猪主动脉脱细胞血管基质制备及保存

目的探讨脱细胞血管基质的制备和保存方法。方法采用酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理猪胸主动脉制备脱细胞血管基质,标本行苏木精-伊红染色,大体、光镜及扫描电镜、透射电镜观察。并将标本放入液氮中保存,于保存1、2、3月分别取标本用20g/L戊二醛固定,扫描电镜观察。结果经该法处理的猪血管细胞全部脱除,胶原纤维、弹性纤维无断裂,细胞外基质保持完好。液氮保存后1、2、3月扫描电镜观察与新鲜标本无明显差别。结论酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法是制备脱细胞血管基质的较好方法,制得的脱细胞血管基质可放入液氮中保存。     

液氮保存时间对脱细胞血管基质支架材料组织形态及力学特性的影响

背景:血管脱细胞组织基质作为天然生物支架材料的制备与临床应用具有一定的时差,保存条件对其影响逐渐收到人们重视.目的:拟观察不同液氮保存时间对脱细胞血管基质支架材料组织形态及力学特性的影响.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2007-08/2008-05在青岛市市立医院心脏外科实验室完成.材料:健康新西兰兔10只,体质量550～600 g,用于制备脱细胞血管基质.方法:采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂法处理兔胸主动脉制备脱细胞血管基质.根据液氮保存时间的不同将制取的血管随机分为液氮1月组,液氮2月组和液氮3月组;另设新鲜组:未用液氮保存而作为对照.主要观察指标:苏木精-伊红染色、扫描电镜观察各组脱细胞血管基质形态变化,并作力学测试,包括Lagrange应变、Lagrange应力、伸长比和极限应力.结果:苏木精-伊红染色可见新鲜组血管脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维保持原来的形态和结构,呈网状排列,细胞已基本去除.液氮保存组光镜下见与新鲜组无明显差异.扫描电镜见新鲜组血管脱细胞组织基质的纤维结构完整,胶原纤维无断裂,为网状和多孔状,孔径为(100～150)×(10～20)μ m.液氮保存组胶原纤维结构完整,呈网状捧列,胶原纤维无断裂现象,孔径与新鲜组无明显差异.各组力学指标相比,差异无显著性意义(P>0.05).结论:不同液氮保存时间对脱细胞血管基质的形态学、组织学以及力学特性方面没有明显影响.     

新型天然血管支架:猪胸主动脉脱细胞血管基质的制备

目的研究用酶-化学除垢剂联合法制备猪胸主动脉脱细胞血管。方法猪的新鲜胸主动脉经消毒后,于离心管中经过胰蛋白酶+EDTA,曲拉通X-100溶液作用后取标本。血管体积与各作用溶液体积比为3∶7。标本作苏木素—伊红、弹力纤维染色,大体、光镜及扫描电镜观察。结果胸主动脉中的细胞成分被除去,留下成分主要包括胶原纤维、弹性蛋白等。结论酶-化学除垢剂联合法可将猪胸主动脉细胞成分除去。胰蛋白酶,曲拉通X-100是制备血管脱细胞基质(ACTM)的良好试剂。     

新型天然血管支架：猪胸主动脉脱细胞血管基质的制备

目的 研究用酶－化学除垢剂联合法制备猪胸主动脉脱细胞血管。方法 猪的新鲜胸主动脉经消毒后，于离心管中经过胰蛋白酶＋EDTA，曲拉通X－100溶液作用后取标本。血管体积与各作用溶液体积比为3：7。标本作苏木素－伊红，弹力纤维染色，大体，光镜及扫描电镜观察。结果 胸主动脉中的细胞成分被除去，留下成分主要包括胶原纤维，弹性蛋白等。结论 酶－化学除垢剂联合法可将猪胸主动脉细胞成分除去。胰蛋白酶，曲拉通X－100是制备血管脱细胞基质（ACTM）的良好试剂。     

脱细胞血管基质材料同种异体移植10个月研究

背景：异体血管移植之所以至今未能在临床应用,关键是异体组织抗原性排斥反应的难题未能得到解决。目的：制备动脉脱细胞血管基质,探讨脱细胞血管异体移植的可行性。方法：采用不同去垢剂（1%TritonX-100、1%SDS）多步骤对犬血管进行脱细胞处理,通过组织学和力学观测,建立犬动脉血管脱细胞的方法;并进行脱细胞血管的异体移植。结果与结论：经胰蛋白酶、低渗溶液和去垢剂TritonX-100、SDS等多步骤处理,犬颈总动脉血管的细胞基本脱除,细胞外基质保持完好,血管的弹性、韧性保存较好;用该法制备的犬颈总动脉（直径约4.0mm）进行异体移植,经10个月观察,4/5通畅。提示经去垢剂TritonX-100、SDS加低渗溶液、胰蛋白酶和蛋白酶抑制剂处理的多步法,可以脱除血管的细胞成分,细胞外基质和力学特性保持完好,是一种较好的方法;用该法制备的犬颈总动脉可以直接进行异体移植,是一可选择的血管移植材料。     

应用猪主动脉脱细胞基质制备新型组织工程血管支架:生物相容性及力学性能评价

背景:组织工程血管构建的关键依赖于理想的支架.猪血管作为组织工程血管构建材料已有广泛应用,但其较高的免疫原性及较差的力学强度限制了该材料作为组织工程支架的应用.目的:应用猪主动脉脱细胞基质制备一种新的具有良好机械性能及生物相容性的组织工程血管支架.方法:对猪主动脉进行脱细胞处理和热交联改性制备脱细胞血管基质支架,采用苏木精-伊红染色及生物力学分析评估其脱细胞效果及血管基质的力学性能.将人脐静脉血管内皮细胞接种于脱细胞血管基质支架中进行体外培养,评估其生物相容性.结果与结论:用1%的Triton X-100溶液处理猪主动脉84 h可完全脱除血管细胞,同时不破坏血管基质结构;经真空下120 ℃热交联处理12 h,脱细胞基质的拉伸断裂强度得到明显提高,达到1.70 MPa.在该改性血管基质支架上接种人脐带静脉内皮细胞体外培养7 d,扫描电镜显示内皮细胞呈现典型的血管内皮层状结构.表明猪主动脉经过脱细胞处理能够维持血管基质完整,冷冻干燥和真空热交联处理可有效提高其拉伸强度,且对血管内皮细胞具有良好的相容性.     

不同浓度细胞种植脱细胞血管基质上构建组织工程血管

背景:前期研究表明制备的脱细胞血管基质适合平滑肌细胞和内皮祖细胞生长,但是共培养模型中细胞接种密度对血管基质上细胞覆盖率的影响尚不清楚.目的:观察不同浓度度细胞种植在脱细胞血管基质上的生长情况.方法:采用两步法进行细胞种植,先将不同细胞浓度血管平滑肌细胞种植在脱细胞血管基质上,培养3 d后再将不同浓度内皮祖细胞接种在平滑肌细胞-血管基质复合体上,构建片状组织工程材料,分别在内皮祖细胞种植后3 d、1周时间段获取标本,扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况.结果与结论:血管平滑肌细胞和内皮祖细胞在脱细胞基质表面生长良好.不同浓度细胞在基质上的排布不同;提高接种的浓度有利于在材料表面快速形成致密的细胞层.提示采用两步法以合适的浓度种植细胞于脱细胞基质上,可以构建组织工程血管.     

脱细胞支架复合兔骨髓间充质干细胞构建组织工程血管

背景:目前临床使用的小口径(<6 mm)人工血管因生物相容性差、远期通畅率低,效果并不理想.因此,学术界一直致力于寻找具有正常血管生物学功能的血管代用品,组织工程血管的构建与功能研究已成为目前热门研究课题.目的:将兔骨髓间充质干细胞与脱细-胞血管支架动态复合培养体外构建组织工程血管,通过体内移植实验,探讨该组织工程血管的组织相容性及通畅率.设计、时间及地点:随机对照实验,细胞学、组织病理学观察,于2006-01/2008-06在南京大学医学院附属鼓楼医院实验室完成.材料:通过去污剂-酶消化法制备兔腹主动脉脱细胞支架;采用密度梯度离心法结合贴壁分离培养法,分离扩增兔骨髓间充质干细胞,将扩增后的干细胞静态种植于脱细胞支架后置于生物反应器中动态培养构建组织工程血管.方法:60只兔随机均分为3组,剪取一段腹主动脉长约1.0 cm,再将移植血管以8/0聚丙烯线间断外翻吻合到腹主动脉上.组织工程血管组:受体为对应抽取骨髓干细胞的实验兔,以组织工程血管为移植血管;脱细胞血管支架组:以脱细胞处理的同种异体腹主动脉为移植血管;同种异体血管组:以同种异体新鲜腹主动脉作为移植血管.主要观察指标:对培养的骨髓间充质干细胞进行免疫组化鉴定;血管移植后3个月行数字减影血管造影、病理切片、扫描电镜等观察移植效果.结果:兔骨髓间充质干细胞在体外培养8 d后形成漩涡状排列,免疫组化结果符合间充质干细胞表型特征:将间充质干细胞与脱细胞支架置于生物反应器培养12 d后,种子细胞在血管腔内黏附生长;血管移植3个月后,组织工程血管组、脱细胞血管支架组通畅率分别为90%,80%,均优于同种异体血管组(25%).移植3个月后苏木精一伊红染色及扫描电镜结果显示,组织工程血管组形成清晰的内、中、外膜3层结构,形态接近正常动脉,内皮细胞覆盖完整;脱细胞血管支架组血管内表面内皮细胞覆盖不完整,伴有附擘血栓形成,内膜轻度增生,伴炎性细胞浸润:同种异体血管组内膜极度增厚、坏死,管腔明显狭窄,伴不同程度的血栓机化.结论:将兔骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管支架上,可获得一种具有良好生物相容性和通畅率的生物人工血管.     

脱细胞血管基质与血管平滑肌细胞的体外相容性

目的:酶-化学除垢剂制备脱细胞血管基质,检测其与平滑肌细胞的相容性,探讨其作为组织工程支架材料的可行性。方法:实验于2003-12/2005-12在哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心完成。①脱细胞血管基质制备:在37℃水浴振荡条件下,犬总动脉先后用1g/L胰蛋白酶 0.2g/L乙二胺四乙酸钠和1.0%TritonX-100进行脱细胞处理24h和176h,充分漂洗,冷冻干燥后备用。②平滑肌细胞的提取:应用组织块贴壁法体外培养扩增犬隐静脉的平滑肌细胞。③四甲基偶氮唑盐法测定脱细胞血管基质浸提液对平滑肌细胞的毒性:设浸提原液、75%、50%和25%浸提液组,阴性对照组(DMEM 体积分数为0.1的胎牛血清培养液)。以阴性对照组的吸光度作为100%细胞增殖率,增殖百分率(P%)=犤实验组A值/阴性对照组A值犦×100%,按ISO和医学生物材料标准评定材料毒性。④急性毒性试验:取成年大鼠8只,将备用脱细胞血管基质研磨成粉末,生理盐水配成2g/L的混悬液,无菌条件下向大鼠腹腔内注入1mL脱细胞血管基质混悬液,观察72h,记录动物有无死亡及不良反应。⑤亚急性毒性试验:取成年大鼠12只,随机分成2组。实验组用脱细胞血管基质混悬液灌胃,剂量为500mg/kg质量,隔日1次,共10次;对照组给等量生理盐水灌胃。实验期间观察记录体质量变化及动物活动情况。21d取血检查血常规。⑥溶血试验:取抗凝兔血8mL,加入生理盐水10mL,稀释备用。取脱细胞血管基质粉末,加生理盐水中,再加入稀释兔血离心后取上清测定545nm处的吸光度。阴性对照为生理盐水10mL加入稀释兔血;阳性对照为蒸馏水加入稀释兔血。溶血率=犤(试验材料的吸光度-阴性对照的吸光度)/(阳性对照的吸光度-阴性对照的吸光度)犦×100%。⑦凝血试验:血库健康献血员新鲜血浆,用自动血液凝固测定仪进行凝血酶原凝固试验、测定部分凝血活酶凝固时间、凝血酶凝固时间和纤维蛋白原。取血浆2mL加入脱细胞血管基质粉100mg,混合后再测定上述指标。结果:①酶-化学除垢剂能使犬总动脉细胞几乎完全脱落,使基质纤维的三维结构变得疏松。苏木精-伊红、胶原染色和弹力纤维染色显示脱细胞血管基质无细胞残留,主要成分为胶原和弹力纤维。②动物实验表明材料无急性、亚急性毒性。体外实验脱细胞血管基质的溶血率为1.6%,符合医用生物材料生物性能测试所提出的溶血率<5%标准。材料混合前后,血浆中凝血酶原凝固试验、部分凝血活酶时间、凝血酶凝固时间和纤维蛋白原4项指标检测结果无明显变化,说明材料不引起凝血功能的改变。③四甲基偶氮唑盐显示75%脱细胞血管基质浸提液培养平滑肌细胞1,3和5d后,细胞增殖率均大于95%,材料毒性为0或1级。结论:TritonX-100和胰蛋白酶制备的脱细胞基质具有良好的生物相容性,能与异体犬平滑肌细胞结合到一起,并在体外生成血管移植物。     

新鲜制备及中长期保存的羊膜细胞外基质结构特征

目的:制备并保存羊膜细胞外基质,观察新鲜制备及中长期保存的羊膜细胞外基质的结构特点。方法:实验于2004-01/12在赣南医学院科研中心完成。①采用目前国际公认的羊膜制备与保存方法,制备并保存羊膜细胞外基质。②取新鲜制备的羊膜细胞外基质、中期保存的羊膜细胞外基质(4℃恒温冰箱储存备用1周)、长期保存的羊膜细胞外基质(-80℃超低温冰箱中储存备用3个月),通过大体、光镜、透射电镜和扫描电镜观察其形态及结构特点。结果:①羊膜细胞外基质大体观察:新鲜制备及中、长期保存的羊膜细胞外基质均为透明、无色、有一定韧性生物膜,其厚度约0.02～0.4mm。②光镜观察结果:新鲜制备和经中、长期保存的羊膜细胞外基质可见2层结构:基底膜厚薄不均,无细胞结构;致密层由结缔组织组成。新鲜羊膜与中期保存的羊膜细胞外基质致密层较长期保存的羊膜细胞外基质略厚;新鲜羊膜细胞外基质可见少量成纤维细胞,而中、长期保存羊膜细胞外基质的成纤维细胞较少见。③透射及扫描电镜观察结果:新鲜制备与中期保存的羊膜细胞外基质两者的基底膜厚约0.1～0.2μm,致密层厚约30～400μm,其主要结构由胶原纤维、网状纤维和基质组成,偶见成纤维细胞;长期保存的羊膜细胞外基质的基底膜厚约0.2～0.3μm,致密层厚约20～400μm,其中致密层的主要成分为胶原纤维和网状纤维,无细胞结构;三者的胶原原纤维结构完全一致。结论:羊膜经过组织工程技术处理后去除其上皮细胞或使上皮细胞失活,保留基底膜与致密层,形成羊膜细胞外基质。羊膜细胞外基质主要成分是胶原纤维和网状纤维,因其免疫原性低于羊膜并具有抗炎性,是一种特殊的细胞外基质,作为一种细胞黏附的基膜和生物支架,具有广阔的研究和应用前景。因此羊膜细胞外基质可作为体外细胞培养的生物载体而应用于基础研究。