海马局部脑组织血流量和神经元特征性变化与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8介导癫痫大鼠的关系

目的:检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8在癫痫大鼠海马神经元的表达及其与癫痫发作大鼠局部脑血流量和神经元变化的关系。方法:实验于2002-05/2003-10在复旦大学神经病研究所完成。选择清洁级SD雄性大鼠60只,随机分为①正常对照组6只:杏仁核注射磷酸盐缓冲液。②空白对照组6只:磷酸盐缓冲液(脑室)+磷酸盐缓冲液(杏仁核内)。③单纯癫痫组36只:杏仁核内注射红藻氨酸诱发癫痫发作,发作1h后经股静脉注射安定(30mg/kg)终止发作,根据处死大鼠的时间点分0,2,4,8,24,72h6组,每组6只大鼠。④试验给药组6只:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抑制剂z-IETD-fmk(脑室,0.3μg于红藻氨酸注射前20min,5min及红藻氨酸注射后1h分3次给药)+红藻氨酸(杏仁核内)。⑤实验对照组6只:磷酸盐缓冲液(脑室)+红藻氨酸(杏仁核内);均于安定注射终止发作后24h处死大鼠。结果评估:①激光多普勒血流测定仪记录局部脑血流。②用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记染色和cresylviolet染色观察海马神经元凋亡和存活的变化及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抑制剂z-IETD-fmk对海马CA3区的脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞和存活细胞的影响。③用免疫荧光和蛋白印迹检测海马半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8的表达。结果:造模过程中有2只大鼠死亡,     

大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化与脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及神经元凋亡

目的：观察大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化，验证半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在癫痫大鼠脑海马CA3区神经元中表达与其神经元凋亡的关系。方法：实验于2002-05／2003-10在教育部重点实验室复日．大学华山医院神经病学研究所完成。选取清洁级SD雄性大鼠60只，随机分为5组：分组情况：①正常对照组6只，杏仁核内注射0.5μL磷酸缓冲液，其余4组均完成造模过程，杏仁核内注射红藻氨酸0．5μg溶于0．5μL的磷酸缓冲液中，pH值调至7．4。②单纯癫痫组36只，根据处死大鼠的时问点分为0，2，4，8，24，72h6组，6只／组，癫痫发作1h后经股静脉注射安定终止发作。③实验给药组6只，脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂z-DEVD-fmk。④实验对照组6只，脑室内注射磷酸缓冲液：⑤空白对照组6只，脑室和杏仁核内均注射磷酸缓冲液结果判定：①观察癫痫发作后双侧脑灌注率的变化，以癫痫发作前10mln的脑血流为基线，计算发作后占相应基线的百分率。②观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂对癫痫发作同侧脑海马CA3区TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)和存活神经元的影响。③观察癫痫发作同侧脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3细胞凋亡线粒体通路效应酶脑内的表达。结果：共60只大鼠进入结果分析。①单纯癫痫4h组癫痫发作前后局部脑血流无明显变化，双侧脑灌注率波动范围在10％以内。②脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂可减少TUNEL阳性细胞，增加存活的神经元。③正常对照组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在脑神经元内构成性表达主要分布于神经元细胞核周围；单纯癫痫组癫痫发作终止24h时同侧脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3弥散于部分神经元的整个细胞，即免疫反应性增强。结论：①癫痫大鼠发作时脑灌注率波动较小，局部腩血流无明显变化，说明其神经元凋亡与脑缺血无关。②给予半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂可明显减少大鼠癫痫侧脑海马CA3区神经元的凋亡，增加存活的神经元。提示半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在介导癫痫大鼠神经元的凋亡中发挥了作用。     

大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化与脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及神经元凋亡

目的:观察大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化,验证半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在癫痫大鼠脑海马CA3区神经元中表达与其神经元凋亡的关系。方法:实验于2002-05/2003-10在教育部重点实验室复旦大学华山医院神经病学研究所完成。选取清洁级SD雄性大鼠60只,随机分为5组。分组情况:①正常对照组6只,杏仁核内注射0.5μL磷酸缓冲液,其余4组均完成造模过程,杏仁核内注射红藻氨酸0.5μg溶于0.5μL的磷酸缓冲液中,pH值调至7.4。②单纯癫痫组36只,根据处死大鼠的时间点分为0,2,4,8,24,72h6组,6只/组,癫痫发作1h后经股静脉注射安定终止发作。③实验给药组6只,脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂z-DEVD-fmk。④实验对照组6只,脑室内注射磷酸缓冲液。⑤空白对照组6只,脑室和杏仁核内均注射磷酸缓冲液。结果判定:①观察癫痫发作后双侧脑灌注率的变化,以癫痫发作前10min的脑血流为基线,计算发作后占相应基线的百分率。②观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂对癫痫发作同侧脑海马CA3区TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)和存活神经元的影响。③观察癫痫发作同侧脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3细胞凋亡线粒体通路效应酶脑内的表达。结果:共60只大鼠进入结果分析。①单纯癫痫4h组癫痫发作前后局部脑血流无明显变化,双侧脑     

体外培养大鼠海马神经元癫痫模型中神经元凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3基因的表达

背景：颞叶癫痫的发病与海马神经元丢失死亡有关，但其海马神经元丢失的具体方式和详尽机制还不清楚，难以确定海马神经元癫痫样放电与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine-containing ASPartate—specific protease，Caspase-3）激活及神经元凋亡的必然联系。 目的：观察体外培养大鼠海马神经元癫痫模型中神经元凋亡及Caspase-3基因的表达情况。 设计：开放性实验。 单位：解放军第二军医大学长海医院神经外科，解放军第二军医大学长征医院神经外科。 材料：实验于2002-06／2003—06在解放军第二军医大学神经外科实验室完成。选取出生24h内的SD大鼠10只，雌雄不拘。Caspase-3流式检测试剂盒购自美国BD公司，PCR引物由上海皓嘉公司合成。 方法：①将24h内新生SD大鼠断头取脑，解剖出双侧海马，制备海马神经元癫痫样放电细胞模型。通过全细胞膜片钳对细胞模型放电情况进行检测。以培养8d并经无镁处理的神经元细胞作为癫痫样放电模型组，以培养8d但未经无镁处理的神经元细胞作为空白对照组，记录电位变化。②采用反转录-聚合酶链法克隆大鼠全长caspase-3 cDNA．并加以标记；采用原位杂交和流式细胞术检测caspase-3基因表达和神经元凋亡情况。 主要观察指标：①Caspase-3基因cDNA的克隆结果。②Caspase-3原位杂交检测结果。③细胞凋亡检测结果。 结果：①反转录-聚合酶链反应扩增的产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳显示约800bp DNA片段区带，与预期值一致。DNA序列测定显示所得克隆的开放阅读框架长843bp。②杂交显示空白对照组海马阳性染色神经元少于10％，神经元突起饱满，形成广泛的突触联系。癫痫样放电模型组无镁处理3h后，染色阳性细胞明显增多；无镁处理12h后，有较多强阳性染色神经元，基本保持有神经元突起，但突起变得菲薄。③流式细胞分析显示。无镁处理6h后凋亡细胞开始明显增加，单位时间内凋亡细胞数不尽一致。 结论：癫痫样放电可以启动caspase-3表达，继而介导神经元凋亡。     

红藻氨酸诱导大鼠癫痫发作时海马神经元凋亡变化的动态观察

目的：探讨大鼠癫痫发作时海马神经元凋亡变化。方法：采用红藻酸氨(KA)诱导大鼠癫痫发作模型，观察行为学及脑电图变化；用神经元尼氏体亚甲蓝特殊染色法观察大鼠癫痫发作时海马CA1区神经元损害情况；用原位细胞凋亡检测法观察癫痫发作时海马CA1区神经元凋亡情况及苯巴比妥干预后神经元凋亡的变化。结果：KA注射后大鼠出现严重边缘性惊厥，脑电图表现为持续性癫痫样放电。海马细胞在KA注射后8h开始出现凋亡阳性细胞，48h达高峰，主要表现在CA1区锥体细胞，经苯巴比妥干预后凋亡细胞明显减少。结论：癫痫发作后的迟发性神经元死亡很可能经由凋亡途径，早期终止癫痫发作可抑制海马神经元凋亡。     

体外培养大鼠海马神经元癫痫模型中神经元凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3基因的表达

背景:颞叶癫痫的发病与海马神经元丢失死亡有关,但其海马神经元丢失的具体方式和详尽机制还不清楚,难以确定海马神经元癫痫样放电与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine-containingASPartate-specificprotease,Caspase-3)激活及神经元凋亡的必然联系。目的:观察体外培养大鼠海马神经元癫痫模型中神经元凋亡及Caspase-3基因的表达情况。设计:开放性实验。单位:解放军第二军医大学长海医院神经外科,解放军第二军医大学长征医院神经外科。材料:实验于2002-06/2003-06在解放军第二军医大学神经外科实验室完成。选取出生24h内的SD大鼠10只,雌雄不拘。Caspase-3流式检测试剂盒购自美国BD公司,PCR引物由上海皓嘉公司合成。方法:①将24h内新生SD大鼠断头取脑,解剖出双侧海马,制备海马神经元癫痫样放电细胞模型。通过全细胞膜片钳对细胞模型放电情况进行检测。以培养8d并经无镁处理的神经元细胞作为癫痫样放电模型组,以培养8d但未经无镁处理的神经元细胞作为空白对照组,记录电位变化。②采用反转录-聚合酶链法克隆大鼠全长caspase-3cDNA,并加以标记;采用原位杂交和流式细胞术检测caspase-3基因表达和神经元凋亡情况。主要观察指标:①Caspase-3基因cDNA的克隆结果。②Caspase-3原位杂交检测结果。③细胞凋亡检测结果。结果:①反转录-聚合酶链反应扩增的产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳显示约800bpDNA片段区带,与预期值一致。DNA序列测定显示所得克隆的开放阅读框架长843bp。②杂交显示空白对照组海马阳性染色神经元少于10%,神经元突起饱满,形成广泛的突触联系。癫痫样放电模型组无镁处理3h后,染色阳性细胞明显增多;无镁处理12h后,有较多强阳性染色神经元,基本保持有神经元突起,但突起变得菲薄。③流式细胞分析显示,无镁处理6h后凋亡细胞开始明显增加,单位时间内凋亡细胞数不尽一致。结论:癫痫样放电可以启动caspase-3表达,继而介导神经元凋亡。     

抑制p38 MAPK通路对大鼠癫痫发作引起海马神经元损伤的保护作用

目的：探讨抑制p38 MAPK通路对减轻红藻氨酸诱导的颞叶癫痫发作引起大鼠海马神经元所造成损害的作用和机制。方法：经侧脑室给予不同剂量(0，0.01，0.1，1μg)S203580(p38 APK特异性抑制剂)预处理，30 in后再予红藻氨酸制作大鼠颞叶癫痫持续状态模型。7d后采用Nissl染色方法观察海马各区的锥体细胞和颗粒细胞的情况。结果：红藻氨酸注射7d后CA3区可见大量锥体细胞缺失，尚存细胞变性，伴局限性颗粒细胞增多，呈放射状分布。CA1区受累较轻，但也存在一定程度的细胞脱失。预先给予SB203580(0.1μg以上剂量)处理的动物以上变化明显减轻。假手术大鼠海马各区有大量正常致密锥体细胞，未见细胞脱失。结论：大鼠侧脑室内注射红藻氨酸引起全身痉挛性癫痫持续状态对海马神经元造成损害，而抑制p38 MAPK通路，对海马神经元起一定保护作用。     

抑制p38 MAPK通路对大鼠癫痫发作引起海马神经元损伤的保护作用

目的探讨抑制p38 MAPK通路对减轻红藻氨酸诱导的颞叶癫痫发作引起大鼠海马神经元所造成损害的作用和机制.方法经侧脑室给予不同剂量(0,0.01,0,1,1 μg)SB203580(p38 MAPK特异性抑制剂)预处理,30 min后再予红藻氨酸制作大鼠颞叶癫痫持续状态模型.7 d后采用Nissl染色方法观察海马各区的锥体细胞和颗粒细胞的情况.结果红藻氨酸注射7 d后CA3区可见大量锥体细胞缺失,尚存细胞变性,伴局限性颗粒细胞增多,呈放射状分布.CA1区受累较轻,但也存在一定程度的细胞脱失.预先给予SB203580(0.1μg以上剂量)处理的动物以上变化明显减轻.假手术大鼠海马各区有大量正常致密锥体细胞,未见细胞脱失.结论大鼠侧脑室内注射红藻氨酸引起全身痉挛性癫痫持续状态对海马神经元造成损害,而抑制p38 MAPK通路,对海马神经元起一定保护作用.     

大鼠中等程度创伤性脑损伤后神经细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与活性的时效关系

目的:观察大鼠中等程度创伤性颅脑损伤后神经细胞凋亡及凋亡执行因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的时间动态演变,并探讨三者之间的时效关系。方法:实验于2004-04/10在解放军第三军医大学创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室完成。选择健康SD大鼠48只,随机分为假致伤组8只和损伤组40只,损伤组根据处死时间分为2,12,24,48,72h共5个时相点,每个时相点8只大鼠。损伤组制备中等程度创伤性脑损伤模型,假致伤组仅作颅骨钻孔而不致伤,术后24h处死。观察中度脑损伤后2h～3d伤侧大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况采用原位末端标记技术;观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的变化采用免疫组织化学及免疫荧光技术。结果:48只大鼠全部进入结果分析。①各组大鼠中度脑损伤后不同时间点大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况:创伤性脑损伤后2h在伤侧皮质和海马区即可见有少量凋亡细胞,并呈逐渐增多趋势,主要分布在伤侧皮质、皮质下白质、海马等区域,12～24h凋亡细胞增多,48～72h达到凋亡高峰,明显高于假致伤组。②各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达:脑损伤后2h在损伤灶及其周围皮质即有少量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞,脑损伤后24～48h阳性细胞数量明显增加。脑挫伤后72h半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数有所下降。假致伤组脑组织偶见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞。③各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化:脑损伤后损伤灶及附近皮质神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高,伤后48h达高峰,损伤侧海马区域神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高,24h达高峰,而后开始下降。结论:大鼠创伤性脑损伤后损伤区周围皮质和损伤侧海马神经细胞凋亡数量的变化与伤后时程有关。伤后细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性增加可能是导致细胞凋亡的因素。     

大鼠中等程度创伤性脑损伤后神经细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与活性的时效关系

目的：观察大鼠中等程度创伤性颅脑损伤后神经细胞凋亡及凋亡执行因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的时间动态演变，并探讨三者之间的时效关系。方法：实验于2004-04／10在解放军第三军医大学创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室完成。选择健康SD大鼠48只，随机分为假致伤组8只和损伤组40只，损伤组根据处死时间分为2，12，24，48，72h共5个时相点，每个时相点8只大鼠。损伤组制备中等程度创伤性脑损伤模型，假致伤组仅作颅骨钻孔而不致伤，术后24h处死。观察中度脑损伤后2h-3d伤侧大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况采用原位末端标记技术；观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达和活性的变化采用免疫组织化学及免疫荧光技术。结果：48只大鼠全部进入结果分析。①各组大鼠中度脑损伤后不同时间点大脑皮质、海马神经细胞凋亡情况：创伤性脑损伤后2h在伤侧皮质和海马区即可见有少量凋亡细胞，并呈逐渐增多趋势，主要分布在伤侧皮质、皮质下白质、海马等区域，12-24h凋亡细胞增多，48-72h达到凋亡高峰，明显高于假致伤组。②各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达：脑损伤后2h在损伤灶及其周围皮质即有少量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞，脑损伤后24-48h阳性细胞数量明显增加。脑挫伤后72h半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数有所下降。假致伤组脑组织偶见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞。③各组大鼠中度脑损伤后不同时间点半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化：脑损伤后损伤灶及附近皮质神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高，伤后48h达高峰，损伤侧海马区域神经细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性2h开始升高，24h达高峰，而后开始下降。结论：大鼠创伤性脑损伤后损伤区周围皮质和损伤侧海马神经细胞凋亡数量的变化与伤后时程有关。伤后细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性增加可能是导致细胞凋亡的因素。     

Caspase-3与癫痫神经元损伤

在细胞凋亡的研究中,许多蛋白酶,特别是蛋白酶同源物的发现,使蛋白酶在细胞凋亡中的地位越来越引人关注。cas pase家族半胱氨酸蛋白酶是目前研究的热点之一。这是一个直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统,在细胞凋亡的分子网络中居中心地位,其活化是凋亡执行阶段的核心环节。近年的研究认为,该家族成员caspase 3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶,caspase 3的活化与癫痫后的神经元损伤密切相关。1caspase家族成员的分类及命名对caspase家族的认识源于秀丽线虫(caenorhabditisele gans ,简称线虫)发育过程中细胞凋亡的遗传研究。第1个cas pas…     

颞叶癫痫模型中黑质多巴胺能神经元变化的实验研究

目的：建立颞叶癫痫模型．探讨颞叶癫痫模型中黑质多巴胺能神经元的改变。方法：实验于2004—05／09在解放军第一军医大学珠江医院进行。取SD大鼠43只，设空白对照组，生理盐水组，红藻氨酸组。生理盐水组及红藻氨酸组大鼠于右侧侧脑室分别注射生理盐水(2mL)和红藻氨酸(5μg)，于给药后第0．5，2．0，12．0，24．0和72．0h处死；取黑质部切片作免疫组织化学检测，根据记录阳性细胞数作半定量检测。结果：对照组及生理盐水组无癫痫发作。红藻氨酸组大鼠均出现癫痫发作，发作于脑室注射红藻氨酸后10min开始，1h达高峰，3—6h后停止。癫痫发作后0.5h开始伴随有黑质多巴胺能神经元阳性细胞数[(80.00&;#177;9．15)个]减少，与生理盐水组【(119．02&;#177;12．02)个】相比其差异有显著性意义(t=4．93l，P=0．003)，2—6h持续下降，3d后细胞数接近正常，与生理盐水组相比其差值没有统计学意义(P&;gt;0.05)。结论：一侧侧脑室注入红藻氨酸，可成功建立癫痫模型。红藻氨酸致痫后伴有黑质多巴胺阳性细胞数的改变，提示黑质多巴胺能神经元可能在颞叶癫痫活动中参与了调节作用。     

右美托咪定预处理对红藻氨酸诱导癫痫小鼠海马神经元的保护作用

目的 构建红藻氨酸诱导的癫痫小鼠模型,探讨右美托咪定(dexmedetomidine, Dex)预处理对癫痫小鼠海马神经元的保护作用。方法 30只雄性ICR小鼠,随机分为对照组、模型组和Dex预处理组各10只。对照组和模型组每日腹腔注射50μg/kg生理盐水,Dex预处理组每日腹腔注射50μg/kg Dex,持续7 d;第8天对照组单次腹腔注射25 mg/kg生理盐水,模型组和Dex预处理组单次腹腔注射25 mg/kg红藻氨酸构建癫痫模型。造模成功后,采用FJB荧光染色法检测3组小鼠海马组织FJB阳性细胞数,采用免疫组织化学法检测小鼠海马组织神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein, NeuN)表达的平均光密度(average optical density, AOD)值,采用Western blot法检测小鼠海马组织离子钙结合衔接分子1(ionized calcium binding adaptor molecule-1, Iba1)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、cleave...     

—侧海马注射海人酸建立颞叶癫痫模型大鼠的相关特征

目的：采用立体定向手术的方法建立海人酸颞叶癫痫大鼠模型，探讨其行为学表现，并观察海马各区病理学改变以及肿瘤坏死因子α的表达特点。方法：实验于2005—03／09在哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心进行。①分组：健康雄性清洁级Wistar大鼠104只，分为空白对照组8只、生理盐水对照组32只和模型组64只，后两组每组又分3，6，12，24h，3，7，15，30d等8个时点，其中生理盐水对照组每时点4只，模型组每时点8只。②大鼠一侧海马CA3区注射海人酸1．0μL（生理盐水对照组抽取生理盐水1．0μL），缓慢注射，于10～15min内注射完毕，留针5min后拔出。③观察各组大鼠的行为学表现，苏木精-伊红染色法观察海马各区病理学改变，免疫组化法检测大鼠脑海马内肿瘤坏死因子α蛋白的动态表达。结果：①在行为学上，模型组大鼠注射海人酸后可出现湿狗样抖动、头面部肌肉阵挛、肢体阵挛及全面强直阵挛发作。空白对照组和生理盐水对照组未见癫痫发作。②病理学上，一侧海马注射可造成双侧损害，注射侧重以CA3和门区为主，对侧轻且以CA1和门区为主。③免疫组化结果：肿瘤坏死因子α蛋白在海马各区均有表达，神经元、胶质细胞均见表达。海马内肿瘤坏死因子α蛋白在3h出现，12h时达高峰．而后逐渐下降，7d后与生理盐水对照组表达水平相似，15，30d又稍高于生理盐水对照组。结论：大鼠一侧海马注射海人酸是理想的人类颞叶癫痫动物模型，内源性肿瘤坏死因子α可能通过各种方式影响脑内功能活动，参与癫痫发病过程。     

颞叶癫痫大鼠海马内谷氨酸脱羧酶蛋白表达的动态变化及其意义

目的:观察大鼠颞叶癫痫发生后海马谷氨酸脱羧酶(glutamicaciddecar-boxylase,GAD)亚型GAD67蛋白的动态变化,探讨其意义和可能机制。方法:112只雄性SD大鼠随机分为实验组(n=70)与对照组(n=42),实验组大鼠选用海人酸腹腔注射法建立颞叶癫痫模型,对照组大鼠腹腔注射无菌生理盐水。选取腹腔注射后3,6,12,24,48h,7,30d为研究的时间点,颞叶海马的CA1区、CA3区、齿状回为研究部位。腹腔给药后每天观察大鼠的行为学变化,大鼠处死前进行脑电图描记。免疫组织化学法检测GAD67蛋白的表达。结果:海人酸致痫后6h实验组大鼠海马齿状回、CA3,CA1区的GAD67蛋白表达分别为0.60±0.02,0.61±0.02,0.58±0.02,致痫后24h分别为0.33±0.03,0.32±0.03,0.31±0.02,均较对照组(0.23±0.02,0.21±0.02,0.20±0.02)增高(P<0.05或0.01),6h时增高显著。结论:颞叶癫痫大鼠海马GAD67蛋白表达的增高是癫痫发生后机体的内源性抗痫机制之一。     

大鼠海马神经元白细胞介素2的变化与癫痫发生的相关性

背景：中枢神经系统中的海马逐渐成为近来研究癫痫发病的重要区域，细胞因子中的白细胞介素2(intedeukin-2，IL-2)是一种重要的免疫因子。同时又是中枢神经系统中的一种重要的神经调质。在体及离体的研究证实：脑内存在IL-2及IL-2R，IL-2能影响下丘脑．垂体轴的功能，并能引起行为及脑电图的改变，IL-2与癫痫发病的联系得到广大学者的关注。目的：探讨细胞因子中IL-2与癫痫发病之间的关系。设计：随机对照的实验研究。单位：江汉大学医学与生命科学学院，华中科技大学同济医学院，中国科学院武汉物理与数学研究所波谱与原子分子国家重点实验室。材料：实验于2002-01／12在华中科技大学同济医学院脑研究室完成。健康成年Wistar大鼠52只，雌雄不限，体质量200～250g，实验前均饲养于安静、无强光刺激的环境中。方法：将Wistar大鼠随机分成3组，实验组侧脑室注入马桑内酯(coriari laetone，CL)2μL，生理盐水组注入等量的生理盐水，空白对照组不做任何处理。然后运用免疫组织化学方法，对大鼠海马IL-2的免疫反应性进行分析；同时对实验中大鼠的行为及脑电图进行观察和记录。结果：实验组大鼠侧脑室注射CL过程中即诱发癫痫，且测到痫性脑电图，生理盐水组和空白对照组无癫痫症状且未记录到痫性脑电图；实验组大鼠海马IL-2免疫反应性较生理盐水组和空白对照组显著增强(P&;lt;0．01)，表现在海马CA1，CA2，CA3区细胞数目增多，突起及其分支增多，着色明显加深；而生理盐水组和空白对照组之间无明显差别(P&;gt;0．05)。结论：IL-2参与癫痫的发病过程，二者之间存在着一定的联系。     

颞叶癫痫模型中黑质多巴胺能神经元变化的实验研究

目的:建立颞叶癫痫模型,探讨颞叶癫痫模型中黑质多巴胺能神经元的改变。方法:实验于2004-05/09在解放军第一军医大学珠江医院进行。取SD大鼠43只,设空白对照组,生理盐水组,红藻氨酸组。生理盐水组及红藻氨酸组大鼠于右侧侧脑室分别注射生理盐水(2mL)和红藻氨酸(5μg),于给药后第0.5,2.0,12.0,24.0和72.0h处死;取黑质部切片作免疫组织化学检测,根据记录阳性细胞数作半定量检测。结果:对照组及生理盐水组无癫痫发作。红藻氨酸组大鼠均出现癫痫发作,发作于脑室注射红藻氨酸后10min开始,1h达高峰,3～6h后停止。癫痫发作后0.5h开始伴随有黑质多巴胺能神经元阳性细胞数犤(80.00±9.15)个犦减少,与生理盐水组犤(119.02±12.02)个犦相比其差异有显著性意义(t=4.931,P=0.003),2～6h持续下降,3d后细胞数接近正常,与生理盐水组相比其差值没有统计学意义(P>0.05)。结论:一侧侧脑室注入红藻氨酸,可成功建立癫痫模型。红藻氨酸致痫后伴有黑质多巴胺阳性细胞数的改变,提示黑质多巴胺能神经元可能在颞叶癫痫活动中参与了调节作用。     

一侧海马注射海人酸建立颞叶癫痫模型大鼠的相关特征

目的:采用立体定向手术的方法建立海人酸颞叶癫痫大鼠模型,探讨其行为学表现,并观察海马各区病理学改变以及肿瘤坏死因子α的表达特点。方法:实验于2005-03/09在哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心进行。①分组:健康雄性清洁级Wistar大鼠104只,分为空白对照组8只、生理盐水对照组32只和模型组64只,后两组每组又分3,6,12,24h,3,7,15,30d等8个时点,其中生理盐水对照组每时点4只,模型组每时点8只。②大鼠一侧海马CA3区注射海人酸1.0μL(生理盐水对照组抽取生理盐水1.0μL),缓慢注射,于10～15min内注射完毕,留针5min后拔出。③观察各组大鼠的行为学表现,苏木精-伊红染色法观察海马各区病理学改变,免疫组化法检测大鼠脑海马内肿瘤坏死因子α蛋白的动态表达。结果:①在行为学上,模型组大鼠注射海人酸后可出现湿狗样抖动、头面部肌肉阵挛、肢体阵挛及全面强直阵挛发作。空白对照组和生理盐水对照组未见癫痫发作。②病理学上,一侧海马注射可造成双侧损害,注射侧重以CA3和门区为主,对侧轻且以CA1和门区为主。③免疫组化结果:肿瘤坏死因子α蛋白在海马各区均有表达,神经元、胶质细胞均见表达。海马内肿瘤坏死因子α蛋白在3h出现,12h时达高峰,而后逐渐下降,7d后与生理盐水对照组表达水平相似,15,30d又稍高于生理盐水对照组。结论:大鼠一侧海马注射海人酸是理想的人类颞叶癫痫动物模型,内源性肿瘤坏死因子α可能通过各种方式影响脑内功能活动,参与癫痫发病过程。     

迷走神经刺激控制海人藻酸诱导大鼠癫痫发作的电生理学研究

目的:通过动物实验,探讨间断性迷走神经刺激(vagusnervestimulation,VNS)控制癫痫的最佳启动时间及其抗痫效果,观察VNS对海人藻酸致痫大鼠皮质电图和海马神经元电活动的影响。方法:实验选用成年、健康、体质量220～250g的Wistar大鼠,40g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉后,颈部皮下注射海人藻酸(10mg/kg)复制癫痫模型。在癫痫发作前后分别给予大鼠左侧迷走神经间断刺激,用银球电极与金属微电极分别记录皮质电图和海马CA1区神经元电活动的变化。结果:①癫痫发作前给予VNS刺激(3.0～4.0mA,33Hz,1ms)50min,皮质电图结果表明可显著降低癫痫发作的严重程度,缩短发作持续时间,甚至可完全抑制发作(F=27.32,P<0.001)。而癫痫一旦发生再给予上述刺激,则只能降低发作的严重程度,而不能完全阻抑癫痫发作。②当皮下注射海人藻酸诱发海马CA1区神经元出现典型的不规则爆发样电活动后,给予上述刺激,CA1区神经元放电频率有所减少,停止VNS60min和120min后,放电频率继续显著下降(F=8.531,P<0.05)。结论:①阻抑海人藻酸致痫模型发作,VNS启动越早,抗痫作用越佳。②间断性VNS对海人藻酸致痫大鼠的抗痫作用     

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3对缺血再灌注大鼠脑海马神经元凋亡的影响

背景：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在正常细胞中以酶原形式存在，受凋亡刺激因素作用后能够被激活从而引起细胞凋亡。 目的：通过检测脑海马组织胞质S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性及海马区神经元凋亡情况，探讨全脑缺血再灌注后脑海马神经元凋亡与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的关系。 设计：随机对照实验。 单位：解放军第三军医大学西南医院急救部。 材料：实验于1999-01／04在解放军第三军医大学西南医院完成。选取雄性Wistar大鼠182只，随机分为3组：假手术组14只，脑缺血再灌注组84只，乙酰天冬氨酰谷氨酰缬氨酰天冬氨酸乙醛（acetyl-asp-glu-valasp．aldehyde，AC-DEVD-CHO）治疗组84只，后两组均设立缺血再灌注8，24。48，72，120，168h 6个时相点，每个时相点14只大鼠。 方法：脑缺血再灌注组、AC-DEVD-CHO治疗组建立大鼠全脑缺血20min再灌注模型，分别于再灌注后8，24，48，72，120，168h处死取海马组织；假手术组施行麻醉及手术，但不夹闭颈总动脉和烧灼椎动脉，术后观察72h后处死取海马组织备检。以单位质量标本于单位时间内裂解产生的氨甲基香豆素量表示标本中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性。各组不同时相点脑组织切片封固后在荧光显微镜下于330～350nm处观察脑海马细胞凋亡情况。 主要观察指标：①各组脑缺血再灌注后不同时相点海马组织S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化。②各组脑缺血再灌注后不同时相点海马细胞凋亡的情况。③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性与海马区神经元凋亡的关系。 结果：实验纳入182只大鼠，脱落14只，共168只大鼠进入结果分析。①各组脑缺血再灌注后不同时相点海马组织S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化：假手术组术后观察72时为0。与脑缺血再灌注组比较，AC-DEVD-CHO治疗组于再灌注24，48，72，120，168h均明显降低[（1．71&;#177;0．03），（1．22&;#177;0．03）；（2．77&;#177;0．09），（1．59&;#177;0．7）；（5．54&;#177;0．51），（2．3&;#177;0．19）；（6．28&;#177;1．71），（3.43&;#177;0．46）；（3．11&;#177;1．21），（1．73&;#177;0．14）nkat／kg；P〈0．05或0．01]。②各组脑缺血再灌注后不同时相点海马细胞凋亡的情况：每400倍视野下，假手术组术后观察72h为（1．2&;#177;0．4）个。与脑缺血再灌注组比较，AC-DEVD-CHO治疗组于再灌注24，48，72，120，168h均明显降低[（6．4&;#177;1．7），（2．8&;#177;0．8）；（11．8&;#177;1．3），（5．8&;#177;1．9）；（19．8&;#177;3．1），（10．0&;#177;1．9）；（31．2&;#177;5．9），（16．4&;#177;2．4）；（19．8&;#177;2．3），（9．0&;#177;2．3）个／400倍视野；P〈均0．011。③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性与海马区神经元凋亡的关系：脑缺血再稽注组、AC-DEVD-CHO治疗组均行直线相关分析，二者的变化呈显著正相关（r分别为0．9356及0．9800，P均〈0．01）。 结论：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活是引起海马神经元调亡的主要因素之一，在缺血再灌注大鼠脑海马神经元凋亡中起着重要作用。