亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体

目的：纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体，建立稳定、适于生产应用的纯化工艺。方法：以原核表达的重组人源性抗HBs scFv免疫BALB／c小鼠，经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株14F7。将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水，经辛酸沉淀纯化后，制备亲和层析柱。纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体。结果：用抗scFv mAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAg Fab的纯度可达95％以上，回收率可达70％～85％。结论：人源性抗HBs scFv制备mAb作为亲和层析的介质，可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAg Fab，适用于大规模生产重组人源性抗HBsAg Fab。     

基因工程技术制备人源抗HBsAg抗体Fab片段

将从抗体文库中筛选出的抗HBsAg Fab阳性克隆转化大肠肝杆菌 ,IPTG诱导表达 ,经Western blot鉴定 ,证实上清中含有可溶性抗HBsAg Fab片段 ,应用自制的羊抗人免疫球蛋白片段抗体 (anti Fab )与Gama bind交联制备的亲和层析柱纯化表达产物 ,所得纯化产物在SDS PAGE中形成单一条带 ,经Western blot证实具备良好抗原特异性 ,Dot blot证实具备良好抗原结合活性。     

生物工程技术制备人源抗-HBs Fab 片段

目的：用生物工程技术制备人源性抗-HBsFab。方法：将从抗体文库中筛选出的人源抗-HBsFab基因克隆入pBAD/gⅢA载体，进而转化Tpo10大肠杆菌，对重组质粒菌发酵表达后，利用Ni-NTA-Agarose螯合层析柱纯化周质腔可溶性Fab蛋白。对所得包涵体依次变性，溶解，纯化后，利用透析进行复性，用Western blot检测Fab蛋白的特异性，Dot blot测定其生物学活性。结果：经Ni-NTA-Agarose柱纯化的周质腔可溶性Fab蛋白，有较好的生物学活性，并且总量达到80mg/L。对所获包涵体进行透析复性后，也可得到少量有活性的蛋白，但比例很小。结论；用pBAD/gⅢA-Top10表达系统表达人源抗-HBsFab片段，发酵培养后，经有效纯化可得到生物学活性较好的可溶性蛋白。为人源抗-HBsFab片段的大量制备提供了有效手段。     

一株人源性抗HBsAg抗体Fab片段的筛选及序列分析

一株人源性抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段的筛选及序列分析高辉高磊纪宗玲路凡陈南春陈苏民余宙耀张宜俊尤玉琴粟宽源（第四军医大学生物化学教研室，西安７１００３１空军广州医院全军肝病中心）乙型肝炎是我国常见的传染性疾病，目前尚无特效的治疗手段。研究发...     

人源抗-HBs Fab优化表达条件的初步探讨

目的：利用含重组质粒pBAD/HBs Fab的Top10大肠杆菌，优化表达人源抗－HBs Fab。方法：选取含pBAD/HBs Fab载体的Top10大肠杆菌单个克隆分级培养，将制备的二级种子液接种于摇瓶和KLF2000发酵罐中，摇瓶培养表达采用不同的菌体诱导起始密度、诱导剂浓度、诱导表达温度和诱导表达时间。发酵罐培养表达采用不同的培养基和菌体诱导起始密度。诱导表达完毕后，纯化蛋白，比较表达量，并鉴定所获蛋白的抗原性和生物学活性。结果：用摇瓶优化表达后，Fab蛋白占菌体总蛋白的6％，为0.8%mg/g菌体，利用发酵培养可进一步增加菌量，使蛋白表达量达80mg/L。所获蛋白经鉴定显示有较好的生物学活性。结论：用重组质粒pBAD/HBsFab,Top10表达系统，可得到80mg/L的具有较好生物学活性的人源抗－HBs Fab蛋白，为批量生产作了准备。     

人源抗NH-LBP Fab抗体的制备和初步鉴定

目的：构建人源抗脂多糖结合蛋白氨基端片段（NH-LBP）Fab抗体的原核表达载体, 并制备高稳定性Fab抗体.方法：用PCR方法, 从可溶性表达抗NH-LBP抗体的重组质粒pComb3H-Fab中扩增出VH链和VL链基因序列, 分别构建表达质粒pET-28a（＋）-VH和pET-28a（＋）-VL, 并于工程菌BL21（DE3）star中分别表达及TALON柱芯亲和纯化, 将抗体片段VH和VL共同复性, 通过二硫键形成Fab抗体, 再采用ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力.结果：扩增出VL链和VH基因片段长约为650 bp和700 bp, 经BL21star表达出相对分子质量（Mr）约为28　000和30　000的目的蛋白, 共同折叠后所获得Fab抗体与NH-LBP具有较高的结合力.结论：成功地制备抗NH-LBP Fab抗体, 为临床抗炎研究提供了条件.     

人源化抗 Siglec-9 抗体 Fab 片段的制备及鉴定

目的:构建人源化抗Siglec-9 抗体Fab 段原核表达质粒,表达、纯化此抗体以及特性分析,并初步探讨此抗体 的生物学功能。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)分别获得抗体轻链和重链的可变区及恒定区,经重叠延伸PCR 连接,酶切 后与原核表达载体pETDUET-1 重组,转入表达感受态Escherichia coli BL21 中,通过蛋白纯化系统AKTA 和His-trap Lambda Fab 纯化。使用SDS-PAGE、ELISA 以及Western blot 鉴定和分析。采用实时荧光定量PCR 初步检测抗Siglec-9 抗体Fab 段对 炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 的mRNA 表达量的影响。结果:成功获得抗体轻链和重链,构建人源化抗Siglec-9 抗体 Fab 段原核表达系统,经SDS-PAGE、Western blot、ELISA 检测证实抗Siglec-9 抗体Fab 段与Siglec-9 抗原特异性结合。抗 Siglec-9 抗体Fab 段可抑制炎性细胞因子TNF鄄琢、IL-1、IL-6、IL-8 的mRNA 表达量。结论:人源化抗Siglec-9 抗体Fab 段进行了 原核系统表达、纯化和鉴定,并初步验证可抑制炎性细胞因子的mRNA 表达量,为进一步研究该抗体的生物学特性及应用奠 定基础。     

工程化人源性抗-HBs Fab片段抗原结合位点的研究

取自己制备的纯化人源性抗 HBs Fab 片段。用表达的PreS, PreS1, PreS2 蛋白及合成的PreS1 (21 47aa)27 肽检测其抗原结合位点。结果显示该Fab 片段在非还原状态下分子量约为54kD, 在还原状态下分解为大小两个片段, 大片段为Fab的Fd 链, 分子量约为28kD; 小片段为Fab 的κ链, 分子量约为26kD。该Fab 片段与PreS及PreS1 蛋白呈现结合反应, 说明其抗原结合位点位于HBsAg 的PreS1 区     

PBAD表达系统对抗-HBs Fab抗体表达的影响

目的研究PBADP替换Plac的原核表达系统对重组抗-HBs Fabs的表达效率、产量及其抗体活性的影响。方法通过Western blot、抗体不同稀释度的Dot blot和抗原特异性结合实验，对两种表达系统进行比较。结果在PBAD控制下表达的抗．HBs Fabs与Plac控制下的相比，Western blot显示两种表达系统都能完整表达抗-HBs Fab抗体，Mr为50000。PBAD表达系统表达的抗-HBs Fabs多以可溶形式存在于周质腔中，而Plac表达系统表达的抗-HBs Fabs更多的释放入培养上清液。抗体不同稀释度的Dot blot结果显示pBAD-抗HBs Fab表达系统表达的抗体效价较pComb3-抗HBs Fad高，乙型肝炎表面抗原特异性结合实验证实两种表达系统表达的抗体的抗原结合活性无明显差别。结论PBAD表达系统明显提高了抗-HBs Fab的表达量并保持了原抗体活性。     

大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选

目的构建大容量人源Fab噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,插入噬菌体载体pCANTAB5H中,构建人源Fab噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,随机挑取96个单克隆进行phage-ELISA鉴定,筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为5×1010的噬菌体抗体库,从中筛选到11株阳性克隆,对其进行测序鉴定,表明该11株克隆的序列均一致,ELISA证实其对抗原CD276具有较强的结合性。结论构建了大容量人源Fab抗体库,从中获得具有抗CD276的人源Fab抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。     

抗人IgGFc和Fab单克隆抗体的鉴定及应用

本文将采用木瓜蛋白酶水解和ＳＰＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ柱亲和层析等手段获得的人ＩｇＧＦｃ和Ｆａｂ，以抗人ＩｇＧＦｃ和抗人ＩｇＧＦａｂ单抗为参比品（Ｓｉｇｍａ）．鉴定了细胞库中抗人ＩｇＧ系列的部分细胞林，得到分泌特异性抗人ＩｇＧＦｅ和抗人ＩｇＧＦａｂ单抗的细胞各一株。在此基础上。应用抗人ＩｇＧＦｃ及抗人ＩｇＧＦａｂ单抗分别制备了Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析柱，纯化了酶解的人ＩｇＧＦｃ和Ｆａｂ。经ＥＬＩＳＡ法鉴定，相互间无交叉反应。同时用此方法还制备了人抗ＨＢｅＦａｂ，并将此Ｆａｂ标记过氧化物酶。配制ＨＢｅＥＬＩＳＡ诊断盒，证明其生物学活性未受影响，而且消除了类风湿因子引起的ＨＢｅＡｇ假阳性现象。     

金属螯合亲和层析法对抗HBs Fab段的纯化

为了对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行简便有效的纯化，在Ｆａｂ段表达载体上插入了一段编码６个组氨酸的ＤＮＡ片段，使所表达的Ｆａｂ段在Ｆｄ段的羧基端带有６个连续的组氨酸，通过锌离子金属螯合亲和层析法对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行纯化，利用不同ｐＨ梯度缓冲液洗脱，一步即可达到９５％以上纯度的纯化，为基因工程抗体的制备开发提供了有效手段。     

小鼠抗—HBs的单克隆抗独特型抗体杂交瘤细胞系的建立及鉴定

用纯化的小鼠单克隆抗-HBs(Ab1)免疫同系BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓细胞融合,获得两株(MA1、MA3)持续分泌抗-HBs的单克隆抗独特型抗体(抗-1d,Ab2)杂交瘤细胞系。对MA3做了较全面的鉴定。MA3的Ig类型为IgM,核型分析结果染色体数为106条。通过ELISA竞争抑制和中和抑制试验表明,MA3所分泌的Ab2既能被不同来源的抗-HBs所中和,又能被HBsAg所竞争,且都呈现剂量依赖关系。将纯化的MA3 IgM免疫同系小鼠,诱导出具有抗-HBs活性的抗-抗-独特型抗体(Ab3)。因此认为MA3所分泌单克隆抗体(McAb),可模似HBsAg,具有类似HBsAg的免疫原性,是一种带有HBsAg表位内影像的抗-HBs的单克隆抗-1d。     

人源性抗HBs可变区单链抗体基因的构建及核酸序列测定

将通过噬菌体显示技术获得的一株人源性抗HBs Fab抗体基因重链和k轻链的可变区用编码柔性肽的Linker使其连接成单链,克隆入中间载体,并进行核酸序列测定,为其后的表达及双功能抗体的构建打下基础。     

人源性抗HBsAg单克隆抗体Fab片段的表达与纯化

对已筛选到的人源性抗ＨＢｓＡｇ特异性噬菌体抗体基因文库进行表达研究，将特异性噬粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，反复冻溶法制备可溶性Ｆａｂ片段。免疫印迹实验表明大肠杆菌质周腔内有可溶性Ｆａｂ片段的表达。制备羊抗人ＩｇＧ Ｆａｂ抗血清，建立抗人ＩｇＧ Ｆａｂ抗体－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和层析柱，纯化Ｆａｂ片段。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示纯化的Ｆａｂ达免疫纯，点印迹法表达纯化后的Ｆａｂ片段具有中和ＨＢｓＡ     

抗人CD3单链抗体的构建、表达及纯化

采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从鼠抗人CD3杂交瘤细胞WuT3中扩增克隆出抗体重、轻链可变区基因,测序结果证实:V_H属鼠抗体重链可变区亚组Ⅱ(β)、V_L属鼠抗体Kappa轻链可变区亚组Ⅵ.将V_H、V_L基因片段克隆到单链抗体表达载体POPE51中,使V_H、V_L基因片段分别直接与一多肽连接子的两端相连,构建成单链抗体(ScFv)基因.克隆筛选证明,阳性克隆近100%.细菌用20μmol/L IPTG诱导培养,经固定金属离子亲和层析和分子筛凝胶过滤,从细胞间质中提取纯化ScFv,每升培养液可获得5mg纯度大于90%的ScFv.FACS活性检测结果表明,纯化的WuT3 ScFv与亲代结果一致.     

人源抗HBs基因工程抗体在E. coli中的高效表达与折叠研究

目的 高效表达是基因工程抗体走向临床的关键问题之一.本试验旨在研究人源抗HBs基因工程抗体在E. coli中的高效表达与折叠.方法 本实验将抗HBsAg抗体的轻链(L)和重链Fd段基因,分别克隆于pET20b质粒中并分别转化到大肠肝菌BL21(DE3),IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在Mr27 000(L)和Mr25 000(Fd)处有外源蛋白表达,表达蛋白含量分别为53%和48%.L链和Fd 包涵体蛋白经盐酸胍变性后,等量混合于折叠液中.结果 L和Fd可复性形成了Mr约50 000的蛋白,ELISA结果表明,复性蛋白具有与HBsAg结合的能力.结论 抗HBsAg抗体Fab段在大肠杆菌中的表达与复性的成功,表明包涵体表达基因工程抗体在技术是可行的.