微小RNA-134-5p靶向作用于EGFR对卵巢癌SKOV3和A2780细胞生长的影响

目的 探讨微小RNA-134-5p(miR-134-5p)靶向作用于表皮生长因子受体(EGFR)基因对卵巢癌细胞生长的影响.方法 以卵巢癌细胞系SKOV3和A2780为研究对象,根据处理方法分为对照组(转染miR-NC)和实验组(转染miR-134-5p).采用qRT-PCR和Western blot检测EGFR基因及下游靶蛋白的表达量;流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡情况;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成实验检测卵巢癌细胞增殖能力.结果 实验组EGFR基因及下游靶蛋白表达显著下调,其中SKOV3细胞中EGFR mRNA下调至48％(P＜0.05),A2780细胞中EGFR mRNA下调至47％(P＜0.05).实验组细胞的细胞周期明显受到抑制(P＜0.05),miR-134-5p通过EGFR靶蛋白诱导细胞凋亡(P＜0.05).实验组细胞的增殖活性和集落形成能力明显受到抑制(P＜0.05).结论 miR-134-5p可通过靶向抑制EGFR基因,促进细胞周期停滞和细胞凋亡,降低卵巢癌细胞的增殖能力.     

沉默PARP-1对卵巢癌上皮细胞耐药性及肿瘤相关生物学行为的影响

目的 研究探讨沉默聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(PARP-1)后,卵巢癌上皮细胞对顺铂药物的敏感性及相关生物学行为的变化。 方法 以人卵巢癌细胞株A2780为研究对象,采用小RNA干扰技术,沉默PARP-1的表达后,采用Western blot实验、RT-PCR实验、MTT实验等观察PARP-1蛋白、mRNA的表达及细胞存活率的变化趋势,采用方差分析进行比较。 结果 PARP1小RNA干扰序列(PARP1-siRNA)转染组PARP-1 mRNA表达量明显低于A2780组和阴性对照组接种转染组(NC-siRNA),3组PARP-1 mRNA表达量分别为(45.22±3.99)%、(24.13±5.24)%、(46.28±6.19)%(P＜0.05);PARP1-siRNA转染组PARP-1蛋白表达IOD值明显低于A2780组和NC-siRNA转染组(P＜0.05);与0 μmol/L相比,5 μmol/L和10 μmol/L组的PARP-1蛋白表达IOD值明显降低(P＜0.05);随着顺铂浓度的增高,PARP1-siRNA转染组的细胞存活率下降的速度最快。 结论 PARP1-siRNA转染明显下调人卵巢癌细胞株A2780的PARP-1表达后,该细胞对顺铂药物的敏感性增强,细胞的存活率明显下降。      

WT1反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

[目的]研究WT1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。[方法]实验分4组:正常对照组(加入转染液)、反义组(脂质体+反义寡合苷酸转染)、正义组(脂质体+正义寡合苷酸转染)和脂质体组(只加入脂质体)。分组转染卵巢癌SKOV3细胞株后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR检测WT1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平。[结果]脂质体介导的WT1反义寡核苷酸转染明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率为49.48%,G0-G1期细胞分布率增加达(79.10±2.79)%,凋亡细胞群明显增多,凋亡率为(13.18±2.00)%,同时转染后细胞WT1 mRNA及蛋白表达水平下降,与对照组及其他各组相比较差异均有显著性意义(P<0.05)。[结论]WT1反义核酸能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。WT1反义核酸用于卵巢癌的基因治疗具有一定的潜在意义。     

survivin反义寡核苷酸转染对人乳腺癌细胞系MCF 7生长及对长春瑞滨的增敏作用

目的探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌细胞系MCF 7的诱导凋亡、抑制增殖和对长春瑞滨的增敏作用。方法采用脂质体介导survivin ASODN转染乳腺癌细胞系MCF 7,半定量RT PCR方法检测survivin基因mRNA表达,Western blot方法检测survivin基因蛋白表达,AnnexinⅤ/PI双染法通过流式细胞仪检测细胞凋亡率变化,PI染色通过流式细胞仪检测细胞周期时相变化,MTT比色法检测转染细胞的生长抑制情况及对长春瑞滨的敏感性,电镜观察反义转染对乳腺癌细胞系MCF 7的凋亡诱导作用。结果survivin反义复合物下调MCF 7细胞的survivin mRNA和蛋白表达,并呈剂量依赖性。细胞周期被阻滞于G2/M期,细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）,反义组细胞生长抑制率明显上升（P＜0.05）。透射电镜下转染组细胞呈凋亡晚期变化。600?nmol/L反义转染组长春瑞滨的IC50值为(3.7±0.42)μg/mL,正常组为(7.1±0.68)μg/mL,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论survivin反义寡核酸可有效下调MCF 7的survivin mRNA及蛋白表达水平,抑制增殖,诱导凋亡,并增强其对化疗药物长春瑞滨的敏感性。     

靶向Dicer的RNA干扰对卵巢癌细胞生物学功能的影响

目的探讨Dicer抑制对卵巢癌细胞A2780增殖和迁移能力的影响,以进一步明确Dicer在卵巢癌生物学行为中的作用。方法合成Dicer的小干扰RNA(Dicer siRNA)转染A2780细胞并筛选有效siRNA,实时定量PCR(RT-PCR)检测Dicer的mRNA的表达,蛋白印迹法检测Dicer蛋白的表达,MTT检测细胞生长活力,Transwell小室检测细胞迁移能力,流式细胞仪测定细胞周期。结果与未转染组相比,siRNA1658转染组Dicer基因mRNA的表达最低,为(0.194±0.002),明显低于siRNA1897转染组的(0.535±0.015),差异有统计学意义(P0.001),但与siRNA334组的(0.251±0.014)相比,差异无统计学意义(P0.05)。实时定量PCR结果显示,以未转染A2780细胞Dicer mRNA表达水平为100%,si Dicer-A2780细胞Dicer的mRNA水平相对下降(0.157±0.012),差异有统计学意义(P0.001)。以未转染A2780细胞Dicer的蛋白表达水平为100%,si Dicer-A2780细胞Dicer的蛋白水平相对下降(0.153±0.021),差异有统计学意义(P0.001)。在种板后第3天、第4天、第5天,与对照组细胞比较,si Dicer转染的A2780细胞增殖能力增强(P均0.05)。与对照组转染si NC的细胞相比,转染si Dicer 96 h后,si Dicer-A2780细胞的增殖活性平均上升了23%。细胞周期分析结果显示si Dicer-A2780细胞中G0/G1期占(44.26±0.48)%,S期占(25.05±1.20)%,G2/M期占(21.53±0.77)%;对照组si NC-A2780细胞中G0/G1期占(52.79±1.11)%,S期占(20.01±1.22)%,G2/M期占(19.80±0.24)%。si Dicer-A2780细胞S期和G2/M细胞较对照组明显增加(P均0.05),而G0/G1期细胞则减少(P0.001)。与对照组si NC-A2780细胞的穿膜细胞数相比,抑制Dicer表达的si Dicer-A2780细胞的穿膜细胞数增加(3.99±0.29)倍(P0.001)。结论 Dicer基因具有抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭的能力。     

Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞株中survivin和SMAC/DIABLO基因表达的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3中survivin、Smac/DIABLO表达的影响,探讨survivin、Smac/DIABLO在ASODN诱导卵巢癌细胞凋亡和细胞周期改变中的作用和分子机制.方法 用脂质体(LipofectamineTM 2000)介导survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,用MTT比色法检测细胞生长活性,流式细胞学技术检测细胞凋亡指数、细胞周期分布及survivin、Smac蛋白表达改变,逆转录酶链反应检测survivin、Smac/DIABLO基因表达改变.结果 同对照组比较,不同浓度ASODN作用后细胞生长明显减慢,转染后48 h IC50在600 nmol/1左右.用600 nmol/LASODN转染48h后,细胞凋亡指数(AI)明显增加,(t=6.3671,P＜0.05);更多的细胞停留在G0/G1期(t=10.3832,P＜0.01).Survivin mRNA和蛋白表达明显下调(t=3.5031,P＜0.05,t=7.8146,P＜0.01),SmacmRNA和蛋白表达上调(t=2.8011,P＜0.05,t=11.3917,P＜0.01).结论 ASODN诱导细胞凋亡,使更多的细胞停留在G0/G1期,减少进入有丝分裂细胞数的作用,是通过下调survivin基因,上调Smac基因表达来共同完成的,survivin、Smac/DIABLO基因在调节SKOV3细胞周期、凋亡的功能上密切相关,二者的相互作用是卵巢癌发生、发展的重要分子机制之一.     

MnSOD基因转染对SGC79001胃癌细胞增殖的影响

目的观察改变胞内MnSOD基因表达水平对SGC7901胃癌细胞增殖的影响。方法采用电穿孔方法将反义和正义MnSOD cDNA真核表达载体pHβA-SOD(-)／pHβA-SOD( )转染SGC7901胃癌细胞，400mg／LG418筛选稳定表达克隆并用RT-PCR及Western杂交法鉴定后扩大培养。用pHβA空质粒转染作为对照。放射免疫法检测正义、反义及空载SGC7901胃癌细胞株内的铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD，SOD1)蛋白含量。分别用直接细胞计数法、四唑蓝(MTT)比色法、平皿克隆形成率试验及裸鼠移植瘤模型测定3组细胞在体外、体内的增殖活性。结果与空载组(Vector-7901)相比，转染正义质粒的MnSOD-7901胃癌细胞呈现抑增殖效应：(1)生长曲线示增殖速度减慢；(2)在平皿上的集落形成能力下降；(3)在裸鼠体内的成瘤性明显受抑制。转染反义质粒的MnSOD-AS7901胃癌细胞则出现促增殖效应：(1)生长曲线示增殖速度加快；(2)在平皿上的集落形成率上升；(3)裸鼠移植瘤生长加速。结论通过基因转染提高胞内MnSOD的表达可抑制胃癌细胞的增殖，MnSOD可能是胃癌基因治疗的一个新靶点。     

舒马曲坦诱发大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖作用及机制

目的:研究舒马曲坦诱发大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的作用及其细胞内信号转导通路机制。方法:应用细胞培养、基因转染等方法,通过MTT及流式细胞仪等检测舒马曲坦及ERK1/2的反义寡核苷酸对肺动脉平滑肌细胞增殖及细胞周期的影响。结果:舒马曲坦明显促进肺动脉平滑肌细胞的增殖。脂质体成功介导了寡核苷酸在肺动脉平滑肌细胞的转染。反义寡核苷酸明显抑制舒马曲坦诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖,增殖率由(164.67±6.67)%降至(76.67±10.17)%,SPF指数由(11.67±0.33)%降至(3.33±0.33)%,增殖指数由(27.33±0.33)%降至(22.00±0.58)%(P均<0.01),正义和随机寡核苷酸对舒马曲坦诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖则无抑制作用。结论:舒马曲坦通过5-HT1B受体促进大鼠肺动脉平滑肌细胞的有丝分裂,其细胞内信号转导途径为ERK1/2 MAPK通路。     

白藜芦醇下调ILK/β-catenin信号通路抑制卵巢癌细胞增殖的机制研究

目的:探讨白藜芦醇对卵巢癌A2780细胞生长、增殖的影响,并探讨其可能机制.方法:体外培养人卵巢腺癌A2780细胞,用不同浓度(50、100、200、400 μnol/L)白藜芦醇作用A2780细胞不同时间(24、48和72 h).采用M'TTT法检测白藜芦醇对细胞增殖活力的影响,采用流式细胞术检测白藜芦醇对细胞周期的改变情况,采用Western blot检测细胞内整合素蛋白激酶(integrin-linked kinase,ILK)、β-连环蛋白(β-catenin)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)蛋白水平的表达.结果:200 μmol/L的白藜芦醇作用24 h可有效抑制A2780细胞增殖,使其阻滞于G0/G1期,并且存在显著的剂量-时间依赖性(P＜0.05);结果还显示白藜芦醇能够显著抑制卵巢癌A2780细胞内ILK、β-catenin和Cyclin D1蛋白表达水平(P＜0.05),且存在浓度-时间依赖性(P＜0.05).结论:白藜芦醇可通过抑制卵巢癌A2780细胞中ILK/β-catenin信号通路,并降低下游靶蛋白Cyclin D1的表达,从而抑制卵巢癌细胞增殖.     

超声联合紫杉醇微泡对卵巢癌细胞株A2780/DDP增殖和凋亡的影响

目的：探讨超声联合紫杉醇微泡对人卵巢癌细胞A2780/DDP细胞的增殖和凋亡的影响。方法：将人卵巢癌细胞株A2780/DDP随机分为5组：对照组、紫杉醇组、紫杉醇+超声组、紫杉醇微泡组和紫杉醇微泡+超声组。采用噻唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测作用24、48 h和72 h后卵巢癌细胞的增殖活性,并用Hochst 33258和TUNEL染色法检测细胞凋亡情况。结果：MTT法检测显示紫杉醇微泡+超声组24、48 h和72 h抑制率分别为（37.20±2.01）%、（51.60±2.10）%和 （57.47±2.85）%,明显高于其他各处理组（P＜0.05）;Hochst 33258和TUNEL染色均显示紫杉醇微泡+超声组凋亡率最高,作用24 h后的凋亡率为(46.10±4.15)%,明显高于其余各组（P＜0.05）。结论：超声联合紫杉醇微泡能明显抑制人卵巢癌细胞A2780/DDP的增殖和诱导其凋亡。