巨噬细胞移动抑制因子经Rho途径促进人肺成纤维细胞III型胶原合成

目的: 观察重组巨噬细胞移动抑制因子(rMIF)对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)的作用,探讨哮喘气道重塑的发生机制。方法: 不同浓度的rMIF (25-100 μg/L)分别作用于MRC-5细胞48 h, RT-PCR法检测III型胶原mRNA表达,Western blotting检测III型胶原蛋白合成; 100 μg/L rMIF刺激MRC-5细胞48 h,刺激前0.5 h加入Rho激酶特异性抑制剂Y27632, RT-PCR法检测III型胶原mRNA表达,Western blotting法检测III型胶原蛋白表达。结果: 刺激MRC-5细胞48 h,rMIF可呈剂量依赖地诱导III型胶原mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.01)表达。Y27632预刺激后,显著抑制rMIF100μg/L诱导的III型胶原mRNA和蛋白表达(均P<0.01)。结论: MIF可能通过Rho途径刺激人肺成纤维细胞III型胶原合成,从而在哮喘气道重塑的发病机制中发挥重要作用。     

巨噬细胞移动抑制因子经Rho途径促进人肺成纤维细胞Ⅲ型胶原合成

目的:观察重组巨噬细胞移动抑制因子(rMIF)对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)的作用,探讨哮喘气道重塑的发生机制。方法:不同浓度的rMIF(25-100μg/L)分别作用于MRC-5细胞48 h,RT-PCR法检测III型胶原mRNA表达,Western blotting检测III型胶原蛋白合成;100μg/L rMIF刺激MRC-5细胞48 h,刺激前0.5 h加入Rho激酶特异性抑制剂Y27632,RT-PCR法检测III型胶原mRNA表达,Western blotting法检测III型胶原蛋白表达。结果:刺激MRC-5细胞48 h,rMIF可呈剂量依赖地诱导III型胶原mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.01)表达。Y27632预刺激后,显著抑制rMIF100μg/L诱导的III型胶原mRNA和蛋白表达(均P<0.01)。结论:MIF可能通过Rho途径刺激人肺成纤维细胞III型胶原合成,从而在哮喘气道重塑的发病机制中发挥重要作用。     

巨噬细胞移动抑制因子促进肺成纤维细胞增殖和胶原合成

目的： 观察重组巨噬细胞移动抑制因子(rMIF)对人胚肺成纤维细胞（MRC-5）的作用,探讨哮喘气道重塑的发生机制。方法:不同浓度的rMIF (25-100 μg/L)分别作用于MRC-5细胞12 h、24 h或48 h,用CCK-8法测细胞增殖率,羟脯氨酸法检测细胞上清胶原水平,RT-PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA表达,Western blotting检测成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原。结果: 与对照组比,50 μg/L和100 μg/L的rMIF刺激24 h和48 h,显著促进MRC-5增殖(P<0.05或P<0.01)。刺激48 h后,细胞培养上清中,对照组及实验组均可检测到羟脯氨酸,100 μg/L rMIF显著促进羟脯氨酸分泌(P<0.01); rMIF能够剂量依赖地刺激Ⅰ型胶原mRNA 和蛋白合成(P<0.05或P<0.01)。结论:rMIF通过刺激成纤维细胞增殖及胶原合成,可能在哮喘气道重塑的发病机制中发挥关键作用。     

全反式维甲酸对人胚肺成纤维细胞增殖及α-SMA表达的影响

目的: 研究全反式维甲酸(ATRA)对人胚肺成纤维细胞(HFL-I)增殖与分化的影响。方法: 体外培养HFL-I, MTT法检测不同浓度ATRA(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)作用3 d对HFL-I增殖能力的影响。5 μg/L 转化生长因子β₁(TGF-β₁)刺激0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后,RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA表达,刺激0 d、1 d、3 d、5 d后,Western blotting法检测α-SMA蛋白表达。不同浓度ATRA干预,24 h后RT-PCR方法检测α-SMA mRNA表达,3 d后用Western blotting方法检测α-SMA蛋白表达。结果: (1) MTT法检测显示不同浓度ATRA以浓度依赖性方式抑制HFL-I细胞的增殖(P<0.05)。(2)5 μg/L TGF-β₁诱导后,HFL-I细胞中α-SMA mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05)。(3) ATRA以浓度依赖性方式下调TGF-β₁诱导的α-SMA mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论: ATRA能够抑制HFL-I细胞的增殖和TGF-β₁诱导的分化,该作用可能是通过下调α-SMA mRNA和蛋白的表达实现的。     

TGF-β1介导的RhoA/ROCK通路在大鼠肺肌成纤维细胞分化中的调节作用

 目的：探讨转化生长因子β1 (TGF-β1)介导的RhoA/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)通路在调控肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中的作用。方法：胰酶消化法获得原代培养的肺成纤维细胞,进行以下实验：(1) 观察TGF-β1诱导肺成纤维细胞不同时间后p-RhoA、ROCK、磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基(p-MBS)、血清应答因子(SRF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型和III型胶原蛋白表达变化;(2) 将细胞分为对照组、TGF-β1诱导分化组和Y-27632（ROCK通路阻滞剂）干预组,免疫细胞化学染色与Western blotting法分别观察与检测ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型胶原蛋白在细胞内的定位分布与表达。结果：（1）经TGF-β1诱导24 h后,大鼠肺成纤维细胞胞体内出现大量平行或交叉排列的α-SMA抗体标记的肌丝。随着TGF-β1诱导刺激时间的延长,p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型胶原蛋白表达逐渐增高,其中RhoA/ROCK信号（p-RhoA、ROCK、p-MBS）、SRF和α-SMA蛋白分别在诱导后6 h、12 h和24 h达到高峰。I型胶原和III型胶原蛋白表达均在24 h达高峰,分别为诱导前的2.19和3.04倍（P<0.05）。 (2)与TGF-β1诱导分化组比较,当给予Y-27632干预后,在相应时点ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型胶原蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：TGF-β1通过ROCK信号转导通路的活化,刺激了大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,进而促进了胶原蛋白的合成,可能在（矽）肺纤维化形成过程中发挥着重要作用。     

干扰素γ抑制IL-13对成纤维细胞的纤维化作用

 目的：研究干扰素γ（IFN-γ）抑制白细胞介素13（IL-13）对成纤维细胞纤维化作用的影响。方法：将成纤维细胞分为实验组和空白对照组,实验组加入IFN-γ（4×105 U/L）和IL-13（100 μg/L）,共同作用24、48和72 h后,分别用羟脯氨酸法、RT-PCR和Western blotting检测成纤维细胞分泌胶原蛋白、I型胶原α1(Col 1A1)mRNA表达和I型胶原蛋白的表达水平。另外对比空白对照组、IFN-γ组、IL-13组和IFN-γ+IL-13组72 h后Col1A1 mRNA表达和I型胶原蛋白的表达水平。结果：MTT结果表明IFN-γ浓度增加到4×105 U/L后可显著抑制成纤维细胞的增殖（P<0.01）。羟脯氨酸法检测显示48 h和72 h实验组成纤维细胞分泌的胶原蛋白含量显著低于空白对照组（P<0.05）;RT-PCR分析结果揭示48 h和72 h实验组的Col1A1 mRNA表达水平显著低于空白对照组（P<0.05）;Western blotting检测也进一步证实了48 h和72 h实验组成纤维细胞分泌I型胶原蛋白的水平显著低于空白对照组。另外各因素组对比结果显示, 72 h后IFN-γ组Col1A1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于空白对照组（P<0.05）,IL-13组显著高于空白对照组（P<0.05）,而IFN-γ+IL-13组显著低于显著低于其它组（P<0.01）。结论：IFN-γ可抑制IL-13对成纤维细胞的纤维化作用。     

转化生长因子-β1诱导大鼠毛乳头细胞转分化为成纤维细胞的研究

目的 研究大鼠触须毛乳头细胞在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导作用下转分化为成纤维细胞的可能性,从新的角度探讨增生性瘢痕的形成机制.方法 消化收集第4代毛乳头细胞,处理组以 TGF-β1（10 ng/mL）处理细胞4 d;对照组加入正常培养基（不含胎牛血清的DMEM/F12培养液）,每隔24 h观察两组细胞生长形态及生长方式;分别用实时一步法RT-PCR和流式细胞仪检测细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）的mRNA表达和蛋白表达,Western blotting检测成纤维细胞特异蛋白（FSP1）的表达.结果流式细胞仪检测TGF-β1诱导48 h、72 h后α-SMA表达明显低于对照组（P〈0.01）;TGF-β1诱导48 h、72 h、96 h后Vimentin表达明显高于对照组（P〈0.01）.实时一步法RT-PCR检测Vimentin的mRNA表达逐渐增强,α-SMA的mRNA表达在48 h后明显下降（P〈0.01）,但96 h后表达又有所增加;Western blotting法检测FSP1表达在诱导48 h后逐渐增加（P〈0.01）.结论 毛乳头细胞经TGF-β1诱导后,失去其典型的细胞形态及生长方式,而表现出成纤维细胞的细胞形态及生长方式;其相对特异性标记物α-SMA的表达下降,而成纤维细胞的相对特异性标记物Vimentin和FSP1表达增加.故TGF-β1可诱导大鼠毛乳头细胞转分化为成纤维细胞.     

白花丹醌对人肝星状细胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影响

 目的: 研究白花丹醌(plumbagin)对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的体外培养人肝星状细胞(HSC-LX2)NADPH氧化酶4(Nox4 )的mRNA和蛋白表达、活性氧簇(ROS)水平及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响。方法: 体外培养HSC-LX2,随机设立空白组、TGF-β1刺激的模型组、TGF-β1+ plumbagin (2 μmol/L、1.5 μmol/L及1 μmol/L)组;细胞与各药物共同孵育72 h后,采用RT-PCR检测细胞Nox4 mRNA的表达;原位装载探针法测定细胞内ROS的水平;Western blot检测细胞内Nox4和α-SMA的蛋白含量。结果: 与模型组比较,白花丹醌作用72 h后,2 μmol/L和1.5 μmol/L plumbagin能明显降低HSC-LX2细胞Nox4 mRNA和蛋白的表达(P<0.01),下调ROS水平,降低α-SMA的蛋白表达(P<0.01)。结论: Plumbagin可能是通过下调Nox4的表达进而降低ROS生成从而发挥其抑制HSC-LX2细胞活化的作用。     

血小板衍化生长因子DD刺激大鼠肾成纤维细胞增殖及向肌成纤维细胞的转化

背景：血小板衍化生长因子可诱导肾小球系膜细胞及肾间质多种细胞增殖、迁移、转化及细胞外基质的过表达。目的：观察血小板衍化生长因子DD/血小板衍化生长因子βR信号通路激活对大鼠肾成纤维细胞细胞增殖及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响。方法：体外培养正常大鼠肾成纤维细胞(NRK-49F),按照血小板衍化生长因子DD刺激质量浓度分为对照组、1 μg/L组、10 μg/L组、50 μg/L组、100 μg/L组,然后根据50 μg/L 血小板衍化生长因子DD刺激不同时间分为对照组、12 h组、24 h组、48 h组。CCK8检测不同血小板衍化生长因子DD质量浓度及血小板衍化生长因子DD作用不同时间对NRK-49F增殖的影响;Real-time PCR检测各质量浓度组血小板衍化生长因子βR、α-平滑肌肌动蛋白mRNA变化;Western blot检测各浓度组血小板衍化生长因子βR、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达变化。结果与结论：与对照组相比,血小板衍化生长因子DD可明显刺激NRK-49F细胞增殖,呈现剂量依赖性及时间依赖性。血小板衍化生长因子DD可剂量依赖性刺激其相应血小板衍化生长因子βR及α-平滑肌肌动蛋白在mRNA水平及蛋白水平上的表达增加。提示血小板衍化生长因子DD/血小板衍化生长因子βR信号通路的激活可显著刺激NRK-49F细胞的增殖及向肌成纤维细胞的转化。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

Rho激酶在血管紧张素Ⅱ刺激大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用

目的： 探讨Rho激酶在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激心肌成纤维细胞（CFBs）增殖和胶原合成中的作用。方法： 采用胰酶消化、差速贴壁法培养新生Sprague-Dawley (SD) 大鼠CFBs，并用AngⅡ诱导CFBs增殖和胶原合成。采用四氮唑盐（MTT）比色法测定细胞增殖,羟脯氨酸法测定CFBs胶原含量, RT-PCR检测Rho激酶mRNA表达，Western blotting检测肌球蛋白结合亚基磷酸化（MBS-P）表达作为Rho激酶功能活化的标志。结果：（1）AngⅡ（10-７ mol/L）刺激48h可诱导CFBs增殖和胶原合成(均P<0.01)；（2) AngⅡ（10-7 mol/L）可显著上调新生SD大鼠CFBs的Rho激酶mRNA表达并诱导Rho激酶快速活化；（3）在一定浓度范围内，Rho激酶特异性抑制剂hydroxyfasudil (H4413)对AngⅡ（10-7 mol/L）刺激的CFBs增殖与胶原合成具有明显的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。结论： AngⅡ可诱导新生SD大鼠CFBs的Rho激酶mRNA转录并活化Rho激酶，抑制Rho激酶活化对AngⅡ刺激的CFBs增殖与胶原合成具有明显的抑制作用，提示Rho激酶在调控AngⅡ刺激大鼠CFBs增殖与胶原合成中可能具有重要作用。     

白细胞介素-34/集落刺激因子-1R在转化生长因子-β1诱导A549细胞上皮-间质转化中的表达

目的探讨白细胞介素-34/集落刺激因子-1受体(IL-34/CSF-1R)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导A549细胞发生上皮-间质转化(EMT)中的表达。方法体外培养A549细胞;CCK 8法检测不同浓度TGF-β1在不同时间点对A549细胞增殖的影响;选用5μg/L TGF-β1刺激A549细胞(0、12、24、48h),提取细胞蛋白和RNA,Western blotting法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏连蛋白(E-Cad)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白的变化;Real-time PCR法检测IL-34、CSF-1R、MMP-2、MMP-9基因表达的变化。结果 TGF-β1对A549细胞的增殖无明显影响(P0.05)。TGF-β1刺激A549细胞后,间质细胞标志性蛋白α-SMA表达升高,上皮细胞标志性蛋白E-Cad表达下降,纤维化相关的MMP-2蛋白表达升高,MMP-9蛋白表达先升高后下降,TIMP-1蛋白早期出现短暂性增高后,呈持续降低趋势(P0.01)。IL-34mRNA表达逐渐升高,CSF-1R mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达先升高后下降(P0.01)。结论 TGF-β1诱导A549细胞的EMT过程中,存在IL-34/CSF-1R的动态表达。     

BMP-7对高糖环境下肾小管上皮细胞Id2和E2A蛋白表达的影响

 目的: 通过观察高糖环境下给予外源性骨形态发生蛋白-7(BMP-7)对肾小管上皮细胞(NRK-52E)表达分化抑制因子2(Id2)和转录因子E2A的影响,探讨BMP-7减轻高糖诱导的肾小管纤维化病变的可能机制。方法: 将体外培养的肾小管上皮细胞NRK-52E分为3组:对照(control)组、高糖(HG)组和不同浓度BMP-7(10 μg/L和20 μg/L)干预组,HG组和干预组分别设12 h、24 h和48 h 3个时点。Western blot方法检测Id2、E2A、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)蛋白的表达,real-time PCR方法检测Id2 mRNA的表达。结果: 与control组相比,HG组Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平明显下调,E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平明显上调(P < 0.05);与HG组相比,20 μg/L BMP-7干预组Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平均较同时点显著上调,E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平显著下调(P < 0.05)。相关性分析结果显示,Id2蛋白与E2A蛋白表达呈显著负相关(P < 0.05)。结论: BMP-7可阻断高糖诱导的肾小管上皮细胞的纤维化,其机制可能与促进Id2蛋白并抑制E2A蛋白的表达有关。     

TRPC1在TGF-β1诱导支气管上皮细胞间充质转化中的作用

目的:探究经典瞬时受体电位通道1(TRPC1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)间充质转化(EMT)中的作用。方法:以16HBE细胞株为研究对象,免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测16HBE细胞EMT过程中TRPC1 mRNA和蛋白的表达;Western blotting检测TRPC1阻断剂和siRNA干扰对16HBE细胞EMT的影响。结果:(1)TGF-β1刺激后细胞形态明显改变,E-钙黏蛋白表达减少(P0.01),而α-SMA蛋白表达增加(P0.05)。(2)TRPC1广泛存在于16HBE细胞,且TGF-β1刺激后TRPC1 mRNA和蛋白的表达增加(P0.05)。(3)与TGF-β1组相比,阻断剂和TGF-β1共同作用组或siRNA和TGF-β1共同作用组细胞形态改变受抑制,E-钙黏蛋白和α-SMA蛋白表达受抑制(P0.05)。结论:TGF-β1诱导16HBE细胞发生EMT,其机制可能与其上调16HBE细胞TRPC1有关。     

Nrf2过表达对乙醇刺激下肝星状细胞激活与增殖及合成I型胶原的影响

 目的：探讨核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）过表达对乙醇诱导下大鼠肝星状细胞系HSC-T6激活与增殖及I型胶原mRNA及蛋白表达水平的影响。方法：采用脂质体介导法对HSC-T6进行pEGFP-Nrf2重组质粒及pEGFP-N1空载质粒瞬时转染,将细胞分为正常对照组、乙醇刺激组、乙醇刺激+pEGFP-Nrf2质粒组和乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组。采用RT-PCR及Western blotting方法对HSC-T6中Nrf2、I型胶原及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)mRNA及蛋白表达水平进行检测,采用MTT法对HSC-T6细胞增殖水平进行检测,采用流式细胞术对HSC-T6细胞周期分布进行检测。结果：(1) 荧光显微镜下观察显示pEGFP-Nrf2质粒成功转染HSC-T6,转染后48h Nrf2 mRNA及蛋白表达水平较其余组显著升高（P＜0.05）。(2) 乙醇刺激组与乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组之间细胞增殖水平、I型胶原、α-SMA mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）,均明显高于正常对照组（P＜0.05）,细胞周期分布G1期比例下降,S期比例升高（P＜0.05）,而乙醇刺激+ pEGFP-Nrf2质粒组细胞增殖水平及I型胶原、α-SMA mRNA及蛋白表达水平与乙醇刺激组及乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组相比均显著下降（P＜0.05）,细胞周期分布G1期比例显著上升,S期比例显著下降（P＜0.05）,呈G1/S期阻滞。结论：Nrf2过表达可显著抑制乙醇对HSC-T6 I型胶原及α-SMA mRNA及蛋白表达的促进作用,使HSC-T6细胞周期发生G1/S期阻滞,抑制乙醇诱导的HSC-T6增殖水平的升高,提示其对乙醇诱导的HSC-T6细胞活化具有负性调控作用。     

AG490对HEL细胞VEGF和HIF-1α表达的影响

 目的: 探讨JAK2抑制剂AG490对人红白血病(HEL)细胞迁移及对VEGF和HIF-1α表达的影响。方法: 用不同浓度的AG490处理HEL细胞,CCK-8法检测细胞活力,Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡及周期,Transwell小室检测细胞迁移能力,RT-PCR检测JAK2的mRNA水平,Western blot检测p-JAK2、VEGF和HIF-1α的蛋白水平。结果: AG490能够抑制HEL细胞的活力,不同浓度(20、40、60、80和100 μmol/L)AG490作用HEL细胞48 h后,细胞活力分别为88%、75%、48%、10%和0.12%(P<0.05);Hoechst 33342凋亡细胞染色显示80 μmol/L AG490处理细胞48 h后,亮蓝色凋亡细胞较对照组明显增多(P<0.05);流式结果显示80 μmol/L AG490作用细胞48 h后,凋亡率上升;细胞迁移实验结果显示20 μmol/L AG490处理细胞24 h后漏出细胞明显低于对照组(P<0.05);RT-PCR结果显示不同浓度AG490处理HEL细胞48 h后JAK2 mRNA呈剂量依赖性减低;Western blot结果显示实验组细胞的p-JAK2、VEGF和HIF-1α蛋白水平较对照组明显减低(P<0.05)。结论: AG490可通过抑制JAK2信号通路,抑制HEL细胞血管新生因子VEGF和HIF-1α的表达。     

毒胡萝卜素诱导大鼠冠状动脉平滑肌细胞内质网应激模型的建立

目的:探讨SD大鼠冠状动脉平滑肌细胞(coronary artery smooth muscle cells,CASMCs)原代培养方法,并建立CASMCs内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)模型。方法:用组织块贴壁法培养CASMCs,光学显微镜观察细胞形态。免疫荧光技术检测CASMCs的标志分子α-SMA和SM-MHC的表达。采用Western blot检测ERS发生的标志物BiP和CHOP的蛋白表达水平。结果:冠状动脉组织块贴壁培养6 d后,细胞从组织块边缘爬出,呈长梭型,9~10 d细胞生长汇合后表现出平滑肌细胞典型的"峰-谷"状。免疫荧光技术鉴定结果显示,α-SMA和SM-MHC表达呈阳性。不同浓度(0.5、1和2μmol/L)的毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)处理CASMCs 24 h后,Western blot结果显示,TG(1和2μmol/L)处理组的BiP和CHOP蛋白表达与对照组相比增加,差异具有统计学意义。与对照组相比较,1μmol/L TG处理CASMCs 24和48 h后BiP和CHOP蛋白表达显著性增加。结论:采用组织块贴壁法可以成功培养CASMCs。利用1μmol/L TG诱导24 h可建立CASMCs的ERS模型。