模拟失重与骨组织的细胞凋亡

背景:空间骨丢失主要表现为成骨细胞、骨细胞活性减弱,而包括Fas蛋白在内的诸多因素可调节成骨细胞、骨细胞的增殖和分化并最终调控骨形成.目的:观察失重对骨组织中细胞凋亡的影响.方法:5周龄SPF级雄性SD大鼠36只,随机分为尾吊模拟失重组及对照组.建立大鼠尾吊模拟失重模型,建模后7,14,21 d,使用自动生化仪检测大鼠血清中钙、磷、碱性磷酸酶含量,放射免疫分析法测定骨钙素含量,原位细胞凋亡检测技术检测骨组织中细胞凋亡,免疫组化方法检测骨组织中Fas蛋白含量.结果与结论:尾吊模拟失重组大鼠血清中碱性磷酸酶、骨钙素含量均显著低于对照组(P＜0.05),但血钙、磷浓度均较相应对照组升高,骨组织中成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞凋亡指数、骨组织中Fas抗原含量均高于相应对照组(P＜0.01).说明尾部悬吊模拟失重增加骨组织中Fas蛋白表达,从而增加大鼠骨组织中成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞凋亡.     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

大鼠骨髓和脂肪来源间充质干细胞的成骨特性比较

背景:尽管骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞均具有向骨和软骨分化潜能,但终究带有各自来源组织的特点,那么是否意味着两者在非基因影响下成骨特性存在一定差异呢?目的:比较大鼠骨髓和脂肪来源的间充质干细胞在体外成骨分化中的特性区别。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2008-03在中国科学院昆明动物研究所国家级重点实验室完成。材料:6周龄和18周龄SD大鼠各2只,分别用于制备骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。方法:选取第3代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,按5×107L-1接种后各分为2组:诱导组加入含10-8mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养基1.5mL,未诱导组不加入成骨诱导培养基。主要观察指标:碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果,碱性磷酸酶和骨钙素定量分析结果。结果:成骨诱导7,14d,经诱导的骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞呈碱性磷酸酶阳性,有钙结节形成,未诱导组呈阴性。成骨诱导3,7,10d,未诱导组间比较碱性磷酸酶及骨钙素含量均基本相似(P>0.05);与未诱导组比较,脂肪间充质干细胞诱导组碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞诱导组升高幅度更为显著(P<0.001)。结论:大鼠骨髓来源间充质干细胞体外成骨性能强于脂肪来源间充质干细胞,在骨组织工程种子细胞的选用中应优先考虑前者。     

模拟失重对大鼠承重骨骨髓基质细胞数量及体外成骨能力的影响

背景:骨组织在特殊物理环境如失重环境下,代谢活动会发生显著的变化,而成骨细胞是骨代谢和骨形成的核心部分,其对重力环境的变化敏感。目的:观察模拟失重条件对大鼠股骨骨髓基质细胞数量体外成骨能力的影响,揭示骨丢失的机制。设计:随机配对,对照实验。单位:解放军第四军医大学航空航天医学系和口腔医学院病理科。材料:选用20只成年健康雄性SD大鼠。实验开始当日按体质量随机分为对照组和悬吊组,每组10只。碱性磷酸酶试剂盒由北京中生生物工程高技术公司生产。方法:实验于1999-11/2000-07在解放军第四军医大学口腔医学院病理科完成。将SD大鼠随机配对分为鼠尾悬吊组和对照组,每组10只。悬吊组大鼠做尾部悬吊28d,大鼠始终保持30°头低位及后肢自由悬垂不负重状态。对照组正常饲养。实验期满,取股骨,将股骨骨髓基质细胞进行原代和传代细胞培养。主要观察指标:采用细胞计数法和噻唑蓝法绘制原代和传代培养细胞的生长曲线,进行碱性磷酸酶活性及体外矿化小结形成量的检测。结果:①碱性磷酸酶活性:原代和传代培养悬吊组低于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。②钙化小结形成数:悬吊组少于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。③细胞生长:原代和传代股骨间充质细胞的生长曲线呈"S"形,悬吊组和对照组细胞倍增时间相近。④股骨骨髓基质细胞数:原代细胞培养系中,悬吊组比对照组约少50%(P<0.05)。结论:模拟失重条件下,大鼠骨髓基质细胞数明显减少,后肢承重骨成骨细胞数减少,体外成骨能力降低。     

骨髓间充质干细胞的旁分泌能影响成骨细胞生物学功能

背景：有研究表明骨髓间充质干细胞移植可促进骨缺损的修复,但受损组织的缺血、缺氧和炎症反应限制了其临床应用。 目的：观察骨髓间充质干细胞旁分泌作用对成骨细胞MG63增殖、迁徙、分化功能的影响 方法：Ficol-Paque 密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,制备骨髓间充质干细胞条件培养基培养成骨细胞 MG63。CCK-8法检测 MG63细胞增殖能力变化;细胞划痕法检测 MG63细胞迁徙能力变化;微板检测MG63细胞合成碱性磷酸酶能力的变化;Real-time PCR法检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨钙素基因表达量的变化;茜素红染色检测其矿化能力的变化。 结果与结论：骨髓间充质干细胞表型为 CD44、CD73、CD90表达强阳性,CD34表达阴性。与普通培养基（DMEM）相比,在骨髓间充质干细胞条件培养基作用下,MG63细胞的增殖速度明显加快;细胞划痕结果示其迁徙能力明显提高;诱导第4,7天后碱性磷酸酶基因表达量及蛋白合成量明显增多（P 〈;0.01）;Ⅰ型胶原及骨钙素基因表达量在诱导第4天后差异无显著性意义,诱导第7天后较对照组明显升高（P〈;0.05）;茜素红染色示骨髓间充质干细胞条件培养基诱导MG63细胞21 d后钙结节形成增多,矿化沉积作用增强。结果证实,骨髓间充质干细胞的旁分泌物质可以显著促进成骨细胞的增殖、迁徙、分化和矿化能力。     

成骨细胞共育环境下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨特性

背景:既往研究倾向于分析骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,以及分化过程中的影响因素,涉及成骨细胞对骨髓间充质干细胞分化影响的报道较少。目的:在与成骨细胞共培养的条件下,观察大鼠骨髓间充质干细胞的成骨特性。设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-01/08在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞室完成。材料:1d龄清洁级SD乳鼠10只,购自中山大学动物实验中心;3月龄SPF级SD大鼠6只,购自广州中医药大学动物实验中心。Transwell双层细胞培养板为Corning公司产品。方法:取SD乳鼠颅盖骨,胰蛋白酶 胶原酶多次消化分离培养扩增成骨细胞。取SD大鼠股骨和胫骨,用DMEM培养液冲洗骨髓腔,冲出液体过滤后按l:1滴加于淋巴细胞分离液上层,离心吸取液面交界处的单个核细胞,调整骨髓间充质干细胞浓度为1×105/cm,接种后胰蛋白酶消化扩增。Transwell双层细胞培养板的隔膜孔径为0.4μm,共培养组于培养上室接种成骨细胞,对照组培养上室未接种细胞,两组培养下室均于预处理的盖玻片上接种骨髓间充质干细胞,培养20d。主要观察指标:酶联免疫吸附法检测培养上清中骨形态发生蛋白2含量、骨碱性磷酸酶活性、骨钙素含量及钙化结节数。结果:与对照组比较,第15天共培养组上清中骨形态发生蛋白2的含量显著升高(P<0.01),第20天共培养组上清中骨碱性磷酸酶含量、骨钙素含量及钙化结节数均明显升高(P<0.05或0.01)。结论:体外构建的成骨细胞-骨髓间充质干细胞共培养模型一定程度上模拟了体内成骨环境,与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞成骨能力增强。     

人骨形态发生蛋白7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化性能的影响

背景骨组织工程中一个重要的研究内容就是如何保持并提高成骨细胞的体内外成骨能力,采用基因转移技术有可能为此问题的解决提供一种新的有效方法.目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的影响.设计以细胞为研究对象,分组对照,重复观察测量.对象实验2001-07/2003-07在南方医科大学附属南方医院创伤骨科实验室完成.新西兰大白兔4只由第一军医大学动物实验中心提供,雌雄不拘,体质量1.0～1.5 kg.方法构建人骨形态发生蛋白7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染骨髓间充质干细胞,免疫组织化学方法检测人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.主要观察指标主要结局①细胞增殖检测结果.②碱性磷酸酶检测结果.次要结局①转染骨髓间充质干细胞中人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.②细胞周期检测结果.结果经骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞免疫组织化学检测显示有人骨形态发生蛋白7的阳性表达.经人骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞增殖能力无明显改变(P＞0.05).经转染的骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶合成(294.592±86.567)nkat/L与转染空载体(155.231±86.567)nkat/L、未转染的骨髓间充质干细胞(160.866±91.585)nkat/L相比较差异有显著性意义(F=5.660,P＜0.05).结论经骨形态发生蛋白7基因转染的骨髓间充质干细胞能够合成表达外源骨形态发生蛋白7,人骨形态发生蛋白7基因转染能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,可用于以骨髓间充质干细胞为种子细胞的组织工程化骨组织的构建和进一步应用.     

尾悬吊大鼠骨髓基质干细胞体外分化能力及相关因子的表达

背景:尾悬吊模拟失重可造成骨丢失,骨髓基质干细胞增殖能力与分化方向也直接影响着骨髓腔内细胞水平骨代谢的平衡并最终改变骨的质量。目的:观察尾悬吊大鼠骨髓基质干细胞体外向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力及相关因子的表达。方法:SD大鼠随机分为正常对照组、尾悬吊组。取大鼠骨髓细胞体外培养,传1代后分别向成骨细胞和脂肪细胞两个方向诱导分化,成骨组第16天行碱性磷酸酶染色,第28天检测细胞外基质矿化能力,real-timePCR法检测第28天骨形态发生蛋白2mRNA的表达,成脂组第21天检测脂蛋白酯酶的比活性及mRNA的表达,第30天油红O法检测脂滴形成能力。结果及结论:尾悬吊组大鼠骨髓基质干细胞成骨分化早期碱性磷酸酶阳性细胞表达率显著高于对照组,但分化晚期骨形态发生蛋白2mRNA的表达水平及细胞外基质矿化能力较对照组显著降低;尾悬吊大鼠骨髓基质干细胞成脂分化过程中脂蛋白酯酶的表达、比活性及脂滴形成能力均显著高于对照组。说明尾悬吊可潜在刺激骨髓基质干细胞早期成骨分化能力,但显著抑制其矿化能力,从而抑制成骨,其机制可能与抑制骨形态发生蛋白2的表达有关;可显著促进骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化。尾悬吊造成大鼠骨量的丢失可能与其对骨髓基质干细胞分化方向的影响有关。     

微载体技术培养人骨髓间充质干细胞的成骨诱导实验

目的:以微载体技术成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞,建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。方法:实验于2002-12/2003-08在第三军医大学西南医院中心实验室完成。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞采用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,观察细胞增殖情况,作出生长曲线。分别于培养的第2,4,6,8,10,12,14d检测诱导细胞的碱性磷酸酶活性,并与普通成骨诱导方法进行对比。最后进行细胞碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原、骨钙素的免疫组织化学染色,观察培养细胞的成骨细胞表型的表达。结果:微载体法接种24h后约87%的人骨髓间充质干细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,约10～11d后细胞生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的约15～20倍。诱导细胞的碱性磷酸酶活性在培养的第12天达最大值,并表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素等成骨细胞表型。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性意义(P>0.05)。结论:应用微载体可以成功进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导扩增,可以满足骨组织工程量和质的需要。     

电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景:目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法.但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚.目的:尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓闻充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从患者髂后上棘抽取骨髓.分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养.当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中.实验随机分为3组:空白对照组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组:每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%-70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组:加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培葬液,电针刺激.采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d.相差倒置显微镜观察细胞形态变化:茜索红染色结果:细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性:RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达:Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达.结果与结论:①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5-7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象:电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状.②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到育矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应.③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P<0.05):且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P<0.05),但28 d时差异无显著性意义(P>0.05).④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P<0.05).提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.