TFPI-2重组腺病毒抑制喉鳞状细胞癌侵袭的实验研究

目的:探讨腺病毒介导的组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因转染对喉鳞状细胞癌细胞侵袭的影响.方法:将TFPI-2基因(Ad-TFPI-2)体外转染喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,运用Western-blot检测Hep-2细胞TFPI-2蛋白表达,运用Boyden小室实验检测Hep-2细胞的侵袭能力的变化,将感染Ad-TFPI-2的Hep-2细胞接种于裸鼠皮下观察其成瘤能力.结果:经酶切、测序等方法的鉴定证实了Ad-TFPI-2的正确性,病毒滴度为2.8×1013PFU/L,Western-blot结果显示TFPI-2蛋白在实验组Hep-2细胞表达增高,Boyden小室实验显示实验组Hep-2细胞的侵袭能力降低,裸鼠成瘤实验显示实验组Hep-2细胞成瘤能力下降.结论:TFPI-2重组腺病毒能够有效地抑制人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的侵袭能力.     

Suivivin基因和增殖细胞核抗原在喉鳞状细胞癌中的表达及相关性研究

目的检测喉鳞状细胞癌(LSCC)中Survivin、增殖细胞核抗原(PCNA)基因蛋白的表达特征及临床意义。方法采用免疫组织化学SABC法对76例LSCC及20例喉声带息肉组织进行染色,检测Survivin、PCNA基因蛋白的表达,并分析两者与喉癌临床特征的关系。结果①Survivin、PCNA基因蛋白在LSCC中的表达阳性率分别为60.5%(46/76)和76.3%(58/76),均显著高于声带息肉组织阳性表达率(P<0.05)。②晚期(Ⅱ~Ⅲ期)、组织学分级2~3级和伴颈淋巴结转移的喉癌组织中Survivin、PCNA阳性表达率均显著高于早期(Ⅰ~Ⅱ期)、组织学分级1级和无颈淋巴结转移的喉癌组织(P<0.05)。③喉癌组织中Survivin蛋白表达阳性的PC-NA增殖指数明显高于Survivin蛋白表达阴性者,PCNA的表达与Survivin的表达显著相关(P<0.05)。结论Survivin、PCNA的异常表达在LSCC的发生发展过程中起重要作用,PCNA可反映LSCC的增殖状况,两者临床上可作为LSCC病理诊断及判断预后的参考指标。     

肿瘤转移抑制基因KAI1在喉鳞状细胞癌中表达的研究

目的　探讨肿瘤转移抑制基因KAI1在喉鳞状细胞癌 (简称鳞癌 )中的表达及其与之发生、发展的关系。方法　采用原位杂交方法检测 84例原发性喉鳞癌 (primarylaryngealsquamouscellcarcinoma ,PLSCC)、2 7例喉癌前病变不典型增生 (laryngealprecancerouslesion ,LPL)、10例声带息肉(vocalcordpolyp ,VCP)和 10例正常喉黏膜 (normallaryngealtissues ,NLT)石蜡标本组织细胞中KAI1mRNA的表达。结果　NLT、VCP、LPL和PLSCC 4种组织中KAI1阳性表达的积分吸光度值 ( x±s)分别为 (136 2 0 6 8± 36 6 75 5 )、(1336 74 5± 4 2 85 8 5 )、(90 36 8 8± 2 5 70 1 9)和 (6 7880 6± 2 8189 5 ) ,其中NLT组和VCP组之间差异无显著性 (t=0 14 2 ,P >0 0 5 ) ,NLT组和LPL组之间差异有显著性 (t =4 2 81,P <0 0 1) ;PLSCC组中KAI1表达普遍下调 ,且病理分化G1 2组阳性表达水平高于G3组 ;T1 2病变组高于T3 4组 ;颈淋巴结NO组高于N1及N1以上组 ;临床Ⅰ Ⅱ期组高于临床Ⅲ Ⅳ期组 (P值均 <0 0 1)。KAI1表达与患者性别无关 (P >0 0 5 )。结论　KAI1低表达在喉鳞癌的发生、发展中可能起着重要作用 ,可望作为喉鳞癌早期诊断、评估肿瘤细胞侵袭转移潜能及患者病程发展阶段的指标之一。     

生长抑制基因1在喉鳞状细胞癌中的突变检测及与p53蛋白表达关系的研究

目的:研究喉鳞状细胞癌组织中生长抑制基因1(ING1)基因的突变情况,并探讨p33ING1b与p53蛋白表达的关系。方法:抽提33例石蜡固定喉鳞状细胞癌组织DNA,PCR扩增ING1第2外显子序列,测序检测突变情况;免疫组织化学法检测喉鳞状细胞癌p33ING1b蛋白与p53蛋白的表达水平,并分析两者之间的关系。结果:喉鳞状细胞癌组织中ING1基因无突变现象,但2例组织中出现编码区第170个密码子核苷酸多态性位点,由GGG变为AGG;免疫组织化学检测结果显示p33ING1b、p53蛋白表达与喉鳞状细胞癌临床病理参数之间无相关性。但配对χ2分析显示p33ING1b、p53蛋白表达有明显差异,在p53阳性的病例中,p33倾向于阴性表达。结论:喉鳞状细胞癌中ING1基因的突变较少见,在正常生理环境中,p33ING1b可能与野生型p53蛋白协同发生作用。     

CD44+喉癌细胞的干细胞生物学特性初步研究

目的 初步研究透明质酸盐受体(hyalurate receptor)CD+44喉癌细胞的干细胞生物学特性.方法 原代培养喉痛细胞,利用亲和板结合分离法,将CD+44和CD+44肿瘤细胞分选出来,继续常规培养,比较CD+44与CD+44肿瘤细胞在功能状态、细胞周期、分化状态、克隆形成能力及形态等方面的差异.结果 CD+44细胞在喉癌细胞中所占的百分率为49.8%～53.5%,中位数为51.3%,亲和板结合法分选出CD+44细胞,继续常规培养后恢复原始比例.CD+44细胞中RNA含量低,细胞处于GO和G1期的比例高于CD+44细胞.CD+44细胞中正常鳞状上皮干细胞角蛋白(cytokeratin 14,CK14)表达强阳性或阳性,而分化的上皮细胞标记物外皮蛋白(involucrin)表达弱阴性或阴性.倒置显微镜下观察,CD+44细胞为多角形,突起多;而CD+44细胞为梭形,突起较少.对CD+44细胞进行有限稀释单细胞克隆培养,产生的子代克隆集落出现了异质性细胞,而CD-44细胞未能产生异质性子代细胞.与CD-44细胞相比,CD+44细胞表现出较高的克隆形成能力说明其具有较强的增殖能力.结论 CD+44喉癌细胞具有干细胞的某些特性,肿瘤干细胞可能存在于CD+44细胞内.     

靶向血管内皮生长因子的siRNA表达框架对喉癌细胞株Hep-2细胞生长的抑制作用

目的研究培养Hep-2细胞中，靶向血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的小干扰RNA表达框架（small interference RNA expression cassettes，SECs）对肿瘤细胞生长的影响，检测VEGF基因表达的情况，筛选最佳干扰序列，探讨RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用前景。方法根据siRNA靶序列设计原则，设计出VEGF4个位点的干扰序列，然后进行合成，即为siRNA表达框架的下游引物。由于干扰试剂盒中采用RNA介导的u6聚合酶Ⅲ启动子和改良的终止序列，从而在靶细胞内可以高水平及精确地表达siRNA。我们将4个位点的PCR产物分别转染指数生长期的Hep-2细胞，48h开始观察和检测所产生的RNA干扰的效果。结果形态学检测：转染后的1366位点的细胞可见皱缩、变圆并开始脱落，而其他三个位点的细胞形态学上未见明显的改变；逆转录-聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，与对照组相比，1366位点细胞VEGF mRNA明显被抑制，吸光度为0．05，而其他三个位点的抑制效果不显著，吸光度分别是0．25、0．30和0．18。Western blot分析表明：与其他三个位点相比，1366位点的VEGF蛋白表达明显减弱；流式细胞仪检测表明：1366位点转染细胞的凋亡率为43％，而其他三个位点转染细胞的凋亡率改变不明显，分别为8．9％、6．5％和11．2％；本实验重复性强，同样的实验重复三次结果一致。结论研究表明靶向VEGF的1366位点的siRNA表达框架能高效抑制喉癌细胞株Hep-2细胞的生长。     

多胺生物合成抑制剂对Hep-2细胞生长及端粒酶活性影响的研究

目的观察多胺生物合成抑制剂二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine,DFMO)对人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2生长特性及端粒酶活性的影响,以期为抑制多胺生物合成逆转肿瘤恶性表型的分子机理寻找线索.方法根据细胞形态、细胞生长曲线及流式细胞计(flowcytometer)观察分析Hep-2细胞生长状况;用端粒酶重复序列扩增法(telomeraserepeatamplificationprotocol,TRAP)检测Hep-2细胞端粒酶活性.结果DFMO(2.5mmol/L或5mmol/L,5d)处理Hep-2细胞,其生长受到明显抑制;G1期细胞增多,而S期细胞减少;细胞形态及FCM证明有细胞凋亡诱导;端粒酶活性受到明显抑制.当用腐胺与DFMO同时处理Hep-2细胞时可防止上述变化的发生.结论多胺生物合成抑制剂可引起Hep-2细胞的增殖抑制及凋亡诱导,这些变化与端粒酶活性的抑制有关.提示端粒酶的抑制可能是抑制多胺生物合成导致肿瘤恶性表型逆转的重要因素.     

喉鳞状细胞癌和喉乳头状瘤中Survivin表达的意义

目的：探讨Survivin蛋白在喉鳞状细胞癌和成人喉乳头状瘤中的表达及其意义。方法：应用免疫组化方法对46例喉鳞状细胞癌、24例癌旁组织和20例喉乳头状瘤以及16例正常喉粘膜标本中Survivin的表达进行检测。结果：Survivin蛋白在喉癌组织、癌旁组织和喉乳头状瘤中的阳性表达率分别为71.74%（33/46）、33.33%（8/24）和40.0%（8/20）,在正常黏膜组织中没有表达,喉癌组中的阳性表达率分别显著高于正常组织、癌旁组织及喉乳头状瘤中的表达率（均P〈0.01）。且发生恶变的喉乳头状瘤Survivin蛋白均为阳性表达。但Sur-vivin阳性表达与喉癌的发生部位、分级、分期、淋巴结转移以及病理分级没有关联。结论：Survivin在喉癌组织中过度表达,参与了喉癌的形成,是喉癌形成的一个早期事件,可望成为预测成人喉乳头状瘤恶变的一个诊断方法。     

喉鳞状细胞癌组织中p63表达的临床意义

目的：探讨p63基因在喉鳞状细胞癌中的表达及其临床意义。方法：用免疫组织化学法检测63例喉鳞状细胞癌（喉癌组）及其45例癌旁组织（癌旁组）、24例转移淋巴结（转移淋巴结组）、40例未转移淋巴结（未转移淋巴结组）及25例喉非癌组织（非喉癌组）中p63基因的表达。结果：p63基因在喉鳞状细胞癌组织中均为细胞核阳性表达,喉癌组及转移淋巴结组的中、强阳性率为95．2％（60／63）和83．3％（20／24）;癌旁组及未转移淋巴结组中无中、强阳性表达;非喉癌组中1例乳头状瘤为弱阳性表达,其余均为上皮细胞或基底细胞核弱阳性表达。结论：p63可作为喉鳞状细胞癌有特异性的标记物,对喉鳞状细胞癌的早期诊断和鉴别诊断有重要意义。p63可能主动参与了调控喉鳞状细胞癌的发生过程,但在喉鳞状细胞癌的发展过程中处于被激活状态,可能在发展过程中发挥负反馈的作用。     

基质金属蛋白酶-2在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的：探讨基质金属蛋白酶（MMP）-2在喉鳞状细胞癌（LSCC）中的表达及临床意义。方法：采用免疫组织化学SP法检测了63例LSCC及其中20例癌旁安全缘正常组织（ASM）和18例声带息肉（VCP）中MMP2的表达。结果：MMP2在LSCC、VCP和ASM中的阳性率分别是66．7％、33．3％、15．0％，3者之间均差异有统计学意义（均P〈0．05）；在I．SCC不同病理分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级间表达存在差异（均P〈0．05）；在LSCC淋巴结转移与非转移者间的表达差异无统计学意义（P〉0．05）；在不同临床分期及不同年龄组间的表达差异无统计学意义。结论：MMP-2可能只在LSCC发生及发展中起重要作用，而与LSCC的转移无关。     

喉鳞状细胞癌中脆性组氨酸三联体基因微卫星的不稳定性和杂合性丢失

目的　探讨脆性组氨酸三联体 (fragilehistidinetriad ,FHIT)基因微卫星不稳定性(microsatelliteinstability ,MSI)和杂合性丢失 (lossofheterozygosity ,LOH)与喉鳞状细胞癌 (简称鳞癌 )发生、发展的关系。方法　采用聚合酶链式反应 简单序列长度多态性 银染技术 ,分析 4 1例喉鳞癌中FHIT基因D3S12 34和D3S130 0位点的MSI及LOH。结果　D3S12 34位点LOH发生率为 4 4 4 % (16 /36 ) ,MSI发生率为 19 4 % (7/ 36 ) ;D3S130 0位点LOH发生率为 36 4 % (12 / 33) ,MSI发生率为 2 4 2 % (8/33)。两个位点总的LOH发生率为 5 2 6 % (2 0 / 38) ,总的MSI发生率为 2 8 9% (11/ 38)。总的LOH发生率与喉鳞癌患者TNM分期、病理分级、淋巴结转移及复发有关 (P <0 0 5 ) ,总MSI发生率与喉鳞癌患者淋巴结转移有关 (P <0 0 5 )。结论　FHIT基因LOH和MSI与喉鳞癌的发生、发展有关 ,并可能为喉鳞癌的早期诊断提供新的途径和依据     

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在喉鳞状细胞癌组织中的表达

目的：了解细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)在喉鳞状细胞癌(LSCC)及喉癌前病变的表达情况,探讨其与LSCC浸润和转移的关系。方法：用免疫组织化学SP法对42例LSCC、28例喉癌前病变和20例正常喉组织中的EMMPRIN表达情况进行检测。结果：EMMPRIN在LSCC和喉癌前病变的阳性表达率分别为88．1％和57．1％,明显高于正常喉组织的5．0％,Ⅲ～Ⅳ期LSCC组织的强阳性表达率为76．0％,高于Ⅰ～Ⅱ期的强阳性表达率17．6％。伴有颈淋巴结转移的LSCC组织的EMMPRIN强阳性表达率高于无淋巴结转移组。结论：EMMPRIN在LSCC有较高的阳性表达。EMMPRIN的表达与LSCC的分期和是否存在淋巴结转移有关。LSCC组织EMMPRIN的表达影响LSCC的浸润和转移。     

核因子κB/p65与环氧合酶2在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的：探讨核因子κB／p65(NF-κB／p65)和环氧合酶2(COX-2)在喉鳞状细胞癌(LSCC)中的表达和临床意义及两者间可能存在的相互关系。方法：采用免疫组织化学SP法检测41例LSCC和10例声带息肉组织中NF-κB／p65和COX-2蛋白的表达水平。结果：NF-κB／p65和COX-2蛋白在喉癌组与对照的声带息肉组比较有显著性差异。进一步定性分析发现COX-2与喉癌的组织病理学分化程度有关。Spearman相关分析显示NF-κB／p65与COX-2高度相关。结论：①喉癌中NF-κB／p65与COX-2的表达均升高。②NF-κB／p65可能促使COX-2的表达。③NF-κB／p65可能成为喉癌治疗的新靶点。