P>0.05).肾被膜下移植组和颈部皮下移植组存活的卵巢器官内均可见不同发育阶段的卵泡,形态正常,与对照组相近.结论:卵巢组织的肾被膜下及颈部皮下移植较腹腔及下肢肌肉移植更易重建血供并利于卵泡的发育.     

组织工程化软骨的低温保藏

背景:如何保存大量的具有生物活性的组织工程化软骨,并且长时间保持组织工程化软骨的生物活性,建立组织工程软骨库,是组织工程尚待解决的课题.目的:观察低温冻存对组织工程化软骨生物活性的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-02/2008-12在解放军第四军医大学唐都医院中心实验室完成.材料:聚羟基乙酸无纺网为美国Albany公司产品.2周龄新西兰白兔5只,成年新西兰白兔20只由解放军第四军医大学实验动物中心提供.方法:体外培养2周龄新西兰兔关节软骨,取第2代对数生长期培养软骨细胞,制成细胞悬液,调整软骨细胞悬液浓度约为5×1010L-1,接种于聚羟基乙酸三维支架材料上,复合物体外培养1周后冻存,冻存4,8,12周后解冻复苏.1周后接种于成年新两兰兔皮下,术后12周取材.主要观察指标:采用光镜及扫描电镜观察冻存复苏后的组织工程化软骨的生长情况.采用四唑盐比色法测定细胞存活率.体内实验观察软骨细胞形态、软骨分泌胶原情况、基质分泌酸性黏多糖情况.结果:经低温冻存的组织工程化软骨生长良好,冻存4,8,12周细胞存活率差异无显著性意义.组织学观察冻存组织工程骨植入区有软骨生成、胶原和黏多糖生成丰富.结论:深低温冻存对组织工程化软骨的生物活性无明显的影响,可用于保存组织工程化软骨.     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景:非程序降温-80 ℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196 ℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床.目的:观察不同冷冻保护剂对-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响.方法:分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25 mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25 mol/L海藻糖组.采用 -80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平.结果与结论:4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义(P > 0.05).透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显.单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45+细胞群落凋亡发生率可达50%左右.造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤.提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用.     

海藻糖深低温保存外周血造血干细胞的可行性

背景:二甲基亚砜是目前造血干细胞深低温保存的经典保护剂,但其对细胞和患者均有一定的毒副作用.海藻糖是一种稳定的无毒副作用的非还原性双糖,已被广泛应用于红细胞、血小板和胚胎等的冷冻保存中.目的:探讨海藻糖作为低温保存造血干细胞保护剂的可行性.方法:外周血造血干细胞经重组人集落刺激因子动员后,用血细胞分离机采集连续单个核细胞,分为0.5 mol/L.海藻糖组、1.0 mol/L海藻糖组、对照组.采用程序降温法液氮保存,冻存7 d后取出,立即置于40℃水浴箱内复苏.锥虫蓝拒染法检测细胞存活率;采用甲基纤维索半固体培养体系进行集落培养,计数粒-巨噬细胞集落形成单位的回收率;采用CD34-PE/CD45-FITC双标法,流式细胞仪检测CD34~+细胞回收率.结果与结论:与对照组比较,0.5,1.0 mol/L海藻糖组细胞存活率、粒巨噬细胞集落形成单位回收率、CD34~+细胞回收率均明显升高(P<0.001),且0.5 mol/L海藻糖组升高幅度尤为显著(P<0.001或P<0.01).证实海藻糖对于短期内低温冻存的外周血造血干细胞有一定保护作用,浓度为0.5 mol/L的海藻糖保护冻存的造血干细胞效果较佳.     

卵巢组织冷冻保存及移植技术进展

背景:生育力保存技术可以为因肿瘤或肿瘤治疗相关原因失去卵巢功能的女性患者提供恢复内分泌功能和生殖功能的机会。目的:阐述了卵巢组织玻璃化冷冻以及冻融卵巢组织自体移植等技术在重建卵巢功能方面取得的进展和存在的问题。方法:应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中1999-01/2011-12关于卵巢早衰的文章,在标题和摘要中以"卵巢早衰,玻璃化冷冻,卵巢移植"或"premature ovarian failure,vitrification freeze,ovary transplantation"为检索词进行检索。最终选择关于卵巢玻璃化冷冻和自体移植的40篇文献进行综述。结果与结论:对于重建肿瘤相关性卵巢早衰患者卵巢功能,卵巢组织玻璃化冷冻保存和自体原位移植具有广泛临床应用前景。不仅能够恢复自然生育力、生殖功能及内分泌功能,而且不存在免疫排斥,也没有伦理学争议,安全方便。可以相信,随着医学技术的发展和进步,卵巢组织冷冻移植技术将越发成熟,为更多的女性肿瘤患者保存生育力和内分泌功能带来福音。     

枸杞多糖对D-半乳糖致衰老模型大鼠肝脏DNA修复酶8-羟基鸟嘌呤糖苷酶表达的影响

目的:观察不同剂量枸杞多糖对D-半乳糖致衰老模型大鼠8-羟基鸟嘌呤糖苷酶表达的影响。方法:实验于2005-03/08在黑龙江省佳木斯大学生物化学教研室完成。①选用纯系Wistar大鼠40只。随机将大鼠分为4组:衰老组,枸杞多糖大剂量组,枸杞多糖中剂量组,枸杞多糖小剂量组,每组10只。衰老模型对照组:正常饮食,每日上午颈背部皮下按48mg/kg注射D-半乳糖,同时灌服温开水;枸杞多糖小剂量组、枸杞多糖中剂量组、枸杞多糖大剂量组:每组均正常饮食,除每日上午颈背部皮下按48mg/kg注射D-半乳糖外,同时分别按10,50,100mg/kg灌服枸杞多糖(市售枸杞多糖,用双蒸水分别制成10,50,100g/L溶液),连续给药45d。②用Trizol法提取肝组织核酸,反转录聚合酶链反应及凝胶成像技术检测8-羟基鸟嘌呤糖苷酶的mRNA表达水平。③计量资料差异比较采用方差分析和q检验。结果:大鼠40只均进入结果分析。大鼠肝脏组织的8-羟基鸟嘌呤糖苷酶mRNA表达水平:枸杞多糖小、中、大剂量组均明显低于衰老模型组(1.129±0.03,0.919±0.044,0.903±0.043,1.233±0.042,P<0.05),且随剂量的增加,呈下降趋势,枸杞多糖中剂量和大剂量组之间差异不明显。结论:枸杞多糖可以通过降低氧化损伤,减少DNA损伤,继而使修复酶8-羟基鸟嘌呤糖苷酶的表达下降而发挥抗衰老的作用。