免疫磁珠分离脐血CD133阳性细胞的方法研究

目的探讨免疫磁珠分离脐血CD133阳性细胞的方法。方法6%羟乙基淀粉(HES)和Ficoll-Paque联合应用分离出脐血中单个核细胞,再用MACSCD133磁珠分离试剂盒分选其中的CD133+细胞。结果经MACS分离的脐血中CD133+细胞数平均为(6.3±2.9)×105/ml,占单个核细胞的(1.41±1.14)%,经流式细胞仪检测CD133+细胞纯度为75%￣85%。结论免疫磁珠法是分离脐血CD133阳性细胞的较好的方法。     

免疫磁珠法分离人外周血CD4+CD25+调节性T细胞

目的 建立人外周血单个核细胞中CD4 CD25 调节性T细胞(regulatery T cells,Treg)免疫磁性细胞分离力(megnetic activated cell sorting,MACS),并鉴定其分离效率.方法 采用免疫磁珠两步法(即阴性分选和阳性分选2步)分离人周血单个核细胞中的CD4 CD25 调节性T细胞,首先采用生物素标记的鸡尾酒抗体和抗生物素标记的磁珠阴性分选CIM细胞,再用抗CD25 的磁珠阳性分选CD4 CD25 T细胞.分离后的细胞经抗体染色后再通过流式细胞仪检测其分离纯度;内因子染色检测其转录因子FOXV3的表达频率;台盼蓝染色检测细胞的存活率;3H-TdR掺入法检测其对CD4 CD25-T细脆殖抑制效应.结果 阴性分选CD4 T细胞的纯度为(92.2±1.7)%,阳性分选后CD4 CD25 Treg细胞的纯度(95.1±1.2)%.胞内因子染色FOXF3在CD4 CD25 Treg细胞中的表达率为(80.4±1.2)%,台盼蓝染色细胞存活率为(95.6±3.3)%.3H-TdR掺入法检测其对CIM CD25-T细胞具有明显的抑制作用.结论 采用免疫磁性细胞分离技术能够高效、快地得到一群纯度高并且细胞活力好的CD4 CIY25 Treg,为进一步研究其功能提供了方便.     

人胎儿脑室区神经前体细胞的分离纯化、培养及鉴定

目的建立有效的人胎儿神经前体细胞分离及纯化系统。方法取人自然流产胎儿脑室区(VZ)并制备单细胞悬液,采用免疫磁珠法分离CD133阳性及CD133阴性细胞群,体外培养并比较两者增殖能力。用免疫荧光化学方法检测CD133阳性细胞群中神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达及诱导分化后的多向分化潜能。结果纯化后CD133阳性细胞群体外扩增能力强,在无血清培养体系中能形成神经球并可连续传代,免疫荧光化学法检测表明其nestin抗原阳性,诱导分化后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。而CD133阴性细胞在培养体系中多呈单个分散状态,神经球形成数目与CD133阳性细胞有显著性差异(P<0.05)。结论免疫磁珠法可有效分离人胎儿脑内CD133阳性细胞,且该细胞在体外培养体系中具有神经前体细胞的特征。     

免疫磁珠负性分离纯化小鼠脾脏CD8+ T细胞

目的 探讨小鼠脾脏CD8 T细胞的免疫磁珠负性分选方法,并对分选后所得细胞进行纯度、活力及功能检测.方法 以免疫磁珠负性分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD8 T细胞,流式细胞术检测所得细胞的纯度,台盼蓝检测细胞活力并用ConA刺激检测增殖能力. 结果 经过流式细胞仪测定免疫磁珠负性分选后的小鼠脾脏CD8 T细胞纯度达到(91.6±3.6)%,台盼兰染色细胞活力为(94.9±3.2)%,ConA刺激72 h后有(56.3±1.7)%的细胞增殖.结论 免疫磁珠负性分选法能够分选出高纯度的CD8 T细胞,并且不影响分选靶细胞的细胞活力和功能.     

T淋巴细胞清除促进脐血造血细胞的体外扩增

采用抗CD3或抗CD8单克隆抗体的补体细胞毒方法清除脐血单个核细胞 (MNC )中T淋巴细胞 ,CD34免疫亲和柱纯化MNC中CD34 +细胞 ,流式细胞技术 (FACS )分析细胞表面标志。将CD34 +细胞中加入含多种造血生长因子的培养基进行体外液态扩增 ,并观察粒 巨噬集落 (CFU GM )和多向祖细胞集落 (CFU GEMM )形成能力。结果CD3+或CD8+细胞清除组和MNC经CD34免疫亲和柱纯化后 ,CD34 +细胞分别为 5 9 5 2 %、 5 6 70 %和 5 0 72 % ,比未纯化组 (1 0 7% )纯度大幅度提高。抗CD3单抗清除 +CD34纯化组和单纯CD34纯化组经造血生长因子刺激培养第 14天 ,细胞总数分别扩增 110 40倍和 87 0 0倍。抗CD3单抗清除 +CD34纯化组、抗CD8单抗清除 +CD34纯化组和单纯CD34纯化组的CFU GM产率分别为 2 86 5 0± 12 0 2、2 88 5 0± 17 68和 2 19 5 0± 5 3 0 3,前者虽高于后者 ,但差异无显著性。CFU GEMM产率分别为 376 67± 43 2 4、 438 33± 36 73和 311 0 0± 40 11,抗CD3单抗清除 +CD34纯化组无显著差异 ,抗CD8单抗清除 +CD34纯化组显示出显著性作用 (P <0 0 5 )。     

免疫磁珠分选系统在分离大鼠骨髓干细胞群中的应用

采用免疫磁珠分选系统(MACS)分离大鼠骨髓Thy-1.1 干细胞群。收集大鼠胫骨和股骨的骨髓细胞,Percoll密度梯度离心分离单个核细胞,Thy1.1单抗标记,间接MACS分离纯化Thy-1.1 干细胞群,流式细胞仪检测其纯度和分选前后CD34 百分比,台盼兰拒染法检测细胞活力,计算回收率。结果表明分选后的Thy-1.1 细胞纯度达94.2%,回收率64.7%;分选后细胞活力为99.6%,与分选前99.8%无明显差异;分选前CD34 百分比为1.2%,与分选后1.3%无差异。MACS能有效分选大鼠骨髓Thy-1.1 干细胞群,所得细胞纯度高,细胞活力保持好。大鼠Thy-1.1抗原与CD34分子无明显相关性。     

人CK8&18阳性胸腺上皮细胞对脐血CD34~+细胞向T细胞分化的影响

目的:通过CK8/18阳性胸腺上皮细胞与人脐血单个核细胞在Transwell板的共培养,探讨CK8/18阳性TEC对T细胞增殖分化的影响。方法:用胶原酶消化法分离纯化胸腺上皮细胞、免疫组化鉴定分离纯化的TEC,采用密度梯度离心法分离获得脐血单个核细胞,并采用免疫磁珠分选CD34+细胞,将TEC种植培养于Transwell双层培养板上层,使其均匀平铺于上层板底部,再将分选后的细胞加入上层小室,经过48小时的共培养,流式细胞术检测进入下室细胞的表型变化。结果:分离纯化的TEC经免疫组化鉴定CK8/18阳性。TEC与脐血单个核细胞共培养后,CD3+CD4-CD8-双阴性、CD3+CD4+CD8-单阳性细胞显著增加,CD3+CD4+CD8+双阳性细胞亚群细胞减少,CD8单阳性细胞增加不明显;CD45RA阳性细胞比率无显著变化,CD45RO阳性细胞比率显著增加。结论:CK8/18阳性TEC能选择促进脐血单个核细胞CD4+T细胞和CD45RO+细胞增殖。     

年龄对人细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞中穿孔素表达的影响

目的　通过研究健康儿童、成人和老年人外周血淋巴细胞 (PBL)中细胞毒效应分子穿孔素 (PFP)的表达水平的变化 ,了解细胞毒性T细胞 (CTL )的杀伤活性随年龄增长而下降的分子机制。方法　利用抗人PFP、抗人CD3和抗人CD5 6单克隆抗体 (mAb) ,采用单标记免疫组化染色法 ,检测外周血单个核细胞 (PBMC)中PFP的表达。采用双标记免疫组化染色法 ,检测上述细胞表面标志CD3或CD5 6的表达和细胞内PFP的表达。结果　儿童组、成人组及老年组PBL中表达PFP阳性细胞的百分率 (% ) ,分别为 (2 6 .4± 2 .7) % ,(2 1.6± 3.2 ) %和 (13.4± 2 .0 ) % ,老年组明显下降 ,与其他两组相比较P <0 .0 0 1。 3个年龄组CD3+ T细胞表达PFP的阳性率 (% ) ,分别为 (30 .1± 4 .8) %、(2 1.4± 7.3) %和 (18.8± 4 .2 ) % ,随年龄的增长而显著下降。3个年龄组CD5 6 +NK细胞PFP的表达差别不显著。结论　健康人PBL中PFP的表达随年龄增长而递减 ,CD3+ T细胞亚群PFP表达水平的下降尤其显著。这可能是老年人CTL杀伤活性下降的重要原因之一     

免疫磁珠法分选P75NTR阳性的人脑胶质瘤细胞

目的:建立免疫磁珠法分选P75NTR阳性的人脑胶质瘤细胞.方法:采用P75NIR单克隆抗体(mAb)以及兔抗鼠IgG1标记的微珠,通过MACS分选器MiniMACS以及MS分选柱分离P75NTR阳性和阴性的人脑胶质瘤细胞,并采用酶免疫染色法鉴定分离的细胞.结果:通过免疫磁珠分选法,成功将p75NTR阳性和阴性的人脑胶质瘤细胞分离(纯度达95％以上),且不影响细胞活性(细胞培养成活).结论:P75NTR阳性细胞的分选和纯化,为下一步进行体内外研究P75NTR对脑胶质瘤的发生、发展及侵袭等的作用提供条件.     

Percoll离心结合免疫磁珠分选的方法从外周血分离单核细胞

目的 探讨采用Percoll密度梯度离心结合免疫磁珠分选从人外周血富集白细胞层中分离提纯单核细胞的方法.方法 采用Ficoll密度梯度离心分离淋巴细胞得到外周血单个核细胞,Percoll密度梯度离心从外周血单个核细胞中富集单核细胞,免疫磁珠阴性分选纯化单核细胞.流式细胞术检测细胞CD14和CD16的表达,分析单核细胞分...     

5氟尿嘧啶上调干细胞标记物CD133在结肠癌细胞中的表达

目的: 研究通过5氟尿嘧啶(5-FU)对结肠癌干细胞标记物CD133表达的影响,探讨5-FU对结肠癌干细胞的影响。方法: 用流式细胞仪检测CD133在结肠癌细胞株表面的表达, 磁珠细胞分离的方法分离结肠癌细胞株DLD1中CD133阳性和阴性的细胞群,细胞克隆形成实验检测2群细胞的自我更新能力,新型四唑氮盐方法(MTS)检测2群细胞对5-FU敏感性的差异,qPCR方法检测5-FU处理结肠癌细胞后CD133mRNA水平的变化。结果: 结肠癌细胞株DLD1、HT29、SW480、HCT116、Lovo、RKO细胞表面CD133的表达率分别为30.20%、82.00%、0.34%、91.80%、85.30%、0.28%。DLD1细胞中以CD133为标记有2群明显的细胞,MACS方法分离后阳性细胞群中CD133为87.21%±5.33%, 而阴性细胞群中阴性细胞的比例为84.30%±4.65%;CD133阳性的细胞与未分离及CD133阴性细胞相比,克隆形成能力强(46.33%±4.44% vs 31.00%±2.00%,P<0.05),对5-FU的敏感性下降20%,P<0.01。在DLD1和HT29细胞中,5-FU 1 mg/L上调CD133mRNA水平的表达,从1升为1.684±0.012(P<0.01)、HT29细胞从30.702±0.284升为49.379±0.460(P<0.01)。结论: 与CD133阴性细胞相比CD133阳性细胞克隆形成能力强,对5-FU的敏感性下降;5-FU上调干细胞标记物CD133mRNA水平的表达,CD133阳性的结肠癌干细胞在5-FU的治疗过程中被富集。     

低氧对结肠癌SW480细胞生存的影响及与细胞自噬的关系

 摘要：目的 观察低氧微环境对结肠癌细胞增殖、侵袭及自噬的影响,探讨低氧对结肠癌细胞生存及与自噬的关系。方法 免疫磁珠分选CD133+ 细胞;Boyden小室实验研究结肠癌细胞的侵袭;透射电子显微镜（TEM）观察细胞的超微结构;MDC荧光检测自噬囊泡;联合运用流式细胞仪和台盼蓝染色研究自噬与细胞增殖的关系。结果 Boyden小室实验中低氧微环境增加结肠癌细胞SW480进入下室的细胞数量;在实验组低氧的微环境中SW480细胞的MDC荧光强度由20.53±0.64降低至17.00±0.20,而CD133+ 细胞的MDC荧光强度由19.89±0.58增加至33.13±1.95（P<0.05）。台盼蓝染色实验显示,与对照组相比,低氧微环境中SW480活细胞率随着时间的延长而降低（P<0.05）;但CD133+ 活细胞率无显著改变。结论：低氧可增加SW480细胞的侵袭性,细胞自噬水平下降,活细胞率降低;CD133+细胞在低氧的微环境中自噬的发生增加,活细胞率基本不变。     

人胶质瘤干细胞趋化因子受体CXCR4活化促进血管生成的作用

目的从人恶性胶质瘤细胞系U87中分离、培养和鉴定胶质瘤干细胞,观测其CXCR4表达情况及其活化后促血管生成因子分泌的变化。方法通过流式细胞术检测U87细胞中CD133阳性细胞的比例。使用CD133免疫磁珠分离试剂盒通过磁性细胞分选系统分离胶质瘤干细胞。采用间接免疫荧光标记、激光共聚焦扫描显微术观测胶质瘤干细胞中神经巢蛋白（nestin）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、趋化因子受体CXCR4的表达;以CXCR4配体刺激通过钙流试验检测受体功能,采用酶联免疫吸附试验（EIJSA）检测培养上清中血管内皮生长因子（VEGF）和白细胞介素-8（IL-8）的含量。建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察胶质瘤干细胞成瘤情况及瘤体内VEGF表达情况。结果U87细胞系中CD133阳性细胞的比例为0．5％,这些细胞具有干细胞增殖和生长特性;它们表达CXCR4,用其相应配体激活后导致胞内钙流增加、分泌VEGF和IL-8增多。与CD133阴性细胞相比,CD133阳性细胞在体外分泌VEGF、IL-8多,在体内成瘤率高,形成的移植瘤生长迅速,表达更多VEGF。结论人恶性胶质细胞瘤细胞系U87中含有极少量胶质瘤干细胞,表达功能性CXCR4、分泌更多促血管生成因子,提示这些干细胞也直接参与胶质瘤血管生成。     

Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24

Although flow cytometry is useful for studying neural lineage relationships, the method of dissociation can potentially bias cell analysis. We compared dissociation methods on viability and antigen recognition of mouse central nervous system (CNS) tissue and human CNS tumor tissue. Although nonenzymatic dissociation yielded poor viability, papain, purified trypsin replacement (TrypLE), and two purified collagenase/neutral protease cocktails (Liberase-1 or Accutase) each efficiently dissociated fetal tissue and postnatal tissue. Mouse cells dissociated with Liberase-1 were titrated with antibodies identifying distinct CNS precursor subtypes, including CD133, CD15, CD24, A2B5, and PSA-NCAM. Of the enzymes tested, papain most aggressively reduced antigenicity for mouse and human CD24. On human CNS tumor cells, CD133 expression remained highest after Liberase-1 and was lowest after papain or Accutase treatment; Liberase-1 digestion allowed magnetic sorting for CD133 without the need for an antigen re-expression recovery period. We conclude that Liberase-1 and TrypLE provide the best balance of dissociation efficiency, viability, and antigen retention. One implication of this comparison was confirmed by dissociating E13.5 mouse cortical cells and performing prospective isolation and clonal analysis on the basis of CD133/CD24 or CD15/CD24 expression. Highest fetal expression of CD133 or CD15 occurred in a CD24(hi) population that was enriched in neuronal progenitors. Multipotent cells expressed CD133 and CD15 at lower levels than did these neuronal progenitors. We conclude that CD133 and CD15 can be used similarly as selectable markers, but CD24 coexpression helps to distinguish fetal mouse multipotent stem cells from neuronal progenitors and postmitotic neurons. This particular discrimination is not possible after papain treatment. Disclosure of potential conflicts of interest is found at the end of this article.     

重楼皂苷Ⅰ抗肝癌细胞作用的初步研究

目的:本文旨在研究重楼皂苷Ⅰ对肝癌细胞株Huh7和HepG2的抑制作用并探讨其是否具有抑制肝癌干细胞的功效.方法:不同剂量的重楼皂苷Ⅰ处理肝癌细胞后,MTT方法检测细胞存活情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Transwell实验检测细胞迁移能力;磁珠分选出CD133+-Huh7和CD133--HepG2细胞后,成球实验...     

磁珠分选U251细胞系中的CD133+细胞及其生物学特性

背景：脑肿瘤干细胞理论认为,脑肿瘤干细胞是脑肿瘤细胞中“种子”细胞,是脑肿瘤发生、浸润和复发的关键细胞。 目的：观察人多形性胶质母细胞瘤U251细胞系中CD133⁺细胞的增殖、分化及体内致瘤性等生物学特性。 方法：运用磁珠分选技术分选U251细胞系中的CD133⁺和CD133^-细胞亚群;MTT法绘制两个亚群细胞的生长曲线;单克隆形成率实验检测2个亚群细胞的增殖能力;免疫荧光检测CD133⁺细胞亚群的多向分化能力;裸鼠移植实验检测2个亚群细胞在裸鼠体内致瘤性的差异。 结果与结论：U251细胞系中只有约4.5%的CD133⁺细胞;分选后的CD133⁺细胞能增殖形成典型的脑肿瘤干细胞球,生长曲线显示CD133⁺细胞增殖能力明显强于CD133^-细胞;单克隆形成率实验显示CD133⁺细胞能形成脑肿瘤干细胞球的细胞比率达到78.5%~92.4%,而CD133^-细胞仅有0.8%~2.4%;CD133⁺细胞能分化为具有GFAP和NeuN成熟表型的肿瘤细胞;CD133⁺的致瘤率为71.42%,而CD133^-细胞无致瘤性。提示U251细胞系中存在少量具有增殖、多向分化与体内致瘤能力的CD133⁺细胞,CD133⁺细胞是符合肿瘤干细胞定义的细胞亚群。     

增殖细胞核抗原反义寡核苷酸对人脐血CD34+细胞分化的影响

目的:研究增殖细胞核抗原反义寡核苷酸（PCNA-ASODN）对脐血造血干/祖细胞体外扩增的调节作用。 方法:采用免疫磁珠分离技术从新鲜脐带血中分离CD34+细胞，使用不同浓度的PCNA-ASODN作用于体外扩增的CD34+细胞，应用流式细胞技术检测各种细胞数量，细胞内PCNA表达及细胞周期。 结果:加入了PCNA-ASODN的两个实验组，其PCNA的表达率为（27.2±3.6）%和(19.0±1.5)%，低于对照组的（53.8±8.3）%（P<0.01）。低浓度组扩增的细胞中CD34+细胞比例为（33.4±3.2）％，显著高于对照组的（25.2±2.6）%（P<0.01），而且CD34+CD38-细胞数量达到（57.8±9.9）倍，也显著高于对照组的（43.5±7.4）倍(P<0.01)。 结论:低浓度的PCNA-ASODN有效抑制CD34+细胞在增殖过程中PCNA表达，减缓扩增过程中的分化作用，提高了早期祖细胞的扩增效率。     

免疫磁性活化细胞分选方法优化及纯化后细胞的生物学特性检测

目的:改良常规免疫磁性活化细胞分选(MACS)的分离纯化方法,提高分选后细胞的纯度并确保细胞仍具有良好活性及功能。方法:以干细胞抗原-1(Sca-1)标记的Sca-1+造血干/祖细胞(Sca-1+HSC/HPC)为例,分别用改良后和常规MACS法分选出小鼠骨髓细胞Sca-1+细胞,流式细胞术检测两种分选方法获得Sca-1+细胞纯度;计算阳性细胞回收率;台酚蓝染色检测分选细胞存活百分率;CCK-8检测细胞增殖,混合造血祖细胞(CFU-Mix)体外培养评价分选Sca-1+细胞分化能力。结果:改良MACS法分选获得的Sca-1+细胞纯度达93%以上(常规MACS法仅为87%),阳性细胞的回收率可达73%(常规法仅为62.3%);细胞存活率、细胞增殖和CFU-Mix集落形成能力两种分选方法无明显差别。结论:改良法能明显提高细胞分选纯度及回收率,细胞活性和功能保持良好,值得各种细胞免疫磁性分选参考采用。     

Erythropoiesis from Adult but not Fetal Blood-derived CD133+ Stem Cells Depends Strongly on Interleukin-3

We have shown previously that erythropoiesis in cultures from fetal blood depends less on interleukin-3 (IL3) than erythropoiesis from adult blood. This paper explores if this is due to different proportions of stem cell sub-populations with different IL3 requirement, or to different IL3 requirement on fetal and adult stem cells in general. The CD133 (AC133) antigen is found on half of all CD34+ cells with erythropoietic potential and is thought to mark a primitive stem cell sub-population. This work compares the IL3 requirements of CD133+ and CD133-CD34+ cells derived from fetal (12–20 weeks) and adult blood. Erythropoiesis was monitored using flow cytometry and colony counting. Erythropoiesis from adult CD133+ but not CD133-CD34+ cells was dramatically delayed (6–8 days) in the absence of IL3. In cultures from fetal blood, both CD133+ and CD133-CD34+ cells showed only a small dependency on IL3. The ratio of erythroid colony-forming CD133+ cells to erythroid colony-forming CD34+ cells was 0.5–0.6 in adult and 0.2–0.4 in fetal blood. The differential IL3 dependency of erythropoiesis from fetal and adult blood CD133+ and CD133-CD34+ stem cells may be relevant for the choice and preparation of stem cells for clinical purposes.