基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP2(615)蛋白反式调节基因

目的:对新基因NS5ATP2(615)转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析我们研究组通过抑制消减杂交(SSH)技术筛选得到的新基因NS5ATP2(615)的全长编码序列,构建NS5ATP2的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP2(615).应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP2(615)和pcDNA3.1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测.结果:确定基因NS5ATP2(615)由615nt组成,编码204aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS5ATP2(615)表达质粒转染的细胞有40条差异表达基因,其中18条基因表达增强,22条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关.结论:基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS5ATP2(615)生物学功能及HCV NS5A的致病机制提供了理论依据.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选

目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因. 方法:以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5,以表达质粒pcDNA3.1(-)- NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS5ATP5后,有17条基因表达增强,12条基因表达降低. 结论:成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

基因表达谱芯片技术筛选XTP4基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP4的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP4蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP4基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP4基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP4编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP4。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有21个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP4转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP4蛋白可能的生物学功能提供依据。     

应用基因表达谱芯片技术筛选XTP6基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP6的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP6蛋白可能的分子生物学功能.方法设计并合成XTP6基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP6基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP6编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析的DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现21个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP6转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP6蛋白可能的生物学功能提供依据.     

应用基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒HBsAg基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因表达谱芯片技术研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)主蛋白的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响.方法设计并合成HBsAg主蛋白基因序列特异性的引物,以含有HBV全基因组的质粒G376 A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HBsAg蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达栽体pcDNA3.1(-)-HBsAg.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,29个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了HBsAg转染细胞后差异表达的基因,为深入研究HBsAg可能的生物学功能提供依据.     

HBV pre-X转染HepG2细胞后差异表达基因的筛选

目的:检测HBV Pre-X在真核表达栽体PcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X转染的HepG2细胞中的表达,并筛选其中的代谢相关差异表达基因.方法:将构建的真核表达载体pcDNA3.1-mychis-HBV pre-X转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:将pcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X和pcDNA3.1-myc-his载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA后逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因.结果:构建的真核表达载体经ApsI、BstXI双酶切鉴定,转染HepG2细胞后HBV pre-X表达经蛋白免疫印迹证实:经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是200个和62个.结论:筛选HBV pre-X转染HepG2细胞后的代谢相关差异表达基因,从而为乙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据.     

应用基因表达谱芯片技术筛选HCV p7蛋白反式调节基因

目的应用基因芯片技术对pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-p7分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被HCV p7蛋白反式调节的靶基因,研究p7蛋白的生物学功能。方法以含有HCV全基因组的pBRTM质粒作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增p7蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-p7。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并逆转录成cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,有1个基因表达水平显著上调,22个基因表达水平显著下调。结论 HCV p7蛋白是一种反式调节因子,p7基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。     

基因表达谱芯片技术筛选HBV DNA多聚酶RNase H反式调节基因

目的:应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术,检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶RNase H结构域蛋白(HBV DNA P-RNase H, RNase H)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明RNase H对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:以常规的分子生物学技术构建真核表达载体pcDNA 3.1(-)-RNase H,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA 3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:RNase H表达质粒转染的细胞有222条差异表达基因,其中113条基因表达水平上调,109条基因表达水平下调.结论:应用基因芯片成功筛选了RNase H转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明RNase H的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

HCV核心基因转染HepG2细胞后基因表达差异筛选

目的将真核表达载体pcDNA3.1(-)HCV core转染到HepG2细胞,在HepG2细胞中表达HCV核心蛋白,并筛选其中的差异表达基因。方法将构建的真核表达载体pCDNA3.1(-)HCVcore转染HepG2细胞后进行蛋白免疫印迹检测;将pcDNA3.1(-)HCVcore和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因。结果构建的真核表达载体经双酶切鉴定;转染HepG2细胞后HCV核心蛋白表达经蛋白免疫印迹证实;经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是181个和48个。结论筛选HCV核心基因转染HepG2细胞后的糖类和脂类物质代谢相关的差异表达基因,从而为丙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据。     

hHGF转染HepG2细胞后基因表达谱差异筛选

目的:构建hHGF真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,筛选其对HepG2细胞的差异表达基因.方法:构建pcDNA3.1(-)-hHGF载体,测序鉴定:转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:运用基因表达谱芯片技术,筛选pcDNA3.1(-)-hHGF和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,经表达谱芯片分析差异表达基因.结果:构建的表达载体经酶切和测序确定;转染HepG2细胞后hHGF表达经蛋白免疫印迹证实;经20000个基因的表达谱芯片分析发现,其中有430个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:筛选出HGF转染HepG2细胞后的差异表达基因,对其在肝细胞中多种作用机制研究提供了重要依据.     

新基因NS5ATP4表达产物下调细胞周期素B2基因表达的研究

目的探讨新基因NS5ATP4表达产物对细胞周期素B2(cyclin B2)基因启动子转录的调节作用.方法根据文献确定细胞周期素B2的启动子区域,聚合酶链反应(PCR)扩增细胞周期素基因因启动子(B2p),克隆至真核报告基因表达载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-cyclin B2p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性:并与pcDNA3.1(-)-NS5ATP4共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果成功获得细胞周期素B2启动子的正确克隆.pCAT3-cyclinB2p和pcDNA3.1(-)-NS5ATP4共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的10倍,pCAT3-cyclin B2p的0.14倍.结论本文克隆的细胞周期素B2启动子有顺式调节下游基因表达的活性,NS5ATP4对细胞周期素B2基因的转录具有下调作用.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究

目的 为了探索丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用基因芯片技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系H叩G2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV—H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTN-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A。以pcDNA3．1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术（bioinformatics)，克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PCDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因，命名为NS5AWll，新基因的编码基因序列全长为1257个核苷酸(nt)，编码产物由418个氨基酸残基(aa)。结论 HCVNS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。基因芯片技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为阐明HCVNS5A蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因8的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用抑制性消减杂交(SSH)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCV NSSA表达质粒peDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行SSH分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对，进行电子拼接。根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。结果 结果从HepG2细胞提取总RNA，多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，测序证实，命名为NSSATP8在GenBank中注册，注册号为．AF529369.NSSATP8基因的编码序列全长为1449(nt)，编码产物由483个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCV NS5A反式激活新型靶基因NSSATP8筛选与克隆，进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1反式调节基因的筛选

目的应用表达谱基因芯片技术，研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子DNA结合蛋白1(SBP1)反式调节基因，阐明SBP1蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成SBP1基因序列特异性的引物，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增SBP1基因片段，以常规的分子生物学技术将获得的SBP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-SBP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取mRNA，逆转录为cDNA，与转染空表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定，证实准确无误。提取高质量的mRNA，逆转录为cDNA，进行cDNA芯片分析。在1152个基因容量的表达谱芯片的筛选中，发现有12个基因表达水平显著上调，6个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片成功筛选了SBP1转染细胞后差异表达基因，为进一步阐明SBP1蛋白可能的生物学功能提供依据。     

应用基因芯片技术对乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节基因的研究

目的应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶(HBVDNAP)三个功能域[(N末端蛋白(TP),逆转录酶DNA多聚酶(PR),核糖核酸酶H(RNaseH)]的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明HBVDNAP对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法以常规分子生物学技术分别构建真核表达载体pcDNA3.1()TP,pcDNA3.1()PR和pcDNA3.1()RNaseH,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1()的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果TP有111条基因表达水平上调,88条基因表达水平下调。PR有79条基因表达水平上调,90条基因表达水平下调。RNaseH有113条基因表达水平上调,109条基因表达水平下调。结论应用基因芯片成功筛选HBVDNAP三个功能域蛋白转染细胞后的差异表达基因,为进一步研究HBVDNAP的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据。