携带RUNX2基因突变的人牙囊细胞的分离培养及鉴定

目的：研究携带RUNX2基因突变位点的人牙囊细胞的分离、鉴定及意义。方法：收集颅骨锁骨发育不良（cleidocranial dysplasia,CCD）患者,鉴定其致病基因RUNX2的突变位点,通过离体培养CCD患者的未萌牙牙囊细胞,检测其携带的基因突变位点,鉴定RUNX2＋/m牙囊细胞。结果：全血基因组测序结果发现,患者RUNX2基因第2外显子插入TG突变,该突变型为c.309_310insTG,成功分离培养及鉴定RUNX2＋/m牙囊细胞,并发现RUNX2基因突变减少了牙囊细胞中此蛋白的表达水平。结论：成功分离培养携带RUNX2基因突变位点的人牙囊细胞,为进一步研究RUNX2基因在牙囊及牙齿萌出中的作用提供实验模型。     

牙乳头/牙囊细胞交互作用对细胞多能性的作用

目的:研究细胞交互作用对细胞多能性的调控作用。方法:建立牙乳头(DPCs)和牙囊细胞(DFCs)体外共培养模型,二者单独培养的细胞为对照组。采用细胞计数、β-gal染色检测细胞生长和衰老情况;免疫荧光染色检测共培养条件下多能性相关因子Oct-4、Sox2和c-Myc的表达变化;通过ALP活性测试检测矿化诱导后的DPCs和DFCs的矿化能力。结果:共培养组的DPCs和DFCs的细胞数明显高于对照组(P<0.05);培养至第7代时,共培养组的DPCs、DFCs中与衰老相关的SA-b-gal表达较对照组明显减弱(P<0.05);Oct-4、Sox2和c-Myc在共培养组DPCs和DFCs中的表达明显强于对照组;共培养组的DPCs和DFCs经矿化诱导14、21 d后,其ALP活性均显著高于对照组(P<0.05)。结论:DPCs和DFCs可通过体外交互作用抑制细胞衰老、促进细胞的多能性相关因子的表达、提高细胞的矿化能力。     

陶瓷化骨对人牙囊细胞分化的影响

目的:培养人牙囊细胞(DFCs),观察陶瓷化骨(CBB)对人牙囊细胞生长和分化的影响.方法:体外分离胚胎期人DFCs,将第三代细胞以CBB为载体立体培养,以平面接种为对照组,用矿化液持续诱导,利用光镜观察细胞生长状态、免疫组织化学观察细胞矿化基质牙骨质附着蛋白(CAP,)及骨涎蛋白抗体(BSP)分泌、Vokassa染色观察矿化情况,了解CBB对DFCs生物学行为的影响.结果:体外连续诱导28 d,实验组光镜下可见DFCs与CBB相容性好,材料周边细胞生长密集,并有向BBC趋化迁移现象,附近细胞聚集,形成Vokassa染色阳性的矿化结节,免疫组织化学染色BSP,CAP阳性着色,部分细胞强阳性着色.对照组细胞复层生长,未形成矿化结节,免疫组织化学染色BSP,CAP阴性着色.结论:体外培养条件下,CBB可诱导人DFCs向成骨和成牙骨质细胞分化.     

颅骨锁骨发育不全患者RUNX2基因突变检测——附1例报告

目的：研究颅骨锁骨发育不全（CCD）患者的RUNX2基因突变。方法：对1例患者进行全身健康状况及口腔专科检查,明确诊断为颅骨锁骨发育不全。提取患者全血基因组DNA,PCR扩增RUNX2基因,BLAST同源序列分析,检测基因突变位点。体外分离培养患者来源的牙囊细胞及正常对照牙囊细胞,cDNA测序验证基因突变。结果：患者RUNX2基因第2外显子插入TG突变,牙囊细胞cDNA测序结果相同,该突变型为c．309_310insTG。结论：成功发现了RUNX2基因新致病突变,补充了国内外CCD致病基因的突变位点数据库。     

颅骨锁骨发育不全患者牙囊细胞的体外生物学特征

目的：在成功分离培养正常同龄人牙囊细胞（dental follicle cells,DFCs）与颅骨锁骨发育不全（cleidocranial dysplasia, CCD）患者牙囊细胞（DFCs-CCD）的基础上,研究其一般体外生物学特征,包括增殖、克隆、成骨及破骨能力。方法：采用 BrdU细胞增殖实验与倍增法研究两种来源 DFCs 增殖能力;用结晶紫染液染色培养12 d 的两种 DFCs,分析其克隆形成能力;并用成骨诱导液诱导两种 DFCs 成骨,用 Western blot 和茜素红染色法分析成骨能力,用实时定量 PCR 方法研究其破骨基因表达差异。结果：DFCs-CCD 的 BrdU 阳性率高于 DFCs,同时 DFCs 的群体倍增时间为（1．834±0．093）d,而 DFCs-CCD 的则为（1．394±0．028）d,差异具有统计学意义（P ＜0．05）;DFCs-CCD 的克隆集落多于 DFCs,但 Runt 相关转录因子2（Runt-related transcrip-tion factor 2,Runx2）、成骨细胞特异性转录因子 Osterix、骨钙素（osteocalcin,Ocn）等成骨相关蛋白表达水平低,而其茜素红染色所示钙化结节同样较少;同时,DFCs-CCD 高表达核因子-κB 受体活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB,RANK）和骨保护素（osteoprotegerin,OPG）等破骨相关基因（P ＜0．05）,而核因子-κB 受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL）水平无统计学差异（P ＞0．05）。结论：相比 DFCs,DFCs-CCD 具有更强的增殖、克隆能力和更弱的成骨能力,而破骨基因表达紊乱。     

纤维蛋白胶不同复合方式对牙囊细胞增殖活性的影响

目的 研究纤维蛋白胶与人牙囊细胞（DFCs）二维（2D）及三维（3D）结合模式对细胞存活、增殖及凋亡的影响,评估纤维蛋白胶作为细胞移植载体的可行性及有效性。方法 采用细胞膜绿色荧光探针（DIO）对存活DFCs细胞膜进行标记,采用ImageJ2x软件细胞计数;采用碘化丙啶（PI）对凋亡细胞进行染色。结果 纤维蛋白胶在3D-2和2D-1复合模式下的降解速度快于3D-1模式;纤维蛋白原浓度为15 mg•mL-1辅以凝血酶浓度2 U•mL-1条件下,DFCs能够存活并生长良好,尤其在3D-1结合模式下更有利于细胞增殖及伸展。结论 纤维蛋白胶可作为一种有效的细胞移植载体,纤维蛋白胶不同的结合方式对细胞的增殖活性有一定的影响,3D-1复合模式更有利于细胞的存活增殖。     

人牙囊细胞与胶原凝胶复合煅烧骨三维培养的实验研究

目的:建立人牙囊细胞(dentalfolliclecells,DFCs)的体外三维立体培养模型。方法:取第4代DFCs分别 接种于煅烧骨(sinteredbovinebone,SBB)(A组)、胶原凝胶(B组)、胶原复合煅烧骨三维支架上(C组),并以二维 培养的DFCs(D组)作对照,1周、2周取材,扫描电镜观察细胞形态以及与材料的贴附情况,细胞计数观察细胞在 材料上的增殖情况,组织化学方法检测DFCs的碱性磷酸酶(ALP)活性。结果:扫描电镜见A组、B组和C组细胞 均完全伸展,但C组细胞数量明显增多,细胞外基质分泌增加,优于A组、B组和对照组D组,而对照组细胞在二维 培养条件下复层生长呈膜状结构,膜表面部分细胞脱落死亡,细胞外基质分泌较实验组少。A组与C组的ALP活 性无差异(P>0.05),但显著高于对照组B组和对照组(P<0.05)。1周时3组细胞Ⅰ型胶原合成情况无明显差 异,但2周时C组细胞的Ⅰ型胶原平均灰度值明显高于其他2组(P<0.01)。结论:A、B、C组对DFCs的贴附、增 殖,分化均有影响,但C组作支架最优。胶原凝胶与煅烧骨的复合支架更有利于牙囊细胞的增殖贴附和分化。     

人牙囊细胞的体外分离、培养及表型鉴定

目的 :建立人牙囊细胞 (dentalfolliclecells ,DFCs)的体外培养方法 ,为牙周组织工程研究提供可靠的种子细胞来源。方法 :分离人 8月龄胚胎下颌磨牙牙胚 ,胰酶消化后分离牙囊组织 ,采用胶原酶消化法和组织块法相结合原代培养人牙囊细胞 ,利用牙囊细胞和上皮根鞘细胞对胰酶的耐受性差别分离纯化 ,通过倒置显微镜及HE染色观察细胞形态及生长状况、透射电镜观察细胞的超微结构 ;采用免疫组化波形丝蛋白 (vimemtin ,Vim)、角蛋白(cytokeration ,CK)、Ⅰ型胶原 (typeⅠcollagen ,ColⅠ )、Ⅲ型胶原 (typeⅢcollagen ,ColⅢ )、纤维连接蛋白 (fibronectin ,FN)和早期矿化相关的标志骨桥蛋白 (osteopontin ,OPN)、骨涎蛋白 (bonesialapretion ,BSP)的表达情况对细胞做表型鉴定。结果 :原代培养的人牙囊细胞生长良好 ,但其中混有少量上皮根鞘细胞 ,经传代可完全分离 ,传至 11代仍保持原有活力 ;牙囊细胞为长梭型 ,成纤维样 ;电镜下见细胞核浆比例大 ,核仁明显 ,含有溶酶体、大量的粗面内质网和发达的高尔基体 ,含有大量的中间丝。电镜结果显示细胞代谢旺盛 ,增殖活性高 ,含有牙囊细胞特有的高密度电子颗粒 ,免疫组化Vim、ColⅠ、ColⅢ、FN、OPN、BSP呈阳性着色 ,抗角蛋白呈阴性着色。结论 :本实验培养的是牙囊细     

JNK在牙囊细胞破骨细胞向分化的实验研究

目的　通过特异性抑制剂SP600125抑制JNK信号通路,探究大鼠牙齿萌出中JNK信号在成熟破骨细胞形成过程中的相关调控机制。方法 分离培养SD大鼠牙囊细胞。用不同浓度的SP600125对细胞预处理,实时定量PCR检测DFCs中核因子κB受体活化剂配体、骨保护素基因表达量。DFCs和BMMs建立共培养体系,TRAP染色观察OC的数量。结果 SP600125在20μmol/L浓度范围内对DFCs的增殖无显著影响（P﹥0.05）,RT-PCR结果示：SP600125干预72h后,RANKL基因表达量下降,OPG上升,与对照组比较差异均有统计学意义（P﹤0.05）。TRAP染色阳性计数结果：各组均有OC生成,9d较7d产生的OC数显著增加,加入不同浓度的抑制剂组破骨细胞数均有减少,与对照组相比差异有统计学意义（P﹤0.05）。结论 本研究阐明了在大鼠牙齿萌出中,SP600125通过抑制JNK信号通路,对OC形成具有一定的抑制作用,可为牙齿萌出、牙槽骨改建等破骨细胞相关性口腔疾病提供研究基础。     

牙囊干细胞诱导成骨的体外研究

目的:体外研究牙囊干细胞(DFSC)的成骨能力,为其在牙周组织工程中的应用提供理论基础。方法:结合组织块法和酶消化法分离培养DFSC,用有限稀释法纯化细胞,经细胞形态、免疫组化和流式细胞技术鉴定DFSC后,然后进行成骨诱导,并通过碱性磷酸酶和茜素红染色、Real-timePCR、Western-blot检测成骨/牙骨质细胞表面标记物ALP、OCN、BMP2、RUNX2的表达。结果:DFSC具有较强的增殖能力,免疫组化示波形丝蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性;DFSC高表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD90、CD105、CD146;随着诱导时间的增加,其ALP、OCN、BMP2、RUNX2的表达明显上调(P＜0.05)。结论:DFSC是牙周组织再生良好的种子细胞,必将为牙周组织再生治疗开辟新的途径。     

NSCL/P患儿异常表达miRNAs的生物信息学分析

目的：：利用芯片杂交技术筛选出非综合征性唇腭裂( NSCL/P)患儿组织中异常表达的microRNAs ( miRNAs),并进行系统的生物信息学分析,预测其参与的生物学过程及信号通路。方法：收集4例健康新生儿的脐带组织和4例2岁以内NSCL/P患儿唇腭组织,分别进行miRNAs芯片杂交的比对研究,筛选出异常表达miRNAs,并将其分别通过TARGETSCAN-VERT、MIRDB和RNA22-HSA 3个数据库进行生物信息学预测并取交集得到靶基因,进行基因功能富集分析( gene ontology)和生物通路富集分析( pathway enrichment)。结果：样本中检测出异常表达的miRNAs 254条(上调表达181条,下调表达73条, P<0.05)。对异常表达的miRNAs进行生物信息学预测并取交集得到靶基因5029个。异常表达的miRNAs靶基因富集于解剖结构的发育、细胞黏附、细胞凋亡、细胞分化和细胞迁移等多个生物学过程;异常表达的miRNAs靶基因信号通路富集于Wnt、 mTOR、cGMP-PKG、TGFβ、PI3K-Akt等信号通路。结论：NSCL/P异常表达miRNAs预测出的靶基因富集于多个信号通路和生物学功能,其相关信号通路与生物学功能提示基因与环境因素能够影响NSCL/P的形成。     

表皮生长因子对大鼠牙囊细胞单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

目的:研究表皮生长因子(EGF)对体外培养的大鼠牙囊细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响.方法:原代培养Wistar大鼠牙囊细胞,选择生长良好的第3代细胞,分别加入不同浓度的EGF与牙囊细胞共孵育5d,MTT法对比观察不同浓度的EGF对牙囊细胞增殖活性的影响,筛选EGF作用于牙囊细胞的最佳效应浓度.将第3代牙囊细胞以1×105/孔接种到培养皿中,加入最佳浓度的EGF孵育0、0.5、1、3、6h后,Trizol一步法分别提取总RNA,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测同一浓度的EGF作用不同时间后,牙囊细胞MCP-1 mRNA的表达变化.数据采用SPSS13.0软件包进行方差分析.结果:在EGF浓度为5～10 ng/ml时,牙囊细胞的增殖活性显著增高(P＜0.05),10 ng/ml时达到最高(P＜0.01).牙囊细胞与10ng/ml的EGF共同孵育3 h,MCP-1 mRNA表达最高(P＜0.01),以后逐渐恢复,但仍比对照组高(P＜0.05).结论:EGF与其受体结合,可作用于牙囊细胞,适当浓度的EGF能显著增加牙囊细胞的增殖活性,并且EGF可通过上调牙囊细胞中MCP-1 mRNA的表达.促进单核细胞聚集.调节牙的萌出.     

CSF-1对体外培养人牙囊细胞OPG表达的影响

目的研究集落刺激因子(CSF-1)对体外培养的人牙囊细胞骨保护素(OPG)表达的影响。方法原代培养人牙囊细胞,传代至第3代,制备细胞爬片,进行OPG免疫组化染色;3~6代人牙囊细胞长至80%时,用胰酶消化,离心,重悬,制成单细胞悬液,接种到细胞培养皿,细胞长满至80%时,培养基中加入25ng/ml的CSF-1,孵育0.5、1、3、6h,分别收集上清液,ELISA法检测OPG蛋白分泌量的变化,提取总RNA进行RT-PCR,检测OPG mRNA的表达变化。结果正常人牙囊细胞OPG蛋白表达阳性;25ng/ml的CSF-1可降低人牙囊细胞OPG的表达,共同孵育1h,OPG表达降至最低(P<0.05)。结论牙囊细胞表达OPG,同时在牙齿萌出的特定时期,CSF-1通过下调人牙囊细胞OPG,减弱对破骨细胞形成的抑制作用,促进破骨细胞分化成熟,调节牙齿萌出。     

串珠素在牙囊发育过程中的表达和意义

目的:观察牙囊发育不同时期串珠素(perlecan)分布、表达情况,探讨其与牙囊发育的关系。方法:出生0 d、1 d、1周、2周的SD大鼠取下颌第一磨牙及其牙囊组织,进行Perlecan免疫组化染色(SABC法),光镜观察其表达、分布,用图像分析测定其灰度值,并进行定量分析比较。结果:串珠素在各时间段牙囊均有阳性表达,而1 d、1周组表现为强阳性。图像分析结果表明1 d组、1周组大鼠阳性结果明显高于0 d组、2周组,出生后串珠素表达随着牙胚发育而不断增强,之后又随着牙胚的成熟而下降。结论:串珠素与牙囊的发育有关,在牙囊发育初期对牙囊基质的形成发挥作用,晚期随着基质的成熟其表达下降。     

牙囊在牙齿萌出时的调控作用

牙囊起源于外胚间充质 ,是包绕在成釉器外围的一层致密的结缔组织 ,在牙齿发育后期形成牙骨质、牙周膜和固有牙槽骨。牙齿萌出是牙齿从颌骨中迁移至功能位的一个复杂的生理过程。以往的研究证明 ,牙齿萌出需要依赖牙囊的存在 ,但其机制一直未明了。以下就近几年来关于牙囊从整体、细胞、分子水平上对牙齿萌出的调控作用所做的研究进行综述。1　牙囊在牙齿萌出时的整体调控作用牙齿的萌出需要依赖牙囊的存在。ＣａｈｉｌｌＤＲ的研究表明 ,以手术方法去除小鼠牙囊牙齿不能萌出 ,而保留牙囊用其它物质置换牙胚结果置换物可以萌出[1] 。Ｌａｒ…     

复合干细胞膜片移植修复后的牙周组织与正常牙周组织对正畸力反应的差异性研究

目的：比较在正畸力作用下经牙囊细胞（dental follicle cells,DFCs）与牙周膜干细胞（periodontal liga?ment stem cell,PDLSCs）复合细胞膜片诱导再生的牙周组织与正常牙周组织中牙齿移动速率的差异,探讨对再生组织实施正畸牙移动的可行性。方法选择6只成年雄性比格犬,拔除上下颌双侧第一前磨牙。左上及右下象限为实验组,于拔牙窝远中制造4 mm ×4 mm ×4 mm骨缺损,移植DFCs/PDLSCs复合细胞膜片修复牙周组织缺损,诱导其重建;左下及右上象限为对照组。移植术后12周,安装正畸加力装置,以尖牙为支抗近中牵引第二前磨牙,力值150 g ,牵引4周后测量实验组、对照组第二前磨牙近中移动速率,进行统计学分析。结果 DFCs/PDLSCs复合细胞膜片修复牙周组织缺损形成典型的“牙槽骨—牙周膜—牙骨质”样结构,具有良好的组织学特点,实验组与对照组第二前磨牙近中移动速率差异无统计学意义（P>0.05）。结论经复合干细胞膜片修复后的牙周组织对于正畸力刺激有良好反应,正畸牙齿移动速率与正常组织无明显差异。     

无翅型MMTV整合位点家族成员5A/受体酪氨酸激酶样孤儿受体2在大鼠牙囊细胞中的表达及其意义

目的 观察在牙齿正常萌出过程中无翅型MMTV整合位点家族成员5A（Wnt5A）/受体酪氨酸激酶样孤儿受体2（Ror2）信号在大鼠体内外牙囊细胞表达的特点,探讨其与成熟破骨细胞形成及牙齿萌出的相关性。方法 分离出生后1~13 d的SD大鼠下颌骨,苏木精-伊红染色观察牙囊及牙槽骨生长发育过程,免疫组织化学法观察在下颌第一磨牙萌出过程中Wnt5A和Ror2在牙囊细胞中的表达。体外培养出生后5~6 d的SD大鼠第一磨牙牙囊细胞,免疫组织化学法观察Wnt5A、Ror2在牙囊细胞中的表达。结果 SD大鼠出生后第2天牙囊开始分化为牙周组织,1~3 d牙槽骨变化不明显,第4天起,破骨细胞数量明显增多。Wnt5A在出生后第1~3天的大鼠牙囊组织内无明显表达,第4天开始出现阳性表达,并持续表达至第13天。Ror2在出生后第1~3天的大鼠牙囊组织表达呈强阳性,而在第4~13天呈弱阳性。结论 Wnt5A、Ror2在牙萌出过程中有特定的时间分布,提示其可能参与牙齿萌出的调控。     

体外培养人牙囊细胞Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白的表达

目的：通过体外培养人牙囊细胞，研究Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白在细胞中的表达，探讨其在牙齿萌出过程中转化为牙周膜细胞的机制。方法：取12岁患者因正畸需要拔除埋藏阻生牙齿的牙囊，组织块法进行人牙囊细胞的培养，通过免疫组织化学染色技术观察Ⅰ型胶原及纤维粘连蛋白在牙囊细胞中的表达及定位。结果：培养的人牙囊细胞呈梭形、卵圆形及多角形，形似成纤维细胞。在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和纤维粘连蛋白的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中，围绕细胞核周围染色较强，细胞核内染色阴性。结论：体外培养人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性，具有合成与分泌Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白的能力。