PAX3—FKHR转染对横纹肌肉瘤RD细胞分化及MRF表达的影响

背景与目的：研究报道融合基因PAX3-FKHR与腺泡型横纹肌肉瘤的发生有着密切的关系,但它对生肌调节因子的作用还不清楚。本研究拟探讨融合基因PAX3-FKHR对胚胎型横纹肌肉瘤细胞分化及MRF4表达的影响。方法：构建PAX3-FKHR的真核表达质粒,采用脂质体法将MRF4\PAX3-FKHR先后转染入人胚胎型横纹肌肉瘤RD细胞,观察脂质体法将MRF4、PAX3-FKHR先后转染入人胚胎型横纹肌肉瘤RD细胞,观察转染前后RD细胞生物学特性、形态学改变以及肌分化标志蛋白MHC、α-actin的表达。结果：RD细胞在转染PAX3-FKHR后细胞的生长速度、生长方式及MHC、α-actin的表达均无显著的变化;在表达MRF4的RD细胞中转入PAX3-FKHR后,细胞MRF4表达无明显变化,细胞形态向低分化方向变化,细胞MHC和α-actin表达显著下降。结论：融合基因PAX3-FKHR转染对培养RD细胞的生物学特性及分化无明显影响,并不影响MRF4的表达,但可逆转MRF4促RD细胞分化的作用。     

PAX3-FKHR转染对横纹肌肉瘤RD细胞分化及MRF4表达的影响

背景与目的:研究报道融合基因 PAX3-FKHR与腺泡型横纹肌肉瘤的发生有着密切的关系 , 但它对生肌调节因子的作用还不清楚 . 本研究拟探讨融合基因 PAX3-FKHR对胚胎型横纹肌肉瘤细胞分化及 MRF4表达的影响 . 方法:构建 PAX3-FKHR的真核表达质粒 , 采用脂质体法将 MRF4、 PAX3-FKHR先后转染入人胚胎型横纹肌肉瘤 RD细胞 , 观察转染前后 RD细胞生物学特性、形态学改变以及肌分化标志蛋白 MHC、α -actin的表达 . 结果:RD细胞在转染 PAX3-FKHR后细胞的生长速度、生长方式及 MHC、α -actin的表达均无显著的变化 ; 在表达 MRF4的 RD细胞中转入 PAX3-FKHR后 , 细胞 MRF4表达无明显变化 , 细胞形态向低分化方向变化 , 细胞 MHC和α -actin表达显著下降 . 结论:融合基因 PAX3-FKHR转染对培养 RD细胞的生物学特性及分化无明显影响 , 并不影响 MRF4的表达 , 但可逆转 MRF4促 RD细胞分化的作用 .     

MyoD转染对横纹肌肉瘤RD细胞分化及生肌调节因子表达的影响

目的：观察MyoD转染后对人横纹肌肉瘤RD细胞分化及生肌调节因子MRF4表达的影响。方法：利用脂质体法将MyoD转染培养中人横纹肌肉瘤RD细胞，原位杂交检测MyoD,MRF4mRNA的表达，观察细胞形态，生长速度变化，免疫细胞化学检测横纹肌肌球蛋白重链及肌动蛋白α-actin表达。结果：转染后RD细胞形态向高分化方向变化，生长受抑制；MyoD,MRF4表达明显增加；细胞肌球蛋白重链和肌动蛋白α-actin表达显著增强。结论：MyoD具有促进RD细胞分化的作用，并可激活另一生肌调节因子MRF4的表达。     

转化生长因子-β1在人横纹肌肉瘤肌源性分化中的作用

目的:探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)在横纹肌肉瘤肌源性分化中的作用.方法:采用细胞培养、逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)及免疫荧光染色观察TGF-β1对横纹肌肉瘤细胞系RD肌源性分化相关指标的影响,并用免疫组化SP法,检测49例横纹肌肉瘤组织中TGF-β1表达与肌球蛋白重链(MyHC)之间的相关性.结果:TGF-β1可明显抑制RD细胞肌球蛋白重链mRNA和蛋白的表达.用TGF-β1处理RD细胞后,肌球蛋白重链和肌节肌动蛋白(Sarcomeric-Actin)阳性着色细胞数明显下降(P<0.05).MyoD1的表达在处理前后未见明显差异.横纹肌肉瘤组织中TGF-β1表达与肌球蛋白重链呈明显负相关(P<0.05).结论:TGF-β1可抑制RD细胞的肌源性分化,这一作用可能不依赖于MyoD1的调节.TGF-β1信号传导通路可能与横纹肌肉瘤的肌源性分化受阻有关.     

转化生长因子-茁1在人横纹肌肉瘤肌源性分化中的作用

目的:探讨转化生长因子-茁1(TGF-茁1)在横纹肌肉瘤肌源性分化中的作用。方法:采用细胞培养、逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)及免疫荧光染色观察TGF-茁1对横纹肌肉瘤细胞系RD肌源性分化相关指标的影响,并用免疫组化SP法,检测49例横纹肌肉瘤组织中TGF-茁1表达与肌球蛋白重链(MyHC)之间的相关性。结果:TGF-茁1可明显抑制RD细胞肌球蛋白重链mRNA和蛋白的表达。用TGF-茁1处理RD细胞后,肌球蛋白重链和肌节肌动蛋白(Sarcomeric-Actin)阳性着色细胞数明显下降(P<0.05)。MyoD1的表达在处理前后未见明显差异。横纹肌肉瘤组织中TGF-茁1表达与肌球蛋白重链呈明显负相关(P<0.05)。结论:TGF-茁1可抑制RD细胞的肌源性分化,这一作用可能不依赖于MyoD1的调节。TGF-茁1信号传导通路可能与横纹肌肉瘤的肌源性分化受阻有关。     

利用比较基因组杂交技术分析腺泡状横纹肌肉瘤染色体的变化特征

目的 探讨腺泡状横纹肌肉瘤(ARMS)基因组DNA的变化特征.方法 采用一步法逆转录聚合酶链反应,检测10例原发性ARMS患者标本中PAX3-FKHR和PAX7-FKHR融合基因的mRNA表达.采用比较基因组杂交(CGH)技术,分析ARMS染色体基因组的变化特征.根据融合基因的表达情况以及患者的临床病理特征进行分组比较.同时收集ARMS细胞株A204作为对照.结果 10例原发性ARMS患者标本中,PAX3-FKHR融合基因表达6例,PAX7-FKHR融合基因表达2例,2例未检测到融合基因表达.CGH分析结果 显示,10例ARMS标本中,基因组DNA扩增频率最高的染色体臂为12q,占70.0%;其他依次为2p、6p、6q、10q、2q、4q、15q、1p、9q、14q和18q,均≥30.0%;其中常见的最小重叠扩增区段为12q13、2p24、6p21和2q31.基因组DNA缺失频率最高的染色体臂是3p、6p、20q和21q,均>30.0%;缺失部位比较分散,最小重叠缺失区段无集中趋势.伴有融合基因表达的8例ARMS标本中,基因组DNA扩增频率最高的染色体臂是12q,占87.5%;其他依次为10q、2p、2q、6p、6q、1p、4q、8q、11q、14q和15q,均>30.0%.基因组DNA缺失频率最高的染色体臂是3p、5q、6p、1q、8p、11p、20q和21q,均>30.0%.ARMS的染色体改变与组织学分级、临床分期、年龄和性别均无关(均P>0.05).结论 12q、2p、6p、6q、10q、2q、4q、15q、1p、9q、14q和18q的扩增以及3p、6p、20q和21q的缺失可能与ARMS的发病相关,12q的扩增还可能与PAX3-FKHR和PAX7-FKHR融合基因的表达相关.     

三氧化二砷诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对EWS—FLil融合蛋白的影响

目的：探讨三氧化二砷（Arsenic trioxide，As2O3）诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对融合蛋白EWS—FLi1表达的影响，．方法：应用噻唑蓝（MTF）法、形态学观察、原位末端标记法（TUNEL）、流式细胞术（FCM）观察As2O3对体外生长的尤文肉瘤RD—ES细胞系生物行为的影响：应用半定量RT—PCR测定应用As2O3前后c—mye基因mRNA水平的变化；应用免疫细胞化学及固定化蛋白印迹法（Western blot）观察用药前后EWS—FLi1融合蛋白表达水平的变化、结果：As2O3对体外生长的RD—ES细胞系具有明显抑制作用，并可诱导细胞凋亡、c-mye基因mRNA表达水平和EWS—FLil融合蛋白表达量随As2O3作用时间延长逐渐降低结论：常规治疗浓度的As2O3对体外生长的尤文肉瘤细胞具有明显的杀伤作用，其作用机制与改变线粒体膜通透性和抑制EWS—Flil融合蛋白、降低c一myc基因表达有关。     

小鼠α1,3-半乳糖糖基化修饰对人肝癌HuH7细胞生物学特性的影响

目的：探讨利用小鼠α1,3半乳糖基转移酶基因进行肝癌基因治疗的可行性。方法：将pcDNA3.1-α1,3GT真核表达载体以脂质体介导法转染人肝癌细胞HuH7,经G418压力筛选出稳定表达的阳性克隆,经生长曲线法,平板克隆形成试验,流式细胞仪等试验分析稳定表达株相关生物学特性变化。结果：转染有α1,3GT的HuH7经RT-PCR法检测到有α1,3GT的表达,免疫荧光镜检测其细胞表面有明显的Galα（1,3）Gal糖表位表达,转染细胞的增殖能力明显降低,同时促进细胞凋亡。结论：转染α1,3-半乳糖基转移酶基因可明显抑制人肝癌细胞HuH7的恶性生物学行为,具有潜在的临床应用价值。     

粘液样/圆细胞型脂肪肉瘤石蜡包埋组织中FUS-CHOP融合基因的检测

目的:探讨逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法用于检测甲醛固定、石蜡包埋组织中FUS-CHOP融合基因的可行性及其对粘液样/圆细胞型脂肪肉瘤诊断的价值.方法:收集粘液样/圆细胞型脂肪肉瘤石蜡包埋组织标本25例,以其它类型脂肪肉瘤(包括分化良好型、去分化型、多形型),滑膜肉瘤,低度恶性纤维肉瘤,恶性纤维组织细胞瘤,粘液脂肪瘤,脂肪母细胞瘤,神经鞘瘤伴粘液变性和粘液软骨肉瘤作为阴性对照,共18例.所有标本均经过甲醛固定、石蜡包埋.用嵌套式RT-PCR的方法检测FUS-CHOP融合基因mRNA并经测序证实,以β-actin基因作为内对照检测mRNA质量.结果:43例标本中,30例可检出β-actin,阳性率为69.8%,其中粘液样/圆细胞型脂肪肉瘤标本β-actin阳性18例(72%),对照组β-actin阳性12例(66.7%).25例粘液/圆细胞型脂肪肉瘤中15例检出Ⅱ型FUS-CHOP融合基因表达,阳性率60%(15/25),去除β-actin阴性病例的阳性率为77.8%(14/18).其中1例β-actin阴性表达而检出FUS-CHOP融合基因.对照组18例标本均未检出FUS-CHOP融合基因.结论:FUS-CHOP融合基因在粘液样/圆细胞型脂肪肉中呈特异性表达,可作为该肿瘤的特异性标志物用于诊断.嵌套式RT-PCR的方法可用于甲醛固定、石蜡包埋组织中FUS-CHOPmRNA的检测.     

PPARα配体对肌细胞的毒性作用研究

背景与目的： 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptor α, PPARα)配体类降脂药物对人骨骼肌细胞的影响。 材料与方法： WST-1法测定苯扎贝特及与阿托伐他汀联合应用时对人横纹肌肉瘤(RD)细胞的毒性作用;全自动生化分析仪测定不同浓度的苯扎贝特及与阿托伐他汀联合作用RD细胞,细胞中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性;Hoechest 33342染色法观察细胞凋亡的形态学改变。 结果： 苯扎贝特明显抑制RD细胞生长,明显降低CK活性,并引起细胞凋亡的典型变化,呈剂量-效应和时间-效应关系,与阿托伐他汀联合应用时对RD细胞的作用增强。 结论： 苯扎贝特作为PPARα配体对RD细胞具有明显的细胞毒性作用,与他汀类合用时细胞毒性增强。     

PEA-15真核表达载体的构建及表达

目的构建PEA-15真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15,并在人类食管癌细胞（EC-109）中表达。探讨PEA-15对EC．109细胞的影响。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达。构建重组真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中。采用RT—PCR、Westernblot法检测基因及蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率。结果RT—PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达。PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15构建成功。转染后的细胞中PEA-15表达均增加（t值分别为4．078、5．269,均P〈0．05）。转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[（7．12±0．86）％、（12．55±1．78）％,t=6．163,P〈0．05]。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．I-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生。     

抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体的构建

目的 在哺乳动物细胞中构建并鉴定抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体.方法 根据CDC25A的基因序列,设计特异性的siRNA,将合成的siRNA 核酸片段退火形成双链后连接到经Bam HI和HindⅢ双酶切后的psilencer4.1真核表达载体,命名为psilencer4.1-CDC25A以及psilencer4.1-Control,并进行酶切及测序鉴定.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建出抑制CDC25A表达的siRNA载体及其阴性对照载体.结论 成功构建和验证了siRNA真核表达载体,为下一步研究奠定了良好的基础.     

MRI of transgene expression: correlation to therapeutic gene expression

Magnetic resonance imaging (MRI) can provide high-resolution 3D maps of structural and functional information, yet its use of mapping in vivo gene expression has only recently been explored. A potential application for this technology is to noninvasively image transgene expression. The current study explores the latter using a nonregulatable internalizing engineered transferrin receptor (ETR) whose expression can be probed for with a superparamagnetic Tf-CLIO probe. Using an HSV-based amplicon vector system for transgene delivery, we demonstrate that: 1) ETR is a sensitive MR marker gene; 2) several transgenes can be efficiently expressed from a single amplicon; 3) expression of each transgene results in functional gene product; and 4) ETR gene expression correlates with expression of therapeutic genes when the latter are contained within the same amplicon. These data, taken together, suggest that MRI of ETR expression can serve as a surrogate for measuring therapeutic transgene expression.     

血液肿瘤基因表达和基因表达模式研究进展

基因表达失调与血液肿瘤的生物学特性、治疗反应和预后密切相关。近年迅速发展的转录组测序、单细胞转录组测序等技术为发现疾病诊疗相关的标志性基因和研究基因表达模式提供了强有力的工具。文章结合第62届美国血液学会(ASH)年会中的报道介绍相关研究进展。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

小鼠白介素-12真核表达质粒的构建及其表达

目的:构建能在真核细胞内稳定表达小鼠白介素-12(mIL-12)的质粒,为进一步研究mIL-12的免疫调节机制及其抗肿瘤作用奠定基础。方法:通过聚合酶链反应(PCR)扩增质粒pORF-mIL-12(Elas-ti),双酶切后将目的片段mIL-12连接到真核表达载体pcDNA3.1( )质粒上,mIL-12受pcDNA3.1( )中mCMV启动子驱动,将mIL-12全长转录至同一mRNA上,对重组质粒进行鉴定后将其转染小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)测其表达。结果:PCR成功扩增出mIL-12片段,PCR鉴定、酶切鉴定及测序均证实pcDNA3.1( )-mIL-12质粒构建成功,RT-PCR及ELISA证实重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL-12。结论:pcDNA3.1( )-mIL-12真核表达质粒构建成功并能在LLC细胞中稳定表达。     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

Prokaryotic expression of antibodies

Summary Maximizing the expression yields of recombinant whole antibodies and antibody fragments such as Fabs, single-chain Fvs and single-domain antibodies is highly desirable since it leads to lower production costs. Various eukaryotic and prokaryotic expression systems have been exploited to accommodate antibody expression but Escherichia coli systems have enjoyed popularity, in particular with respect to antibody fragments, because of their low cost and convenience. In many instances, product yields have been less than adequate and intrinsic and extrinsic variables have been investigated in an effort to improve yields. This review deals with various aspects of antibody expression in E. coli with a particular focus on single-domain antibodies. Both authors contributed equally to this work.     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.