胰腺癌细胞株耐药与凋亡相关基因的改变

目的探讨凋亡相关基因的改变与胰腺癌细胞耐药的关系。方法利用含有18000条人类基因的cDNA基因芯片对人胰腺癌细胞株SW1990及其耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的差异表达基因进行筛选。结果人胰腺癌细胞株SW1990与耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的共同差异表达基因有170条,其中6条与细胞凋亡相关。结论凋亡相关基因hSiah2、TIA1、CDC2、PDCD2、MAPK6及MAP4K3可能参与了胰腺癌耐药过程的发生,可能成为新的胰腺癌耐药相关基因。     

葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义

目的探讨葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase,GCS）基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义。方法体外培养人胰腺癌细胞SW1990和其耐药亚株SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM,以细胞活性测定（CCK-8法）检测耐药亚株的耐药指数,相对定量荧光实时PCR（RT—PCR）法检测GCS mRNA的表达,免疫印迹法检测GCS蛋白表达水平。结果与亲本株相比,SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM的耐药指数分别为339．7、11．9、56．6。RT—PCR和免疫印迹检测结果显示亲本株和耐药亚株均有GCS mRNA和蛋白的表达,GCS mRNA在3株耐药亚株中的表达均比亲本株有增高趋势,且SW1990／ADM、SW1990／GEM的GCS蛋白表达水平较亲本株升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论GCS基因在人胰腺癌细胞株SW1990和其3株耐药亚株中表达阳性,GCS蛋白在SW1990／ADM、SW1990／GEM中呈高表达,表明GCS可能参与胰腺癌耐药株细胞对ADM、GEM的耐药。     

耐药胰腺癌细胞株对放射敏感性影响的初步探讨

目的初步探讨耐药胰腺癌细胞株的耐药性对其放射敏感性的影响。方法选取人胰腺癌细胞株SW1990经氟尿嘧啶（5-FU）、阿霉素和吉西他滨诱导后建立三株耐药细胞亚株（SW1990／FIL1、SW1990／ADM、SW1990／GZ）,通过流式细胞仪及直线加速器照射后进行细胞周期及放射生物学相关参数检测。结果细胞周期分析显示,与亲本株SW1990相比,SW1990／FU与SW1990／Gz的Go／G。期比例增高,G2／M期比例明显降低;SW1990／ADM各细胞周期百分比变化不大。集落实验结果表明,与亲本株SW1990相比,SW1990／FU及SW1990／GZ的存活分数（sir2）分别升高26．9％（P＜0．01）和14．4％（P＜0．01）,差异有统计学意义;SW1990／ADM的sir2升高1．1％,差异不明显。结论耐药胰腺癌细胞株的耐药性对其放射敏感性具有一定影响,胰腺癌耐药细胞株放射敏感周期G2／M期比例降低,从而导致其放射敏感性降低,耐放射性增加。     

胰腺癌耐药细胞株SW1990/Fu产生获得性耐药机制的研究

目的探讨胰腺癌耐药细胞株SW1990/Fu产生获得性耐药的可能机制。方法以体外诱导建立的人胰腺癌耐药株SW1990/Fu为模型,通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学(ICC)方法测定耐药相关基因在SW1990/Fu产生获得性耐药前后的变化;罗丹明外排实验检测SW1990/Fu细胞膜上的P-gp泵功能。结果RT-PCR结果显示多药耐药基因1(MDR)和肺耐药相关蛋白基因(LRP)在SW1990/Fu中的表达率分别为0.97±0.23和0.95±0.34,而在SW1990中的表达率仅分别为0.67±0.19和0.53±0.16,两者差异有统计学意义(P<0.05);多药耐药相关基因(MRP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST-π)在2株细胞中的表达水平无明显变化。ICC与RT-PCR的结果一致。在罗丹明浓度为0.5mg/L时,只检测到(11.4±2.5)%的SW1990/Fu细胞内有荧光染科积蓄,在亲本细胞中罗丹明阳性细胞为(57.9±5.4)%,而在P-gp阴性的HL60细胞中,(99.5±3.3)%的细胞内存在罗丹明的积聚。当罗丹明浓度增加时,其在SW1990/Fu细胞内的积聚也明显增加。结论耐药基因MDR1和LRP表达增强可能是胰腺癌耐药细胞株SW1990/Fu产生获得性耐药的主要机制。     

多药耐药相关基因及其蛋白在介导胰腺癌细胞原发性耐药中的作用及调控

目的 检测多药耐药相关基因（MDR1）及其蛋白（P-gP）在胰腺癌细胞株的表达,初步探讨胰腺癌发生先天性耐药的机理。方法 选择8株人胰腺癌细胞株,采用RT-PCR方法检测MDR1mRNA在胰腺癌细胞中的表达;通过免疫细胞化学方法检测P-gP的表达;以流式细胞仪检测胰腺癌细胞对罗丹明的外排情况,评价P-gP泵功能;最后通过P-gP抑制物维拉帕米与化疗药物联合应用,检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MDR1mRNA在胰腺癌细胞株SW1990中的表达最高,除PCT-2未检测到MDR1的表达外,其余6株细胞均有MDR1的微弱表达;免疫细胞化学染色结果证实P-gP在SW1990中的表达明显高于其他细胞株。57．9％±5．4％的SW1990细胞内有罗丹明蓄积,而在P-gP阴性对照细胞中,99．5％±3．3％的细胞内存在罗丹明的积聚,两者差异有统计学意义（P〈0．05）。P-gP抑制物维拉帕米与阿霉素或表阿霉素联合应用时可以部分逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。结论 MDR1及P-gP在人胰腺癌细胞中存在一定量的表达;维拉帕米联合阿霉素可以明显抑制P-gP阳性细胞的生长。     

人胰腺癌细胞STAT3下游耐药相关基因的初步筛选

目的利用小分子干扰RNA(siRNA)和基因芯片技术初步筛选人胰腺癌细胞信号转导及转入激活因子3(STAT3)下游耐药相关基因,为探索STAT3调控耐药机制提供依据。方法利用基因芯片技术比较人胰腺癌细胞SW1990与siRNA沉默STAT3后SW1990细胞中基因表达的差异,初步筛选STAT3下游耐药相关基因。结果按差异显著性标准从47 000条基因(代表38 500个明晰的基因)中筛选出具有表达差异的基因共有982条(2.55%),其中上调表达2倍的基因有592条,下调表达2倍的基因有390条。与耐药相关基因有:显著上调的拓扑异构酶IIα(TOPOIIα)、肿瘤坏死因子凋亡诱导相关配体(TRAIL);显著下调的富半胱氨酸61(CYR61),Ras肿瘤基因家族成员(RAP1A),bcl-2相关抗凋亡基因(BAG1),囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)。结论胰腺癌耐药是一个多基因、多通路相互作用的结果。应用siRNA技术沉默STAT3基因后,有6条耐药相关基因发生改变。为进一步研究STAT3与胰腺癌耐药的关系提供新的线索,也为胰腺癌的治疗提供新的思路。     

耐药相关基因拓扑异构酶-Ⅱα在人胰腺癌细胞株中的表达

目的：探讨耐药相关基因拓扑异构酶－Ⅱα（TOPO－Ⅱα）在人胰腺癌细胞株中的表达。方法：通过逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）和Western-blot方法测定6株人胰腺癌细胞株（SW1990、Capan-2、AsPC-1、MiAPaCa-2、PANC－1、P3）中的TOPO－Ⅱα在基因和蛋白水平上的表达。结果：（1）TOPO－Ⅱα基因的表达以SW1990最高，PANC－1最低，与其他细胞株相比均具有显著性差异（P＜0．05）；（2）TOPO－Ⅱα蛋白的表达以SW1990、Capan-2较高，AsPC-1较低。SW1990，Capan-2与其余4株之间存在着显著性差异（P＜0．05），而SW1990与Capan-2之间无显著性差异（P＞0．05）；AsPC-1、MiAPaCa-2、PANC－1、P3之间均无显著性差异（P＞0．05）。结论：胰腺癌细胞对TOPO－Ⅱα抑制剂的低敏感性与TOPO－Ⅱα蛋白的低水平表达有关，TOPO－Ⅱα可能参与了胰腺癌对化疗的耐药。     

Hedgehog信号通路相关蛋白在人胰腺癌SW1990耐药株中的表达及意义

目的:探讨Hedgehog信号通路蛋白在人胰腺癌吉西他滨耐药细胞株SW1990中的表达,为克服胰腺癌获得性耐药提供实验基础。方法:采用浓度梯度递增法建立人胰腺癌SW1990耐药株,采用噻唑蓝法测定SW1990亲代与耐药细胞IC50。实时荧光定量PCR检测亲代与耐药细胞mRNA中hedgehog信号通路成员Shh、SMO、Gli-1的表达差异。Western印迹法检测亲代与耐药细胞中上述蛋白质的表达。结果:人胰腺癌耐药株SW1990的IC50从亲代的(3.1±0.2)μmol/L提高到(232.2±12.3)μmol/L。荧光定量PCR结果显示耐药株中Shh、Gli-1的表达提高了(12.07±1.71)倍和(4.15±0.42)倍。亲代SW1990中未检测到SMO表达,而耐药细胞中却可以检测到SMO的表达。Western印迹结果同样显示,人胰腺癌SW1990耐药细胞株中高表达上述蛋白质。结论:人胰腺癌耐药株中高表达部分hedgehog信号通路蛋白。针对hedgehog信号通路的靶向治疗可能为克服胰腺癌耐药提供新的理论基础。     

胰腺癌阿霉素耐药细胞株SW1990/ADM的建立及其耐药机理研究

目的　建立人胰腺癌阿霉素 (ADM )耐药细胞株SW 1990 /ADM ,探讨其耐药机理。方法　采用ADM体外浓度梯度倍增法诱导培养人胰腺癌细胞株SW 1990 10个月 ,获得耐药细胞株SW 1990 /ADM ,脱药培养 2个月后检测其生物学性状、药物敏感性及多药耐药基因mdr1的功能及表达情况。结果　与亲本细胞株SW 1990相比 ,SW1990 /ADM在形态学上发生了一系列变化 ;对包括ADM在内的多种化疗药物均表现出一定的耐药性 ,其对ADM、丝裂霉素、氟尿嘧啶和健择的耐药指数分别达到 4 9.6 0、7.2 5、3.80和 1.2 5 ;其mdr1mRNA的表达亦明显高于亲本细胞株SW 1990 (P<0 .0 1)。结论　体外浓度梯度倍增法可建立稳定传代的人胰腺癌耐药细胞株SW1990 /ADM。其耐药性与mdr1的表达呈正相关。     

吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株的建立及其与肿瘤干细胞的相关性研究

目的 建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ,并探讨SW1990/GZ和胰腺癌肿瘤干细胞的相关性.方法 应用间歇浓度梯度倍增法建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ;倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法计算耐药指数(RI);荧光定量PCR检测ABCB1、ABCC1及ABCG2基因的表达水平;裸鼠皮下种植瘤试验观察SW1990和SW1990/GZ的成瘤能力;流式细胞仪通过侧群细胞(SP)法和表面特异抗原标记法(CIM4+CD24+)检测肿瘤干细胞含量.结果 在形态学上,SW1990/GZ较SW1990发生明显改变;SW1990/GZ的耐药指数是亲代SW1990的77.2倍;与亲代SW1990相比,耐药株SW1990/GZ中ABCB1、ABCC1及ABCG2的表达水平明显增高(P<0.01),裸鼠皮下成瘤能力增强(P<0.01);耐药株SW1990/GZ中SP细胞比例为(11.0±1.0)%,亲代SW1990中SP细胞比例为(4.6±0.9)%,CD44+CD24+细胞在两者中的比例分别为(8.7±0.8)%和(1.1±0.4)%(P<0.01).结论 吉西他滨耐药胰腺癌细胞株SW1990/GZ能高效富集胰腺癌肿瘤干细胞,CD44与胰腺癌获得性耐药关系密切,可能为克服胰腺癌获得性耐药提供新的治疗靶点.     

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1与胰腺癌细胞获得性耐药的关系

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸酶1（MKP-1）在介导胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu产生获得性耐药过程中的可能机制。方法 采用Northern印迹杂交和Western蛋白免疫印迹杂交方法,检测MKP-1在体外诱导建立的人胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu、亲本细胞株SWl990和胰腺癌细胞株MiaPaCa-2中的表达,分析MKP-1在SW1990／Fu产生获得性耐药前后的变化。结果 Northern印迹杂交结果显示,在SWl990／Fu、SWl990和MiaPaCa~细胞株中均检测到2400bp的MKP-1mRNA,MKP-1在SWl990／Fu的表达水平明显低于SWl990和MiaPaCa-2。在蛋白水平上,Western蛋白免疫印迹杂交结果也表明,与SWl990和MiaPaCa4相比,MKP-1蛋白在SWl990／Fu细胞中的表达水平明显降低。结论 MAPK家族的关键调节酶MKP-1可能参与SWl990／Fu获得性耐药的产生,推测细胞信号转导系统的改变可能是导致胰腺癌细胞产生获得性耐药的机制之一。     

利用新型载体运转MDR1 siRNA以逆转胰腺癌化疗耐药性的研究

目的:以新型载体运转MDR1 siRNA导入胰腺癌细胞株后,观察其多药物耐药基因(MDR1)的表达及其对胰腺癌化疗耐药性的影响。方法:采用RNA干扰技术,构建可用于包装成自我复制rAAV病毒载体的质粒,以运转不同长度的MDR1 siRNA。采用实时PCR检测MDR1 mRNA的表达,Western印迹法检测总P-糖基化蛋白(P-gp)的表达水平,用流式细胞仪检测细胞表面的P-gp表达,并从不同层面检测胰腺癌细胞株P-gp表达的抑制率,从而筛选出最佳的质粒载体。采用MTT检测IC50值,进行各载体逆转胰腺癌细胞株化疗耐药性的研究。结果:拟用于构建自我复制rAAV病毒载体的25-mer MDR1 siRNA质粒能有效地将目的基因MDR1 siRNA导入胰腺癌细胞株,并予稳定的表达,发挥作用。导入胰腺癌细胞株的MDR1 siRNA能有效地在mRNA水平上沉默MDR1基因,显著抑制其表达,使其蛋白产物P-gp的表达明显减少,及其在细胞膜上的数量显著降低。结果能有效、显著地逆转胰腺癌细胞株的化疗耐药性,转染前SW1990/ADM细胞对ADM的IC50值约是转染后的50倍。结论:采用可用于构建新型sc-rAAV载体的质粒作为投递siRNA的工具,并选择MDR1为研究靶点,通过实验证实该策略在逆转胰腺癌化疗耐药性中的有效性。     

siRNA特异性靶向沉默Livin基因对人乳腺癌MCF－7多药耐药细胞耐药性的研究

目的研究siRNA特异性靶向沉默Livin基因对人乳腺癌MCF－7多药耐药细胞耐药性的影响。 方法采用ADM低浓度梯度递增结合大剂量间歇诱导方法建立5－FU诱导的多药耐药细胞系,采用ATP生物荧光肿瘤体外药物检测技术(ATP－TCA)法检测细胞耐药性,采用免疫组织化学方法检测Livin蛋白在MCF－7耐药细胞株系中的表达情况,采用Livin SiRNA联合表柔吡星、5－氟尿嘧啶、多西他赛、健择诱导乳腺癌MDR细胞的凋亡。采用SPSS 20.0处理数据,耐药情况、细胞的凋亡情况用( ±s)表示,采用t检验,当P<0.05时差异具有统计学意义。 结果结果显示,MCF－7多药耐药细胞存在多药耐药问题;联合组MCF－7增敏(19.48±12.00) μM、MCF－7/MDR增敏(35.62±2.37) μM,与转染组与加药组对比,数据差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论siRNA特异性靶向沉默Livin基因可增强人乳腺癌MCF－7多药耐药细胞的敏感性,提高细胞凋亡率。     

Modulation of MDR-1 gene by MIF and GSTpi with drug resistance generation in hormone independent prostate cancer

The expression of MIF and GSTpi were upregulated in prostate cancer cells with mulitdrug resistant phenotype. The aim of this study is to determine the relationship between these genes and multidrug resistance (mdr-1) gene in acquired multidrug resistance of prostate cancer. The expression of MIF, GSTpi and gp-170 in multidrug resistant (MDR) subline or native cells were determined using flow cytometry and western blotting. The mRNA level of various genes was analyzed with RT-PCR method. The chemosensitivity of tumor cells and stable transfectants to paclitaxel was measured using MTT (tetrazolium bromide) assay. The protein levels of MIF, GSTpi and gp-170 increased in MDR sublines of prostate cancer when compared with their parental cells. The MIF and GSTpi stable transfectants expressed higher MIF and GSTpi protein levels than their parental cells in western blotting analysis, respectively. The expression of mdr-1 gene and the production of pg-170 were also increased in either MIF or GSTpi stable transfectants when compared with vector control by using RT-PCR and flow cytometric analysis. The MTT results demonstrated that the increased chemoresistance was correlated with the increased production of gp-170 protein in either MIF or GSTpi transfectants. The upregulation of MIF and GSTpi during the development of acquired drug resistance of hormone independent prostate cancer may simultaneously and partially modulate the activation of gp-170.